CN106908429B - 一种检测谷胱甘肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种基于可控释放技术的谷胱甘肽的检测方法，该方法可用于重大疾病的早期诊断与治疗、食品、药品、生命科学等领域。本发明提出的方法是利用基于可控释放技术的荧光传感器进行谷胱甘肽的检测，具体是将金纳米笼与谷胱甘肽识别探针相结合，通过静电组装作用在金纳米笼表面形成具有可生物响应的分子门，利用识别探针与靶分子之间发生的特异性的分子识别反应，导致识别探针从金纳米笼表面脱离，从而使分子门被打开，金纳米笼内的荧光分子得以释放，实现了荧光信号的增强与检测。该方法使谷胱甘肽的检测灵敏度得到显著提高，可实现对谷胱甘肽的高灵敏、高选择性检测。

Description

一种检测谷胱甘肽的方法
技术领域
本发明涉及一种检测谷胱甘肽(GSH)的方法，具体涉及一种可在医疗、生命科学、食品、医药等诸多领域应用的用于检测GSH的方法。
背景技术
谷胱甘肽(GSH)是一种由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸构成的三肽化合物，来自于半胱氨酸残基中的巯基使它成为具有重要意义的生物活性物质。GSH广泛存在于动、植物细胞，是细胞内含量最丰富的非蛋白巯基物。GSH在人体各种组织及细胞中的含量以及与各种疾病的关系备受关注，至今一直是广泛研究的热点。GSH参与生物体内多种生化反应，具有非常重要的生理作用，如氨基酸的转运，蛋白、核酸的合成，抗氧化作用等等。作为机体中广泛存在的重要抗氧化剂，GSH在防卫机体免受自由基伤害、抗肿瘤及抗衰老等方面发挥了重要作用。特别是GSH所具有的抗突变作用，有利于抑制诱发癌症基因的突变，对肝癌、肺癌、皮肤癌、前列腺癌等多种癌细胞病变有一定的抑制作用，据称，GSH是人体内最有效的抗癌物。
生物体内细胞及组织当中GSH及相关巯基物浓度的改变与多种重大疾病相关联。因此，GSH的含量是衡量机体内抗氧化能力大小的重要指标。报道称，如果GSH在体内的含量低于正常水平，将导致像糖尿病、酒精肝中毒、白内障、癌症、帕金森综合征、心血管疾病、阿耳茨海默氏病(Alzheimer，早老性痴呆)等一系列病症在人体的发生。因此，常规诊断利用GSH及相关巯基物的浓度检测作为某些疾病诊断的重要依据。由此可见，建立高效、灵敏、经济的GSH及相关巯基化合物的检测方法不仅有助于重大疾病的临床诊断与治疗，同时，对于生物、医学、生命科学、食品、医药等诸多领域的研究与应用均具有重要意义。
目前，发展了多种测定GSH的检测技术，包括化学的、仪器的，诸如紫外/可见分光光度法、荧光法、酶循环法、电化学法、化学发光法、电致化学发光法、高效液相色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法等多种方法，每种方法在灵敏度、选择性、稳定性、检测时间、成本、仪器等方面都各有其优缺点，目前还没有一种既快速、稳定、特异，又十分灵敏、经济的测定方法。影响了它们在高通量的常规临床检测及生物研究中的应用。根据GSH检测技术的发展趋势来看，迫切需要提高检测灵敏度以实现微量样品的高灵敏、高特异性的检测要求。
