CN104634754B - 一种功能化磁珠分离‑酶联适配体检测食品中土霉素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了功能化磁珠分离‑酶联适配体检测食品中土霉素的方法，其特征在于：采用核酸适配体‑磁纳米粒子复合物探针，通过HRP‑OTC与样品中的OTC直接竞争结合磁珠表面的OTC适配体，底物显色检测吸光值变化来定量分析样品中土霉素含量。与传统的ELISA和酶联适配体（ELAA）相比，本发明充分结合了磁性纳米材料快速分离及富集效应、核酸适配体的高特异性和酶标板的高通量筛选特性，可大大缩短检测时间，提高检测灵敏度和特异性，降低检测成本。

Description

一种功能化磁珠分离-酶联适配体检测食品中土霉素的方法

技术领域

本发明涉及食品中土霉素的检测方法，属于食品安全分析技术领域。

背景技术

土霉素(Oxytetracycline，OTC)，别名5-羟基四环素，地霉素，地灵霉素，氧四环素等，是一种广谱抗菌药物，常作为牛、猪、家禽、鱼等动物疾病的预防和感染的治疗用药。然而由于滥用及不遵守休药期规定等原因，造成其在畜产品中的残留，不仅给人类健康带来严重危害，也给环境造成了严重威胁。世界粮农组织、世界卫生组织、欧盟及我国政府对食品中土霉素的残留限量作了规定。

目前，土霉素检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳法(CE)、液相色谱-质谱法(HPLC-MS)、酶联免疫吸附法(ELISA)等。但仪器分析方法设备昂贵，前处理繁琐。快速检测方法通常采用抗原抗体特异相互作用识别模式，但由于受到抗体易失活、制备依赖免疫动物和细胞、繁琐费时、一些小分子物质难以产生特异性抗体等因素的影响，在一定程度上限制了抗体在快速检测技术中的应用。

核酸适配体（Aptamer）技术的出现弥补了抗体在相关检测领域中应用的不足。目前已有利用核酸适配子为识别分子应用于食品中土霉素检测的报道。如刘宾（暨南大学硕士论文）建立了基于配适体的生物素-亲和素酶联检测土霉素的分析方法，但检测限（1.5g/L）不能满足土霉素检测的需要（限量值：100mg/kg）。Kim et al.（Anal. Chim. Acta,2009, 634: 250-254）建立了适配体电化学传感器检测土霉素的分析方法，但适配体固定步骤相对耗时，且样品基质对电化学信号易造成干扰。2010年他又利用纳米金修饰的适配体为探针比色检测土霉素（Biosens. Bioelectron 26: 1644-1649），但无法精确定量。2014年Kim et al. （Biosens. Bioelectron 51: 426–430）基于ELISA原理，建立了牛奶中土霉素的间接酶联适配体分析（ic-ELAA）方法，检测限为12.3 ng/mL，但方法需要将OTC–BSA包被于酶标板，造成检测时间较长（>10h）。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单、检测快速、灵敏度高、成本低的功能化磁珠分离-酶联适配体检测食品中土霉素的方法。

本发明的目的通过以下技术方案来具体实现：

一种功能化磁珠分离-酶联适配体检测食品中土霉素的方法，采用核酸适配体-磁纳米粒子复合物探针，通过HRP-OTC与样品中的OTC直接竞争结合磁珠表面的OTC适配体，底物显色检测吸光值变化来定量分析样品中土霉素含量。

其原理是将适配体通过生物素-亲和素系统固定于纳米磁珠表面，辣根过氧化酶酶标记OTC（HRP-OTC）与样品中的OTC直接竞争结合磁珠表面的OTC适配体，通过底物显色检测吸光值变化来定量分析样品中土霉素含量。检测原理如图1所示。

核酸适配体-磁纳米粒子复合物探针的制备，采用文献（Wu SJ, Duan N, WangZP, et al. Analyst, 2011, 136, 2306-2314）报道的方法进行制备。

进一步的，所述的核酸适配体-磁纳米粒子复合物探针为生物素修饰的适配体连接亲和素修饰的纳米磁珠，即采用化学共沉淀法制备Fe₃O₄纳米颗粒，然后利用戊二醛法将氨基化的纳米磁珠与亲和素偶联。

