CN111551722A - 一种识别和催化双功能化磁性海藻酸钠复合材料的制备及其应用 - Google Patents

一种识别和催化双功能化磁性海藻酸钠复合材料的制备及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种识别和催化双功能化磁性海藻酸钠复合材料的制备及其在化学发光分检测甲胎蛋白中的应用技术。主要技术特征是：首先制备适配体修饰的磁性海藻酸钠和互补DNA单链修饰的hemin@HKUST‑1，再通过碱基互补配对作用将两种材料复合，得到双功能化磁性海藻酸钠复合材料；本发明同时提供了一种将双功能化磁性海藻酸钠复合材料应用于化学发光检测甲胎蛋白的方法，该检测方法表现出优异的选择性、高的灵敏度和准确度，并且成功用于血清中甲胎蛋白的检测，为该方法进一步应用于临床甲胎蛋白的检测提供了理论支撑。

Description

一种识别和催化双功能化磁性海藻酸钠复合材料的制备及其 应用
技术领域
本发明涉及的是一种识别和催化双功能化磁性海藻酸钠复合材料的制备及其在化学发光分检测甲胎蛋白中的应用技术，属于化学发光传感领域，具体涉及适配体和铜基MOFs包覆氯高铁血红素双功能化的磁性海藻酸钠复合材料的制备及其在化学发光检测甲胎蛋白中的应用。
背景技术
海藻酸钠是从海带或海藻中提取的一种天然多糖类化合物，由a-L-古洛糖醛酸（G段）和β-D-甘露糖醛酸（M段）两种结构单元以4种方式GG、GM、MG、MM按（1-4）糖苷键连接而成的无规线性聚合物，是一种可再生的海洋资源。海藻酸钠分子链上大量的羟基、羧基可以通过配位、离子交换、螯合、静电力吸附金属离子和有机污染物。磁性材料是一种具有磁有序结构的强磁性材料，因其具有磁性可控的特性，已被广泛用于多种领域，如吸附、分离和载药等领域。磁性海藻酸钠材料因同时具有磁性可控便于分离的特性和表面优异的官能团特性，常被用作固载材料和吸附剂。在申请号为2016100724318的专利中公开了一种磁性海藻酸钠固化漆酶的制备方法，利用产漆菌种发酵制得漆酶酶液，掺加磁性粒子，辅以海藻酸钠对其固定，振荡吸附后干燥，从而得到磁性海藻酸钠固定化漆酶。申请号为2017106121910的专利中公开了一种磁性海藻酸钠微球固定降解菌复合型粉末清洗剂及清洗工艺，制备的粉末清洗剂不含磷，对环境友好，清洗效果好，对环境无毒无害，节省人力，使用范围广，且产生的废水更易处理。
金属有机框架（MOFs），也称为多孔配位聚合物，已在多种领域引起人们的广泛关注。作为一种多孔晶体材料，MOFs以无机金属离子形成的离子簇为节点，具有周期性网络结构。在MOFs的多种应用中，其催化性能的研究时间最长，应用最为广泛。MOFs具有孔隙率高、尺寸可调和比表面积大等特点，可提供所有的活性位点，为其发挥催化作用奠定了基础。MOFs高度均匀的孔隙形状和尺寸在尺寸选择性催化中起至关重要的作用，小分子反应物可以有效快速地进入孔内完成反应，分子粒径大于MOFs孔径的分子则无法反应。因此，MOFs是一类有效整合均相催化剂和异相催化剂的优势催化剂，具有高反应效率和可回收性。HKUST-1是一种以铜离子为节点，以均苯三甲酸为有机配体，通过配位作用形成的金属有机框架材料。HKUST-1具有较高的孔隙率、较大的比表面积和相对稳定的化学结构，是一种性能良好的催化剂。
肝癌是成人中最常见的原发性肝癌类型，是肝硬化患者最常见的死亡原因。甲胎蛋白（AFP）是一种原癌糖蛋白，在正常成人血清存在时浓度较低，当它超过20毫升/纳克时，可以作为一种肝细胞癌的早期指标。因此，甲胎蛋白是目前临床上检测原发性肝癌的主要血清标志物之一，研究人员在检测甲胎蛋白方面做了大量的工作，如何高选择性、灵敏检测甲胎蛋白对肿瘤的早期诊断具有重要意义。
本发明旨在制备一种识别和催化双功能化磁性海藻酸钠复合材料，适配体作为识别元件、包覆氯高铁血红素的铜基MOFs作为催化剂，同时被引入到磁性海藻酸钠中，形成双功能的磁性海藻酸钠复合材料；并将该材料用于化学发光检测甲胎蛋白中，实现对甲胎蛋白的高灵敏、高选择性、准确快速检测，发明了一种检测甲胎蛋白的新方法。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种识别和催化双功能化磁性海藻酸钠复合材料的制备方法，首先制备适配体修饰的磁性海藻酸钠和互补DNA链修饰的hemin@HKUST-1，再通过碱基互补配对作用将两种材料复合，得到双功能化磁性海藻酸钠复合材料（hemin@HKUST-1-互补链DNA-适配体-磁性海藻酸钠）。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
