CN109762824A - 一种分离甲胎蛋白的适配体功能化纳米磁珠的制备方法 - Google Patents

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林振坤
苏宇
刘雨欣
陈永辉
刘畅
金嘉乐
戴露瑶
包佳丽
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Abstract

本发明提供一种分离甲胎蛋白的适配体功能化纳米磁珠的制备方法，如下：(1)纳米磁珠表面修饰亲和素：20mg的纳米四氧化三铁均匀分散在适量乙醇中，先后依次加入氨水和正硅酸乙酯，室温下充分搅拌；上述反应产物经磁分离后分散于甲苯中并搅拌，逐滴加入3‑氨丙基三乙氧基硅烷，在高温氮气保护下充分搅拌；上述反应产物经磁分离后分散于PBS溶液，加入戊二醛，室温充分混合，加入亲和素振荡继续充分孵育，获得表面修饰亲和素的纳米磁珠。(2)纳米磁珠表面嫁接适配体。取上述表面修饰亲和素的磁珠溶于适量TE溶液，加入5’端修饰生物素的AFP适配体，室温充分孵育，通过亲和素和生物素的特异性结合，适配体嫁接于纳米磁珠表面，获得AFP适配体纳米磁珠。

Description

一种分离甲胎蛋白的适配体功能化纳米磁珠的制备方法
技术领域
本发明涉及功能化纳米材料制备领域，具体是指一种能够高效分离甲胎蛋白的适配体功能化纳米磁珠的制备方法。
背景技术
原发性肝癌(HCC)是临床上最常见的恶性肿瘤之一，具有发病隐匿、进展快、恶性程度高等特点。美国癌症学会最新发布的癌症统计数据显示，全球HCC新发病例78.2万，死亡病例74.5万，中国均占50％左右；在癌症死亡率排序中，男性和女性的HCC死亡率分别位居第2和第6位(参看L.A.Torre,et al.,Global cancer statistics,2012.CA-Cancer JClin,2015.65(2):87-108)。HCC由于初期发病时比较隐匿，没有特殊的症状表现，因而大部分病患确诊时已经进入癌症的中晚期，往往耽误了最佳的治疗时间。因此，HCC的前期诊断和治疗对于延长病患的生存时间和改善其生活水平起着至关重要的作用。
甲胎蛋白(AFP)是由胚胎卵黄囊产生并从肝脏中分泌出的血浆蛋白，人血清中AFP含量与肝癌细胞密切相关。AFP是当前全世界应用最普遍的HCC临床标志物，广泛应用于HCC的早期筛查、诊断、疾病发展监测、治疗及预后观察。例如，美国肝病协会(AASLD)于2005年提出对于HCC高危患者的监测方案，即每6个月进行血清AFP水平和超声检查(参看J.Bruix,et al.Management of hepatocellular carcinoma.Hepatology,2005.42(5):1208-1236)。
当前临床AFP检测通常采用免疫分析方法，其基本原理是AFP(抗原)与抗体的特异性结合，从而实现对AFP的分离与检测。众所周知，抗体本身存在一些先天缺陷，例如对高温敏感且容易变质，活性受批次影响大，等等。抗体的这些不稳定因素严重影响了AFP检测结果的准确性和可靠性。因此，要规避当前免疫分析方法的弊端，最关键的任务是找到一种能够有效代替抗体，特异性结合并AFP的物质(材料)。
适配体是一类经体外筛选得到的单链结构的DNA或RNA，碱基数一般在25-100之间，通常又被称为“化学抗体”。适配体通过自身形成的三维空间结构与靶标物质特异性地结合，两者通过“假碱基对”的堆积作用、氢键作用、静电作用等实现识别和结合(参看H.Sun,et al.Oligonucleotide aptamers:new tools for targeted cancertherapy.Mol Ther Nucleic Acids,2014.3:e182)，其结合靶标的能力可与抗体相媲美(参看T.Hermann,et al.Adaptive recognition by nucleic acid aptamers.Science,2000.287(5454):820-825)。此外，适配体的天然属性使其较传统抗体具有一系列独特的优势(参看M.Hu,et al.The application of aptamers in cancer research:an up-to-date review.Future Oncol,2013.9(3):369-376)，例如稳定性高，变性后可快速复原，可长期保存和运输；制备方便，价格低廉，经筛选确定序列后，可通过化学方法大量快速合成；易于修饰，可根据需要进行各种化学修饰；免疫原性低，无毒，组织渗透性好；等等。大量研究结果显示，适配体被认为是抗体的理想替代者。
纳米磁珠是一种具有广泛应用价值的新型功能材料，受到广泛关注并快速发展(参看赵子恺等，纳米磁珠材料的制备及在生物医学领域的应用进展，国际生物医学工程杂志，2009，32(3):183-186)。纳米磁珠的内核(载体)通常为纳米四氧化三铁，在外加磁场的作用下，磁珠发生定向移动。纳米磁珠优异的磁响应特性使其具备独特的磁分离功能，能够大大简化传统复杂的生化实验操作，提高检测效率，因而在生物医学领域得到了广泛应用。
因此，本发明采用适配体作为AFP的特异性识别元件，以纳米四氧化三铁磁珠为磁响应载体，制备一种能够高效分离AFP的适配体功能化纳米磁珠。本发明方法获得的AFP适配体功能化纳米磁珠将为AFP的分离和检测提供一种全新的策略，提高AFP检测结果的准确性和可靠性，对HCC的早期诊断和长期治疗具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是为了填补现有功能化纳米磁珠相关产品及其制备技术的空白，提供一种能够高效分离甲胎蛋白(AFP)的适配体功能化纳米磁珠的制备方法，该制备方法具有工艺简单、产品质量稳定、易于推广等优点。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种分离甲胎蛋白的适配体功能化纳米磁珠的制备方法，包括如下步骤：