进一步优选，所述OTC核酸适配体的5’端修饰了生物素，通过生物素-亲和素系统，同时固定于亲和素修饰的纳米磁珠表面。

作为优选方案，上述的功能化磁珠分离-酶联适配体检测食品中土霉素的方法，包括如下步骤：

1）HRP-OTC与OTC直接竞争结合固定于纳米磁珠表面的OTC适配体：

a.将步骤1）中制得的纳米磁珠分散于PBS中，取100μL添加到酶标板孔中，磁分离，去上清；

b.每孔中加入200µL封闭液，37℃孵育40min，磁分离，PBST洗涤多余的封闭液；

c.然后于每孔中依次加入50μL HRP-OTC和50μLOTC标准品溶液，37℃孵育40min，磁分离，PBST洗涤液洗涤；

d.每孔中加入100μL TMB底物显色液，37℃避光反应20min；

e.最后每孔中加入100μL 终止液终止反应，酶标仪450nm 测吸光值；

2）标准曲线的绘制

按步骤1）的操作步骤对土霉素标准品进行检测，建立标准曲线，OTC标准品浓度依次为0.5、1、2、5、10、25、50、100 ng/mL，以不同土霉素浓度的对数为横坐标，以抑制率B/B₀为纵坐标作图，绘制标准曲线，建立回归方程，B₀：OTC标准品浓度为0ng/mL所对应的吸光度；B：OTC标准品不同浓度所对应的吸光度；

3）将食品样品提取液代替标准品溶液，按照步骤1）所述步骤进行检测，根据步骤2）的标准曲线计算食品样品中OTC的含量。

进一步优选的，所述步骤1）的步骤a中，核酸适配体-磁纳米粒子复合物探针分散后的浓度为1.0mg/mL。

进一步优选的，所述封闭液为0.1% BSA。

进一步优选的，所述终止液为2.0 mol/L的H₂SO₄溶液。

根据标准曲线计算计算IC₅₀值为14.47 ng/mL（IC₅₀值：抑制率为50%所对应的药物浓度）和检测限LOD为0.88ng/mL（LOD：吸收值为B₀-空白对照3倍标准偏差所对应的标品浓度）

本发明针对传统大型仪器不能实现现场快速检测、前处理繁琐、以及免疫分析方法需要制备抗体的缺点，利用纳米磁珠快速分离及有效富集靶物质的优点，适配体的高特异性和选择性特点，及酶标板的高通量筛选特性，建立了磁珠分离-酶联适配体检测方法，可用于食品中土霉素残留的快速（检测时间：100min）、高灵敏（LOD：0.88ng/mL）检测。与传统的ELISA和酶联适配体（ELAA）相比，本发明提高了检测速度、灵敏度和特异性，降低了检测成本。

与传统ELISA和酶联适配体（ELAA）相比，优点如下：

（1）此方法不需要制备抗体，适配体可体外人工合成，制备简单，节约劳动力；

（2）检测成本低于传统的免疫分析方法；

（3）相对于微孔板，磁纳米颗粒可充分发挥比表面积及小尺寸效应，提供更多的结合位点，提高检测的特异性；

（4）相对于以微孔板为载体的ELAA分析方法，适配体不需要包被在酶标板上，缩短了分析时间（本发明检测时间为100min，以微孔板为载体的ELAA分析方法则需要10h以上），同时适配体修饰磁珠均匀分散于溶液中，加快了识别分子与靶物质的结合速率，使检测速度大大提高；

（5）在外加磁场的作用下通过磁分离可实现样品一步分离和靶物质有效富集，使洗涤更彻底，降低基质干扰，提高了分析方法的信噪比与灵敏度。

附图说明

图1是功能化纳米磁珠分离-酶联适配体检测土霉素的原理图；

图2是氨基化纳米磁珠扫描电镜图；

图3是氨基化纳米磁珠红外表征图；580 cm^-1 为Fe–O的伸缩振动，2854、2920和3433 cm^-1为C–H和N–H的伸缩振动，1633 cm^-1为氨基化纳米材料上的N–H的变形振动。

图4是亲和素结合纳米磁珠的紫外扫描图，a. 亲和素原液吸光值；b. 亲和素结合纳米磁珠后的上清液吸光值；

图5是磁珠分离-酶联适配体检测土霉素的标准曲线图；

图6是本发明与国标方法检测同一样品中土霉素的相关性曲线。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

以下实施例中所用适配体是根据文献报道（Niazi JH., Lee SJ, Kim YS, etal. Bioorgan. Med. Chem., 2008, 16: 1254-1261），由上海生物工程技术有限公司合成。5′-biotin- GGAATTCGCTAGCACGTTGACGCTGGTGCCCGGTTGTGGTGCGAGTGTTGTGTGGATCCGAGCTCCACGTG-3′(Mw, 22052.1; Tm, 80.1°C)