（1）适配体-磁性海藻酸钠的制备：移取0.1 ~ 0.3 mol水热法制备的Fe3O4胶体于三颈烧瓶中，加入20 ~ 25 mL质量分数为2%的海藻酸钠溶液和40 ~ 50 mL超纯水；将该烧瓶置于40ºC的油浴中反应3 ~ 5 h；再向该烧瓶中加入8 ~ 10 mL 质量分数为25%的戊二醛，继续搅拌3 ~ 5 h；反应结束后，在外磁场下磁性分离，得到戊二醛交联的磁性产物；将上述磁性产物分散于100 mL超纯水中，向其中加入0.3 ~ 0.5 g 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺和1.3 ~ 1.5 g N-羟基琥珀酰亚胺，并在室温下反应30 ~ 50 min；加入100 μL0.3 ~ 0.6 μmol/L的适配体，室温下孵化2 ~ 4 h；将产物转移到50 mL的容量瓶中，定容至刻度线；
（2）hemin@HKUST-1-互补链DNA的制备：称取20 ~ 30 mg利用溶剂热法制备的hemin@HKUST-1分散在10 mL 8 ~ 10 mg/mL的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺中，在室温下孵化10 ~ 20 min；将100 μL 0.6 ~ 0.8 μmol/L的互补链DNA1加入到上述溶液中，室温下孵化2 ~ 4 h；将产物转移到50 mL的容量瓶中，定容至刻度线；
（3）hemin@HKUST-1-互补链DNA-适配体-磁性海藻酸钠的制备：移取5 ~ 10 mL上述（1）中制备的适配体-磁性海藻酸钠分散液于50 mL离心管中，并向离心管中加入3 ~ 5 mL上述（2）中制备的hemin@HKUST-1-互补链DNA分散液，然后将该离心管至于室温下振荡反应2 ~4 h；在外磁场下磁性分离，得到最终双功能化磁性海藻酸钠复合材料。
本发明的另一个目的是将双功能化磁性海藻酸钠复合材料应用于化学发光检测甲胎蛋白，将制备的识别和催化双功能化磁性海藻酸钠复合材料置于甲胎蛋白样品中，室温下孵化2 ~ 4 h，使得甲胎蛋白与适配体充分识别和结合，形成甲胎蛋白@适配体-磁性海藻酸钠，此时hemin@HKUST-1-互补链DNA得到释放；用磁铁吸附样品液中的甲胎蛋白@适配体-磁性海藻酸钠，上清液中仅存在被释放下来的hemin@HKUST-1-互补链DNA；hemin@HKUST-1-互补链DNA经过进样管进入化学发光检测系统，催化鲁米诺-过氧化氢-氢氧化钠的化学发光反应，产生化学发光I，以此实现对甲胎蛋白的检测。
本发明的优点及效果是：
（1）本发明制备了一种适配体作为识别元件、包覆氯高铁血红素的铜基MOFs作为催化剂的双功能化磁性海藻酸钠复合材料，在磁性海藻酸钠和hemin@HKUST-1表面进行单链DNA的修饰，并通过互补DNA链间的碱基互补配对作用将两种材料复合，条件可控性强、操作简单；
（2）本发明制备了一种识别和催化双功能化磁性海藻酸钠复合材料，该合成材料对甲胎蛋白有高特异性识别能力、可以催化鲁米诺-过氧化氢的化学发光体系；
（3）本发明制备的一种识别和催化双功能化磁性海藻酸钠复合材料用于化学发光检测甲胎蛋白中，该检测方法表现出优异的选择性、高的灵敏度和准确度，并且成功用于血清中甲胎蛋白的检测，为该方法进一步应用于临床甲胎蛋白的检测提供了理论支撑。
具体实施方式
实施例1
（1）适配体-磁性海藻酸钠的制备：移取0.1 mol水热法制备的Fe3O4胶体于三颈烧瓶中，加入20 mL 质量分数为2%的海藻酸钠溶液和40 mL超纯水；将该烧瓶置于40ºC的油浴中反应4 h；再向该烧瓶中加入8 mL质量分数为25%的戊二醛，继续搅拌4 h；反应结束后，在外磁场下磁性分离，得到戊二醛交联的磁性产物；将上述磁性产物分散于100 mL超纯水中，向其中加入0.3 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺和1.5 g N-羟基琥珀酰亚胺，并在室温下反应30 min；加入100 μL 0.4 μmol/L的Apt，室温下孵化2 h；将产物转移到50 mL的容量瓶中，定容至刻度线；