(1)纳米磁珠表面修饰亲和素：20mg的纳米四氧化三铁(粒径为200nm左右)均匀分散在150mL乙醇中，先后依次加入10mL氨水和0.4mL正硅酸乙酯，室温下充分搅拌5小时；上述反应产物经磁分离后分散于适量甲苯中并搅拌，逐滴加入6mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，在氮气保护下90℃搅拌12小时；上述反应产物经磁分离后分散于PBS溶液，加入5.5mL戊二醛，室温孵育2小时充分混合，加入0.5-1mg亲和素振荡继续充分孵育12h，获得表面修饰亲和素的纳米磁珠；
(2)纳米磁珠表面嫁接适配体：取上述表面修饰亲和素的磁珠20mg溶于1mLTE溶液，加入1-2OD的5’端修饰生物素的AFP适配体，室温充分孵育2h，通过亲和素和生物素的特异性结合，适配体嫁接于纳米磁珠表面，获得AFP适配体纳米磁珠。
上述方案中，所述的PBS溶液为常用磷酸盐缓冲液，浓度0.1M，pH＝7.2-7.4；所述的TE溶液为成分为10mM Tris,1mM EDTA,12.5mM MgCl2·6H2O,pH＝8.0；AFP适配体序列为5’-GTG ACG CTC CTA ACG CTG ACT CAG GTG CAG TTC TCG ACT CGG TCT TGA TGT GGGTCC TGT CCG TCC GAA CCA ATC-3’；所述的1OD AFP适配体含量为33.88μg。
本方法针对目前未有AFP适配体功能化纳米磁珠的相关产品和技术的现状，以AFP适配体为表面修饰分子、四氧化三铁纳米微球为载体，发明一种高效分离AFP的适配体功能化纳米磁珠的制备方法。本发明方法的创新点和优势如下：(1)采用适配体实现对AFP的特异性识别与结合，代替传统的抗体；(2)以磁响应良好的四氧化三铁纳米微球为载体，实现快速高效分离；(3)工艺简单，易于掌握，便于推广。
附图说明
图1优选实施例制备产物的透射电镜照片；
图2优选实施例制备产物的VSM测试结果；
图3优选实施例制备产物的实际磁分离过程图；
图4本发明的技术路线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
优选实施例
一种分离甲胎蛋白的适配体功能化纳米磁珠的制备方法，其制备流程如下：(1)纳米磁珠表面修饰亲和素：
20mg的纳米四氧化三铁(粒径200nm左右)均匀分散在150mL乙醇中，先后依次加入10mL氨水和0.4mL正硅酸乙酯，室温搅拌5小时；上述反应产物经磁分离后分散于甲苯中并搅拌，逐滴加入6mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，在氮气保护下90℃搅拌12小时；上述反应产物经磁分离后分散于PBS溶液，加入5.5mL戊二醛，室温孵育30分钟，加入0.5mg亲和素振荡继续孵育12小时，获得表面修饰亲和素的纳米磁珠；
(2)纳米磁珠表面嫁接适配体：
取上述表面修饰亲和素的磁珠20mg溶于1mL的TE溶液，加入2OD的5’端修饰生物素的AFP适配体，室温孵育2小时，通过亲和素和生物素的特异性结合，适配体嫁接于纳米磁珠表面，获得AFP适配体纳米磁珠。
优选实施例获得的AFP适配体纳米磁珠的透射电镜照片(附图1)显示，其粒径大多分布在200nm左右，表面具有明显的修饰层结构。振动磁强(VSM，当前最常用的材料磁性测试方法)测试结果(附图2)显示其饱和磁强度为43emu/g，无剩磁。实际磁分离实验(附图3)显示，外加磁场作用下AFP适配体纳米磁珠发生快速移动，完全分离耗时约90秒。上述结果显示纳米磁珠表面已经成功修饰适配体，而且磁响应性能良好。为研究制备的AFP适配体纳米磁珠对AFP的识别分离能力，我们进行加标回收率实验。实验结果显示其对AFP的加标回收率达到87.0％，显示对目标分子AFP具有高效的分离能力。注：一般情况下，加标回收率在80％-120％之间被认为效果良好。
实施例1
本实施例的主要操作步骤和条件同优选实施例，但其中亲和素添加量由0.5mg变为1mg。
本实施例获得的AFP适配体纳米磁珠，观察其外观性状与优选实施例相同。实际磁分离实验显示其在外加磁场作用下发生快速移动，完全分离耗时约110秒，具有良好的磁响应性能。加标回收率实验结果显示其对AFP的加标回收率达到91.3％，证明对目标分子AFP具有高效的分离能力。
实施例2
本实施例的主要操作步骤和条件同优选实施例，但其中5’端修饰生物素AFP适配体添加量由2OD变为1OD。
本实施例获得的AFP适配体纳米磁珠，观察其外观性状与优选实施例相同。实际磁分离实验显示其在外加磁场作用下发生快速移动，完全分离耗时约90秒，具有良好的磁响应性能。加标回收率实验结果显示其对AFP的加标回收率达到82.3.0％，证明对目标分子AFP具有高效的分离能力。
实施例3
本实施例的主要操作步骤和条件同优选实施例，但其中亲和素添加量由0.5mg变为1mg，5’端修饰生物素的AFP适配体添加量由2OD变为1OD。
本实施例获得的AFP适配体纳米磁珠，观察其外观性状与优选实施例相同。实际磁分离实验显示其在外加磁场作用下发生快速移动，完全分离耗时约120秒，具有良好的磁响应性能。加标回收率实验结果显示其对AFP的加标回收率达到85.5％，证明对目标分子AFP具有高效的分离能力。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (3)