近年来，现代分子生物学技术及纳米技术的快速发展为GSH的高灵敏、特异性生物传感检测技术提供了新的思路和技术。作为金纳米粒子家族中的新材料，金纳米笼一经问世便得到了广泛的关注和研究。研究表明，作为还愿型物质的GSH能够与含有双硫键(—S—S—)的物质发生特异性反应，可将其中的双硫键切断并分别将其还原为巯基(—SH)，同时，自身被氧化，生成氧化型产物GSSG。本发明根据GSH的这一反应特性，将其巧妙地应用到基于纳米材料的生物传感的设计与应用领域，为GSH的高灵敏检测提供了新型、特异、高效的检测平台。采用金纳米笼作为纳米载体，利用含有双硫键的生物分子构建基于可控释放的荧光传感器检测GSH的技术还未见文献报道。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，针对基于可控释放的荧光传感器检测GSH的技术未见报道，因此，本发明的第一目的：提出并构建一种新型的基于可控释放技术的GSH荧光传感器，具体是利用中空多孔的金纳米笼作为纳米载体，将含有双硫键的生物分子组装到金纳米笼表面，一方面起到分子生物门的作用封堵金纳米笼孔内物质的外泄，另一方面作为分子识别探针与待测靶分子发生特异性的分子识别反应。如有待测靶分子GSH的存在，组装在金纳米笼表面的含有双硫键的生物分子将会与之发生特异性的分子识别反应，导致双硫键被切断，含有双硫键的生物分子从金纳米笼表面脱离，从而使封堵笼孔的分子门被打开，并将金纳米笼内的客体分子如荧光分子释放出来，实现荧光信号的增强与检测。因此，可由体系荧光强度的增加来指示GSH的存在及其浓度大小。利用该荧光传感器，能够实现对GSH的高灵敏、高选择性检测，为重大疾病的临床诊断与治疗、食品、医药等诸多领域的研究与应用提供新技术和新方法；本发明的第二目的：提供一种检测GSH的荧光传感器的制备方法；本发明的第三目的：提供一种应用该荧光传感器检测GSH的方法。将本发明提出的荧光传感器用于GSH的荧光检测，能够显著地提高检测灵敏度和特异性。
本发明是通过以下技术方案实现发明目的的。本发明提出的检测GSH的荧光传感器是以金纳米笼作为纳米载体，利用其空心多孔的结构特性，在其内部装载客体分子如荧光染料，为了防止荧光染料的外泄，利用含双硫键的生物分子在金纳米笼表面组装具有可生物响应的分子门，实现对金纳米笼孔的封堵，防止孔内物质的释放；其中，所述的含双硫键的生物分子是经过特别设计的、具有一定碱基长度的含有双硫键的核苷酸分子，其碱基序列为5’-ACG AGT CA S-S TTT TGT TTG TTC CCC CCT TCT TTC TTA-3’，该生物分子作为靶分子的识别探针被组装到金纳米笼表面，同时，该识别探针也被用作封堵笼孔的分子门防止孔内物质的释放。具有分子识别作用的探针分子门是通过在金纳米笼表面修饰正电荷的方法而将其组装到金纳米笼表面，优选地采用聚二烯丙基二甲基氯化铵作为正电荷修饰剂在金纳米笼表面修饰一层聚阳离子。
优选地，上述的GSH荧光传感器，所述的荧光染料是罗丹明B。
一种制备本发明提出的基于可控释放技术的GSH荧光传感器的制备方法，包括如下步骤：
(1)将磁珠与金纳米笼溶液混合，37℃恒温振荡12h，磁分离，清洗，加入聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液，37℃恒温振荡12h，磁分离，清洗；
(2)加入罗丹明B溶液，37℃恒温振荡12h后加入GSH识别探针溶液，继续37℃振荡12h后磁分离，清洗，即制得GSH荧光传感器；
其中，所述的GSH识别探针是经过特别设计的、具有一定碱基长度的含有双硫键的核苷酸分子，其碱基序列为5’-ACG AGT CA S-S TTT TGT TTG TTC CCC CCT TCT TTCTTA-3’。