（2）hemin@HKUST-1-互补链DNA的制备：称取20 mg利用溶剂热法制备的hemin@HKUST-1于10 mL 8 mg/mL 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺中，在室温下孵化15 min；将100 μL 0.6 μmol/L cDNA1加入上述溶液中，室温下孵化2 h；将产物转移到50 mL的容量瓶中，定容至刻度线；
（3）hemin@HKUST-1-互补链DNA-适配体-磁性海藻酸钠的制备：移取5 mL上述的适配体-磁性海藻酸钠分散液于50 mL离心管中，并向离心管中加入3 mL上述的hemin@HKUST-1-互补链DNA，然后将该离心管至于37 ºC恒温震振荡箱中振荡反应2 h；在外磁场下磁性分离，得到最终双功能化磁性海藻酸钠复合材料。
实施例2
（1）适配体-磁性海藻酸钠的制备：移取0.2 mol水热法制备的Fe3O4胶体于三颈烧瓶中，加入20 mL质量分数为2%的海藻酸钠溶液和45 mL超纯水；将该烧瓶置于40ºC的油浴中反应3 h；再向该烧瓶中加入8 mL质量分数为25%的戊二醛，继续搅拌3 h；反应结束后，在外磁场下磁性分离，得到戊二醛交联的磁性产物；将上述磁性产物分散于100 mL超纯水中，向其中加入0.4 g 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺和1.4 g N-羟基琥珀酰亚胺，并在室温下反应30 min；加入100 μL 0.3 μmol/L的Apt，室温下孵化3 h；将产物转移到50mL的容量瓶中，定容至刻度线；
（2）hemin@HKUST-1-互补链DNA的制备：称取25 mg利用溶剂热法制备的hemin@HKUST-1于10 mL 8 mg/mL 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺中，在室温下孵化15 min；将100 μL 0.6 μmol/L cDNA1加入上述溶液中，室温下孵化3 h；将产物转移到50 mL的容量瓶中，定容至刻度线；
（3）hemin@HKUST-1-互补链DNA-适配体-磁性海藻酸钠的制备：移取8 mL上述的适配体-磁性海藻酸钠分散液于50 mL离心管中，并向离心管中加入4 mL上述的hemin@HKUST-1-互补链DNA，然后将该离心管至于37 ºC恒温震振荡箱中振荡反应3 h；在外磁场下磁性分离，得到最终双功能化磁性海藻酸钠复合材料。
实施例3
（1）适配体-磁性海藻酸钠的制备：移取0.3 mol水热法制备的Fe3O4胶体于三颈烧瓶中，加入25 mL质量分数为2%的海藻酸钠溶液和50 mL超纯水；将该烧瓶置于40ºC的油浴中反应5 h；再向该烧瓶中加入10 mL质量分数为25%的戊二醛，继续搅拌5 h；反应结束后，在外磁场下磁性分离，得到戊二醛交联的磁性产物；将上述磁性产物分散于100 mL超纯水中，向其中加入0.5 g 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺和1.3 1.5 g N-羟基琥珀酰亚胺，并在室温下反应40 min；加入100 μL 0.4 μmol/L的Apt，室温下孵化4 h；将产物转移到50 mL的容量瓶中，定容至刻度线；
（2）hemin@HKUST-1-互补链DNA的制备：称取30 mg利用溶剂热法制备的hemin@HKUST-1于10 mL10 mg/mL 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺中，在室温下孵化20 min；将100 μL 0.8 μmol/L cDNA1加入上述溶液中，室温下孵化4 h；将产物转移到50 mL的容量瓶中，定容至刻度线；
（3）hemin@HKUST-1-互补链DNA-适配体-磁性海藻酸钠的制备：移取8 mL上述的适配体-磁性海藻酸钠分散液于50 mL离心管中，并向离心管中加入5 mL上述的hemin@HKUST-1-互补链DNA，然后将该离心管至于37 ºC恒温震振荡箱中振荡反应4 h；在外磁场下磁性分离，得到最终双功能化磁性海藻酸钠复合材料。
实施例4
双功能化磁性海藻酸钠复合材料应用于化学发光检测甲胎蛋白的方法，具体的检测过程如下：将制备的双功能化磁性海藻酸钠复合材料置于甲胎蛋白样品中，室温下孵化2 h，使得甲胎蛋白与适配体充分识别和结合，形成甲胎蛋白@适配体-磁性海藻酸钠，此时hemin@HKUST-1-互补链DNA得到释放；用磁铁吸附样品液中的甲胎蛋白@适配体-磁性海藻酸钠，上清液中仅存在被释放下来的hemin@HKUST-1-互补链DNA；hemin@HKUST-1-互补链DNA经过进样管进入化学发光检测系统，催化鲁米诺-过氧化氢-氢氧化钠的化学发光反应，产生化学发光I，以此实现对甲胎蛋白的检测。
