CN102879582A - 一种对甲胎蛋白检测的磁性分离体外夹心免疫分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分析测试领域，构建一种对甲胎蛋白检测的磁性分离体外夹心免疫分析方法。所述的体外夹心免疫方法是通过磁性探针捕获甲胎蛋白抗原和量子点固定的信号探针夹心形成具有磁性分离特性的夹心免疫复合物。所述的体外夹心免疫分析方法对甲胎蛋白的检测是构建免疫传感器实现对目标物质的检测。所述的构建的免疫传感器包含基底电极，在基底电极表面修饰已经制备好的具有磁性的夹心免疫复合物，通过不同浓度的甲胎蛋白抗原对应的量子点的量不同，则相应的电致化学发光信号不同，由此可以实现对甲胎蛋白的定量分析。本发明的基于磁性的体外夹心免疫分析方法具有高的灵敏度了，良好的抗干扰性，其检测方法容易，样品前处理简单能够适应高灵敏度的检测分析血清样品中甲胎蛋白的含量。

Description

一种对甲胎蛋白检测的磁性分离体外夹心免疫分析方法

技术领域

本发明涉及到甲胎蛋白的检测分析，是基于一种体外夹心的免疫分析方法结合磁性纳米粒子分离技术通过电致化学发光分析方法进行定量分析，构建一个高灵敏度，高选择性的磁性分离电致化学发光免疫传感器，实现对甲胎蛋白的检测。

背景技术

甲胎蛋白是肝癌的特异性标志物，诊断原发性肝癌，检测甲胎蛋白的含量是其重要的手段之一。正常人体内甲胎蛋白含量偏高会可能与慢性肝炎，先天性胆管闭塞，畸形胎儿，生殖细胞肿瘤这些疾病相关，因此早期筛查，早期诊断是非常有必要的在预防其可能造成的负面影响。

目前，对甲胎蛋白的检测主要有以下分析方法：联酶免疫分析，放射性免疫分析，荧光免疫分析，化学发光免疫分析等。但是上述的一些仪器分析方法操作复杂，依赖大型昂贵的仪器，且样品前处理过程繁琐，耗时长，仪器的操作需要专业技术人员进行。化学发光免疫分析随虽仪器设备要求简单，测定线性范围宽的特点，但是无法克服其选择性差，对样品检测不灵敏的缺陷。

当前对肿瘤标志物的检测要求逐步提高，因此建立一种高灵敏，快速，前处理操作简单且干扰小的分析检测方法，为检测甲胎蛋白成为一种迫切的需要。电致化学发光免疫分析基于此种需要逐渐被公众所接受。电致化学发光(Electrochemiluminescence，ECL)是在化学发光基础上发展起来的一种新的检测技术，通过电极对含有化学发光物质的体系施加一定的电压或者电流，使发光物质受激发并跃迁回基态而发出光子，因此电化学发光具有电化学优良的选择性和化学发光的高灵敏度的优点。基于以上所述电致化学发光优良性质，构建电致化学发光免疫传感器，建立相关电致化学发光免疫分析方法应用到实际分析检测。

磁性纳米粒子既具有纳米材料的特性同时兼具有磁性响应，在蛋白质分离方面得到广泛应用，大大简化了样品的前处理过程。经过改性的磁性纳米粒子，表面带有大量SH-，NH₂-等功能基团，易于与其他物质偶联作用，应用到样品分离中。

本发明在磁性纳米粒子表面形成纳米金壳层，通过纳米金对抗体的固定，在试管内进行夹心免疫反应，磁性分离，筛选出标记有信号标签的夹心免疫复合物，极大的简化了免疫夹心复合物的分离过程，信号标签的信号扩增作用进一步提高了其检测的灵敏度，为检测血清中AFP提供一个高灵敏度，高选择性，快速分离的分析检测方法。

发明内容

本发明的目的在于构建一种高灵敏度，简单快速，高选项性的检测血清中甲胎蛋白的免疫传感器。

本发明所要解决的问题是，传统的构建免疫传感器一般是通过层层组装的过程，耗时长，而且在构建过程中容易受到外部条件的干扰，导致传感器在检测某一目标物质时重现性差，信号不稳定。通过磁性纳米粒子固定抗体与抗原和信号标签形成夹心免疫复合物，基于磁性的分离技术简化传感器构建过程，通过电致化学发光免疫分析实现对甲胎蛋白的检测。