本发明的有益效果：本发明提出的基于可控释放技术的GSH荧光传感器是将金纳米笼与含有双硫键的GSH识别探针相结合，通过静电组装作用在金纳米笼表面形成具有可生物响应的分子门，利用识别探针与靶分子GSH之间发生的特异性的分子识别反应，导致双硫键被切断，含有双硫键的生物分子从金纳米笼表面脱离，从而使封堵笼孔的分子门被打开，并将金纳米笼内的客体分子如荧光分子释放出来，实现了荧光信号的增强与检测，该方法使GSH的检测灵敏度得到显著提高，可实现对靶分子GSH高灵敏、高选择性的检测。本发明提出的GSH荧光传感器具有结构简单、稳定性好、可控性强、荧光信号灵敏等优点，同时，不受其它常见干扰物质如Mg2+，Na+，Fe3+，Ca2+，Zn2+等金属离子的影响，具有高的选择性，实验结果表明，相比于其它非蛋白巯基物如硫氢化钠(NaSH)、巯基己醇(MCH)、巯基乙酸(TA)、半胱胺酸(CYS)、二硫苏糖醇(DTT)等物质，本发明提出的GSH荧光传感器显示出优异的选择性和特异性，采用本发明提出的GSH荧光传感器可在1.0×10-12～6.0×10-10M范围内实现对GSH的高灵敏、高选择性检测，与文献值相比，本发明对谷胱甘肽的检测灵敏度提高近100倍。可以预见，该荧光传感器及其制备方法和检测技术具有较大的应用潜力和广阔的应用前景，将在重大疾病的临床诊断与治疗、食品、医药等诸多领域发挥重要的作用。
附图说明
图1谷胱甘肽的浓度与荧光强度曲线图。
具体实施方式
以下是本发明涉及的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
下面通过实施例具体地说明本发明，但本发明不受下述实施例的限定。
实验仪器：THZ-82A气浴恒温振荡器(金坛市医疗器械厂)；F-4600荧光分光光度计(日立，日本)；磁性分离架(天津倍思乐色谱技术开发中心)。
实验试剂：3-4μm巯基修饰磁珠(天津市倍思乐色谱技术开发中心)；罗丹明B(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；含有双硫键的GSH识别探针的碱基序列为：5’-ACG AGT CAS-S TTT TGT TTG TTC CCC CCT TCT TTC TTA-3’(上海生工生物工程股份有限公司)，PBS缓冲溶液为0.01M(pH 7.4,Na2HPO4-NaH2PO4)。
实施例1：
一种制备本发明提出的基于可控释放技术的GSH荧光传感器的方法，包括如下步骤：
(1)20μL清洗后的巯基磁珠与400μL金纳米笼溶液均匀混合，37℃恒温振荡12h，磁分离，清洗，在制得的金纳米笼复合物中加入200μL聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液(11.664mg/mL)，37℃恒温振荡12h，磁分离，清洗；
(2)加入100μL罗丹明B溶液(1.0×10-5mol/L)，37℃恒温振荡12h后加入10μL GSH识别探针溶液(1.0×10-5M)，37℃振荡12h，磁分离，清洗，即制得GSH荧光传感器；
其中，所述的GSH识别探针是含有双硫键的核苷酸分子，其碱基序列为5’-ACGAGTCA S-S TTT TGT TTG TTC CCC CCT TCT TTC TTA-3’；所述的巯基磁珠是购买的商品(天津市倍思乐色谱技术开发中心)；所述的金纳米笼按文献方法获得(G.D.Moon,S.W.Choi,X.Cai,W.Y.Li,E.C.Cho,U.Jeong,L.V.Wang andY.N.Xia.J.Am.Chem.Soc.2011,133,4762–4765)。
实施例2:
一种采用本发明提出的基于可控释放技术的GSH荧光传感器检测GSH的方法如下：