实施例1：牛奶样品测定

一、核酸适配体-磁纳米粒子复合物探针的制备

核酸适配体-磁纳米粒子复合物探针的制备采用文献（Wu SJ, Duan N, Wang ZP,et al. Analyst, 2011, 136, 2306-2314）报道的方法进行制备。

1.氨基化纳米磁珠的制备：在30mL乙二醇中加入6.5g的1,6-己二胺，2.0g无水醋酸钠（CH₃COONa）和1.0g六水合三氯化铁（FeCl₃·6H₂O），50℃搅拌，得胶体溶液，将溶液转移到50mL带聚四氟乙烯内衬的反应釜中，198℃反应6h。冷却至室温，弃上层液体，去离子水冲出下层固体物质，磁分离收集。分别用去离子水和乙醇洗涤2次，50℃干燥5-10h。氨基化纳米磁珠扫描电镜图参见图2，氨基化纳米磁珠红外表征图参见图3。

2.亲和素偶联氨基化的纳米磁珠：定量称取纳米材料悬浮于PBS（10 mmol/L ）中，超声分散15min，加入戊二醛溶液，使其终浓度为5%（v/v）。然后室温振荡2h，磁分离，弃上清，10 mmol/LPBS洗涤三次，除去多余的戊二醛。然后加入10 mmol/L的PBS，超声分散，加入一定量的亲和素，室温振荡12h，磁分离，弃上清，10 mmol/LPBS清洗三次。采用紫外分光光度计于280nm处测亲和素结合磁性纳米颗粒前后的吸光值。由图4可见，纳米磁珠的上清液中亲和素的量显著减少, 表明亲和素与纳米磁珠表面的-NH₂连接成功。

3.生物素修饰的适配体连接亲和素修饰的纳米磁珠：将亲和素修饰的纳米材料悬浮于10 mmol/LPBS中超声分散，加入一定浓度的核酸适配体溶液，室温振荡4h，磁分离，弃上清，10 mmol/L PBS清洗三次以除去未结合的适配体，重悬于PBS缓冲液中。

二、标准曲线的建立

1.将上述步骤制备的核酸适配体-磁纳米粒子复合物探针，分散于PBS中，取100μL添加到酶标板孔中，然后磁分离，弃上清。

5.每孔加入200μL封闭液（0.1% BSA），37℃孵育40min，磁分离，PBST洗涤多余的BSA。

6.每孔依次加入50μL HRP-OTC和50μL不同浓度的标准品溶液（0.5、1、2、5、10、25、50、100 ng/mL），37℃孵育40min，磁分离，PBST洗涤液洗涤。

7.每孔加入100μL TMB底物显色液，37℃避光反应20min。

8.每孔加入100μL终止液（2.0 mol/L的H₂SO₄）终止反应，酶标仪450nm 测吸光值。

9.标准曲线的绘制:以标准品浓度的对数为横坐标，以抑制率B/B₀为纵坐标作图，绘制标准曲线，建立回归方程。计算半数抑制量（IC₅₀值）和检测限（LOD）。图5为该方法测定的平均标准曲线，该标准曲线的线性方程为B/B₀=-32.504 × log [OTC] + 87.722, R² =0.989，线性范围为0.5-100 ng/mL，IC₅₀值为14.47 ng/mL， LOD为0.88 ng/mL。而Kim, etal. 报道的比色检测方法（Biosens. Bioelectron, 2010, 26: 1644-1649）和Kim et al.（Biosens. Bioelectron,2014, 51: 426–430）报道的酶联适配体检测方法的LOD分别为9.21和12.3 ng/mL。

三、样品分析

取牛奶样品5.0 mL，加提取溶液5mL（0.625g/L 三氯乙酸+0.025% Tween-20 +50% MeOH [4:1:1, v/v/v]，0.025%巯基乙醇），涡旋混合10min，15000r/min离心10min。弃去上层脂肪层，吸取清液100μL用10mmol/L PBS缓冲液定容至1 mL，按照上述方法进行分析，代入标准曲线计算样品中土霉素含量。

实施例2：动物组织样品测定

方法同实施例一，区别在于样品的前处理方法：

称取鸡肉样品1.0g于50mL离心管中，加入提取溶液4mL，涡旋混合10min，15000r/min离心10min。取上清液200uL用10mmol/L PBS缓冲液定容至1 mL用于分析。代入标准曲线计算样品中土霉素含量。