本发明通过以下技术方案实现：

一种结合磁性分离的体外夹心免疫传感器的构建包括基底电极，其特征在于所述的基底电极是在电极表面修饰了通过磁性分离筛选的带有信号标签的夹心免疫复合物。带有信号标签的夹心免疫复合物的构建包括，捕获探针，其特征在于磁性纳米粒子对甲胎蛋白抗体的固定(一抗)，形成捕获探针，然后通过抗体/抗原之间的键合作用，将甲胎蛋白抗原结合到磁性纳米粒子固定的一抗上面。信号标签，其特征是通过信号物质(量子点)与甲胎蛋白抗体结合(二抗)，在二抗上面标记有量子点的信号标签。将已经捕获的甲胎蛋白抗原的捕获探针与信号标签一起温育构建形成捕获探针-抗原-信号标签夹心免疫复合物。

所述的基底电极为玻碳电极。

本发明提供的一种结合磁性分离的体外夹心免疫传感器对甲胎蛋白的特异性分析检测，其技术方案如下：

(1)具有磁性的捕获探针的制备：称取20mg磁性纳米Fe₃O₄-Au超声分散15～20min在pH为7.4的PBS缓冲溶液中，制备成均匀分散的1mg mL^-1Fe₃O₄-Au/PBS分散液。吸取1mL与50μg mL^-1的甲胎蛋白抗体(Ab1)，在4℃的温度下混合搅拌24h，加入1mL1％牛血清蛋白(BSA)封闭其他未结合抗体的活性位点。磁性分离洗涤未被磁性纳米Fe₃O₄-Au固定的Ab1，洗涤过后重新分散在1mL pH7.4的PBS溶液中。得到具有磁性的捕获探针(Fe₃O₄-Au/Ab1)；

(2)磁性捕获探针捕获甲胎蛋白抗原：上述制备的磁性捕获探针用于甲胎蛋白抗原(AFP)的捕获。首先在上述捕获探针溶液中加入1mL50μgmL^-1的AFP在4℃的温度下搅拌24h，然后通过磁性分离洗涤将未被磁性探针捕获的AFP洗脱，得到磁性捕获探针捕获AFP的复合物(Fe₃O₄-Au/Ab1/AFP)；

(3)信号标签的制备：信号标签是基于量子点CdS-Au复合材料固定的甲胎蛋白抗体(Ab2)构建的能够发射光信号的复合物。首先是吸取5mg mL^-1的CdS-Au分散溶液1mL(分散在pH7.4的PBS中)，然后和1mL50μg mL^-1的Ab2在4℃温度下搅拌24h，离心分离得到信号标签CdS-Au/Ab2；

(4)夹心免疫复合物的制备：将上述Fe₃O₄-Au/Ab1/AFP和CdS-Au/Ab2在室温下(20℃)搅拌60min，通过磁性洗涤分离未与磁性捕获探针的信号标签，然后重新分散在50μLpH7.4的PBS溶液中，得到Fe₃O₄-Au/Ab1/AFP/Ab2/CdS-Au夹心免疫复合物；

(5)玻碳电极的处理：选用的玻碳电极为柱状结构，其工作区域直径为3mm，分别用1.0，0.5，0.3μm的氧化铝粉末乳液抛光，然后在乙醇和蒸馏水中分别超声10min；

(6)免疫传感器的构建：吸取上述制备好的Fe₃O₄-Au/Ab1/AFP/Ab2/CdS-Au夹心免疫复合物10μL涂覆在已经处理好的玻碳电极工作区域表面，自然干燥，得到免疫传感器；

(7)电致化学发光检测构件：免疫传感器，参比电极(Ag/AgCl)，对电极(铂丝电极)组成三电极体系；电解池，电化学工作站以及光电倍增管；

(8)反应体系：0.1mol/L的KCl溶液中含有0.1mol/L PBS(pH＝7.4)和0.1mol/L K₂S₂O₈。

上述的基于磁性分离的体外免疫分析方法可以用于甲胎蛋白的检测。该方法通过磁性分离技术，结合电致化学发光高灵敏度，在模拟环境中构建形成免疫夹心复合物，简化了前处理过程，实现快速简单高效的对目标物质的检测。当溶液中甲胎蛋白抗原浓度越高，标记的信号源物质(CdS-Au)越多，这样电致化学发光信号会越强，由此建立基于磁性分离的体外免疫分析方法。