(1)将10μL待测GSH样品溶液加入到本发明提出的基于可控释放技术的GSH荧光传感器中，用PBS缓冲溶液(PH＝7.4)稀释至100μL，37℃恒温振荡2h，识别探针与靶分子GSH之间发生特异性的分子识别反应，导致双硫键被切断，含有双硫键的识别探针从金纳米笼表面脱离，从而使封堵笼孔的分子门被打开，并将金纳米笼内的荧光分子罗丹明B释放出来；
(2)磁分离，收集上清液及洗液进行荧光检测，检测条件：激发波长和发射波长分别为530、573nm。
图1为GSH的浓度与荧光强度曲线图，GSH的浓度分别为(a→l：0；1.0×10-12；5.0×10-12；1.0×10-11；4.0×10-11；8.0×10-11；1.0×10-10；2.0×10-10；4.0×10-10；6.0×10-10；2.0×10-9；1.0×10-8M)；结果表明，GSH浓度在1.0×10-12～6.0×10-10M时，荧光信号强度与GSH浓度呈现良好的线性关系，其线性方程为：FL＝220.464+0.805CGSH(10-12M)，线性相关系数为0.9939。
本发明将分子识别技术、可控释放技术与纳米技术相结合，通过特异性的分子识别反应，可实现对非蛋白巯基物GSH的高灵敏、高选择性检测。具体是将中空多孔的金纳米笼与含有双硫键的GSH识别探针相结合，使该荧光传感器具有可生物响应的分子门，一旦有待测靶分子GSH的存在，则发生识别探针与GSH之间的特异性的分子识别反应，导致双硫键被切断，含有双硫键的识别探针从金纳米笼表面脱离，从而使封堵笼孔的分子门被打开，金纳米笼内的荧光分子罗丹明B得以释放，实现荧光信号的增强与检测，因此，利用该荧光传感器，能够实现对GSH的高灵敏、高选择性检测。
本发明提出的基于可控释放技术的GSH荧光传感器具有结构简单，稳定性好，可控性强，荧光信号灵敏等优点，同时，不受其它常见干扰物质如Mg2+，Na+，Fe3+，Ca2+，Zn2+等金属离子的影响，具有高的选择性，可用于微量样品中低含量乃至极低含量GSH的高灵敏、高选择性检测，不但能够为医疗卫生、食品、生命科学等领域的应用与研究提供新的途径和方法，尤为重要的是，基于本发明的可控释放技术也将为肿瘤靶向、药物输送、重大疾病的早期诊断与治疗带来全新的方法和技术。

Claims (4)

1.一种检测谷胱甘肽的方法，其特征在于步骤如下：
(1)将谷胱甘肽溶液加入到基于可控释放技术的谷胱甘肽荧光传感器中，用PBS缓冲溶液稀释，37℃恒温振荡1-3h；
(2)磁分离，收集上清液，检测其荧光信号；
其中，所述的基于可控释放技术的谷胱甘肽荧光传感器是由磁珠、金纳米笼、荧光染料、正电荷修饰剂和谷胱甘肽识别探针构建而成，其制备步骤如下：
(1)磁珠与金纳米笼的混合溶液在37℃恒温振荡12h，磁分离，清洗，加入正电荷修饰剂溶液，37℃恒温振荡12h，磁分离，清洗；
(2)加入荧光染料溶液，37℃恒温振荡12h后加入谷胱甘肽识别探针溶液，37℃振荡12h后磁分离，清洗，即制得基于可控释放技术的谷胱甘肽荧光传感器；所述的谷胱甘肽识别探针是含有双硫键的核苷酸分子；所述的谷胱甘肽识别探针的碱基序列为5’-ACG AGT CA S-S TTT TGT TTG TTC CCC CCT TCT TTC TTA-3’。
2.一种如权利要求1所述的检测谷胱甘肽的方法，其特征在于：所述的谷胱甘肽识别探针是通过静电作用被组装到金纳米笼表面。
3.一种如权利要求1所述的检测谷胱甘肽的方法，其特征在于：所述的正电荷修饰剂是聚二烯丙基二甲基氯化铵。
4.一种如权利要求1所述的检测谷胱甘肽的方法，其特征在于：所述的荧光染料是罗丹明B。
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