1.一种分离甲胎蛋白的适配体功能化纳米磁珠的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)纳米磁珠表面修饰亲和素：20mg的纳米四氧化三铁均匀分散在150mL乙醇中，先后依次加入10mL氨水和0.4mL正硅酸乙酯，室温下充分搅拌5小时；上述反应产物经磁分离后分散于甲苯中并搅拌，逐滴加入6mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，在氮气保护下90℃搅拌12小时；上述反应产物经磁分离后分散于PBS溶液，加入5.5mL戊二醛，室温孵育2小时充分混合，加入0.5-1mg亲和素振荡继续充分孵育12h，获得表面修饰亲和素的纳米磁珠；
(2)纳米磁珠表面嫁接适配体：取上述表面修饰亲和素的磁珠20mg溶于1mLTE溶液，加入1-2OD的5’端修饰生物素的AFP适配体，室温充分孵育2h，通过亲和素和生物素的特异性结合，适配体嫁接于纳米磁珠表面，获得AFP适配体纳米磁珠。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的纳米四氧化三铁的粒径为200nm。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的PBS溶液为磷酸盐缓冲液，浓度0.1M，pH＝7.2-7.4；所述的TE溶液为成分为10mM Tris,1mM EDTA,12.5mM MgCl2·6H2O,pH＝8.0；AFP适配体序列为5’-GTG ACG CTC CTA ACG CTG ACT CAG GTG CAG TTC TCG ACTCGG TCT TGA TGT GGG TCC TGT CCG TCC GAA CCA ATC-3’；所述的1 OD AFP适配体含量为33.88μg。
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