实施例3：蜂蜜样品测定

方法同实施例一，区别在于样品的前处理方法：

准确称取1.0g 蜂蜜样本于50mL旋盖离心管中，加入10mL PBS缓冲液（10 mmol/L，pH 7.4），涡旋5min，超声5min，取上清液100μL 用于分析。根据标准曲线计算样品中待测物含量。

实施例4：样品中土霉素的加标回收率测定

采用对阴性样品进行加标回收试验来考察方法的准确度，将标准溶液稀释成三个浓度水平添加到三种样品中（鸡肉、牛奶、蜂蜜），每个添加水平重复3次，按上述步骤进行样品前处理，并按照本发明方法进行分析，代入标准曲线计算样品中土霉素含量，计算加标回收率及相对标准偏差（RSD）。结果见表1，土霉素标品的添加回收率范围为71.0%-90.2%，相对标准偏差（RSD）<15%，符合农业部文件农医发[2005]17号附件2中精密度与准确度的要求，表明该分析方法准确、可靠。

Table 1 土霉素在食品样品中的加标回收率及变异系数(n=3)

。

实施例5：本发明与国家标准方法比较

从本地超市购买禽肉、牛奶和蜂蜜40份，按对应实施例和发明内容进行样品前处理和检测，根据标准曲线对检测结果进行定量分析。为验证本发明方法的准确性，将各样品分别按本发明和相应国家标准方法GB/T 20764-2006、GB/T 22990-2008和GB/T 18932.4-2002进行检测，将两种方法的检测结果进行对比分析，分析结果见图6。从图中可以看出，两种方法的检测结果具有很好的相关性（R² = 0.992），表明本发明建立的方法可用于食品中土霉素残留的检测。同时与国标方法和ELISA比较，具有前处理简单，检测成本低等优点；与微孔板为载体的酶联适配体分析方法比较，大大缩短了检测时间，提高了检测灵敏度。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种功能化磁珠分离- 酶联适配体检测食品中土霉素的方法，其特征在于：采用核酸适配体-磁纳米粒子复合物探针，通过HRP-OTC与样品中的OTC 直接竞争结合磁珠表面的OTC 核酸适配体，底物显色检测吸光值变化来定量分析样品中土霉素含量；

所述的核酸适配体- 磁纳米粒子复合物探针为生物素修饰的适配体连接亲和素修饰的纳米磁珠，即采用化学共沉淀法制备Fe₃O₄纳米颗粒，然后利用戊二醛法将氨基化的纳米磁珠与亲和素偶联；

所述OTC核酸适配体的5’端修饰了生物素，通过生物素- 亲和素系统，同时固定于亲和素修饰的纳米磁珠表面；

所述方法包括如下步骤：

1）HRP-OTC 与OTC 直接竞争结合固定于纳米磁珠表面的OTC 适配体：

a. 将核酸适配体- 磁纳米粒子复合物探针分散于PBS 中，取100μL 添加到酶标板孔中，磁分离，去上清；

b. 每孔中加入200μL 封闭液，37℃孵育40min，磁分离，PBST 洗涤多余的封闭液；

c. 然后于每孔中依次加入50μL HRP-OTC 和50μLOTC 标品溶液，37℃孵育40min，磁分离，PBST 洗涤液洗涤；

d. 每孔中加入100μL TMB 底物显色液，37℃避光反应20min ；

e. 最后每孔中加入100μL 终止液终止反应，酶标仪450nm 测吸光值；

2）标准曲线的绘制

按步骤1）的操作步骤对土霉素标准品进行检测，建立标准曲线，OTC 标准品浓度依次为0.5、1、2、5、10、25、50、100 ng/mL，以不同土霉素浓度的对数为横坐标，以抑制率B/B0为纵坐标作图，绘制标准曲线，建立回归方程，B0：OTC 标准品浓度为0ng/mL 所对应的吸光度；B ：OTC 标准品不同浓度所对应的吸光度；

3）将食品样品提取液代替标准品溶液，按照步骤1）所述步骤进行检测，根据步骤2）的标准曲线计算食品样品中OTC 的含量；

所述步骤1）的步骤a 中，核酸适配体- 磁纳米粒子复合物探针分散后的浓度为1.0mg/mL；

所述封闭液为0.1% BSA；

所述终止液为2.0 mol/L 的H₂SO₄溶液。