双功能化磁性海藻酸钠复合材料应用于化学发光检测甲胎蛋白，得到最佳实验条件为：35 r/min的主泵泵速，25 r/min的副泵泵速，0.05 mol/L的氢氧化钠溶液，0.03 mol/L的过氧化氢溶液和1.6 × 10-4 mol/L的鲁米诺溶液；工作曲线的线性方程为I =182.10lnc + 21878.79，（R 2 = 0.997），线性范围为1.0 × 10-15 ~ 1.0 × 10-11 mg/mL，检出限为2.63 × 10-16 mg/mL；同时该检测方法表现出优异的选择性、稳定性和重现性；血清样品中甲胎蛋白检测的回收率为97% ~ 105%，相对标准偏差小于3.1%，说明该测定方法具有好的准确度和精密度。

Claims (5)

1.一种识别和催化双功能化磁性海藻酸钠复合材料的制备方法，其特征是，在于该方法具有以下工艺步骤：
（1）适配体-磁性海藻酸钠的制备：移取0.1 ~ 0.3 mol水热法制备的Fe3O4胶体于三颈烧瓶中，加入20 ~ 25 mL质量分数为2%的海藻酸钠溶液和40 ~ 50 mL超纯水；将该烧瓶置于40ºC的油浴中反应3 ~ 5 h；再向该烧瓶中加入8 ~ 10 mL 质量分数为25%的戊二醛，继续搅拌3 ~ 5 h；反应结束后，在外磁场下磁性分离，得到戊二醛交联的磁性产物；将上述磁性产物分散于100 mL超纯水中，向其中加入0.3 ~ 0.5 g 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺和1.3 ~ 1.5 g N-羟基琥珀酰亚胺，并在室温下反应30 ~ 50 min；加入100 μL0.3 ~ 0.6 μmol/L的适配体，室温下孵化2 ~ 4 h；将产物转移到50 mL的容量瓶中，定容至刻度线；
（2）hemin@HKUST-1-互补链DNA的制备：称取20 ~ 30 mg利用溶剂热法制备的hemin@HKUST-1分散在10 mL 8 ~ 10 mg/mL的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺中，在室温下孵化10 ~ 20 min；将100 μL 0.6 ~ 0.8 μmol/L的互补链DNA1加入到上述溶液中，室温下孵化2 ~ 4 h；将产物转移到50 mL的容量瓶中，定容至刻度线；
（3）hemin@HKUST-1-互补链DNA-适配体-磁性海藻酸钠的制备：移取5 ~ 10 mL上述（1）中制备的适配体-磁性海藻酸钠分散液于50 mL离心管中，并向离心管中加入3 ~ 5 mL上述（2）中制备的hemin@HKUST-1-互补链DNA分散液，然后将该离心管至于室温下振荡反应2 ~4 h；在外磁场下磁性分离，得到最终双功能化磁性海藻酸钠复合材料。
2.根据权利要求1所述的一种识别和催化双功能化磁性海藻酸钠复合材料的制备方法，其特征是：步骤（3）中通过碱基互补配对作用即可将步骤（1）和步骤（2）的合成物复合在一起，且室温下进行，操作简单。
3.根据权利要求1所述的一种识别和催化双功能化磁性海藻酸钠复合材料的制备方法，其特征是：该复合材料对甲胎蛋白有高特异性识别能力。
4.一种识别和催化双功能化磁性海藻酸钠复合材料用于化学发光检测甲胎蛋白的方法，检测原理如下：
将制备的一种识别和催化双功能化磁性海藻酸钠复合材料置于甲胎蛋白样品中，室温下孵化2 ~ 4 h，使得甲胎蛋白与适配体充分识别和结合，形成甲胎蛋白@适配体-磁性海藻酸钠，此时hemin@HKUST-1-互补链DNA得到释放；用磁铁吸附样品液中的甲胎蛋白@适配体-磁性海藻酸钠，上清液中仅存在被释放下来的hemin@HKUST-1-互补链DNA；hemin@HKUST-1-互补链DNA经过进样管进入化学发光检测系统，催化鲁米诺-过氧化氢-氢氧化钠的化学发光反应，产生化学发光，以此实现对甲胎蛋白的检测。
5.根据权利要求4所述的一种识别和催化双功能化磁性海藻酸钠复合材料用于化学发光检测甲胎蛋白的方法，其特征是：通过改变适配体的种类，可以实现不同目标物的检测。
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