本发明在构建一种对甲胎蛋白的高选择性，高灵敏度，简单快速的传感器的基础之上还涉及到基于上述传感器对甲胎蛋白的分析方法，包含以下步骤：

(1)甲胎蛋白抗原标准溶液的配制：配置一组含雌激素的标准溶液，其浓度分布为：0.5pg mL^-1～5.0×10^-6ng mL^-1；

(2)不同浓度甲胎蛋白抗原的免疫夹心复合物的制备：按照上述技术方案所述步骤(1)～(4)制备不同浓度的甲胎蛋白免疫夹心复合物；

(3)分析测试：将上述步骤(2)所得到的不同浓度甲胎蛋白免疫夹心复合物吸取10μL涂覆在工作电极表表面，自然晾干，制备成为免疫传感器。将所得传感器在0.1mol/L的KCl溶液中含有0.1mol/L PBS(pH＝7.4)和0.1mol/LK₂S₂O₈中扫描电致化学发光信号，记录不同浓度的甲胎蛋白免疫夹心复合物的电致化学发光信号。所述的扫描电致化学发光信号条件为：扫描范围-1.4～0.2V；扫描速率，100mV/s；灵敏度，1.0×10^-5；

(4)建立标准曲线：根据不同浓度甲胎蛋白对应的电致化学发光信号强度为I_s，空白样品响应强度为I₀，根据响应电流的增加值ΔI(ΔI＝I_s-I₀)的对数与溶液中甲胎蛋白浓度C的对数成正比，绘制logΔI-logC标准曲线，得到线性回归方程

(5)血清样品中AFP的测定：根据不同血清样品，按照100～1000倍数稀释，然后按照步骤(2)～(3)的过程测试血清样品中AFP对应的电致化学发光信号I_x，通过I_x与标准曲线可以计算得出血清样品中AFP浓度。

本发明的基于磁性分离的体外免疫夹心的分析方法基于以下原理。

所述的免疫传感器是基于一种磁性分离的体外夹心免疫方法构建，通过磁性纳米材料构建的磁性捕获探针，简化了样品的前处理与分离过程。量子点标记的信号探针作为信号源物质，与捕获探针一起通过抗体/抗原之间特殊的作用力构建免疫夹心复合物，磁性的分离技术与简单的修饰步骤构建成为针对甲胎蛋白抗原特异性的，高灵敏度，快速检测的免疫传感器。磁性纳米材料优越的磁性分离性能，纳米金良好的生物兼容性能与信号扩增作用，通过电致化学发光的分析方法，实现对甲胎蛋白抗原的检测。

为进一步说明本发明的特点和效果，在附图中说明相关构件的功能和检测方法。

附图说明

图1不同修饰过程的电致化学发光响应信号，曲线a是裸电极的电致化学发光响应；曲线b是Fe₃O₄-Au/Ab1/AFP修饰电极的电致化学发光响应；曲线c是Fe₃O₄-Au/Ab1/AFP/Ab2/CdS的电致化学发光响应；曲线d是Fe₃O₄-Au/Ab1/AFP/Ab2/CdS-Au的电致化学发光响应。

图2本发明的基于磁性分离的体外夹心免疫分析方法构建的免疫传感器对不同浓度的AFP的电致化学发光响应曲线：(a)0，(b)0.0005，(c)0.001，(d)0.002，(e)0.005，(f)0.01，(g)0.02，(h)0.05，(i)0.1，(j)0.2，(k)0.5，(1)1.0，(m)2.0，(n)5.0ng/mL。

图3电致化学发光响应信号ΔI的对数值与甲胎蛋白浓度的对数值标准曲线图。

具体实施方式

下面就具体结合实例对本发明的进行详细描述：

本发明检测血清样品中甲胎蛋白，由免疫传感器，电解池，数据输出、采集和处理系统组成。

以下实例中使用的电化学工作站与光电倍增管为西安瑞迈仪器有限公司电化学工作站(MPI-B型号)，三电极体系包括工作电极，参比电极(Ag/AgCl)，辅助电极(铂丝电极)，各电极通过一个橡胶板固定在同一个平面上。工作电极为夹心免疫复合物修饰的传感器。

实施例1基于磁性分离的体外夹心免疫传感器的制备

一种分离富集并且用于甲胎蛋白抗原检测的免疫传感器的制备是基于一种磁性纳米材料构建的磁性捕获探针和量子点标记的信号探针形成的免疫夹心复合物修饰电极实现。

其制备方法如下：

(1)磁性捕获探针的制备：称取20mg磁性纳米Fe₃O₄-Au超声分散15～20min在pH为7.4的PBS缓冲溶液中，制备成均匀分散的1mg mL^-1Fe₃O₄-Au/PBS分散液。吸取1mL与50μg mL^-1的甲胎蛋白抗体(Ab1)，在4℃的温度下混合搅拌24h，加入1mL1％牛血清蛋白(BSA)封闭其他未结合抗体的活性位点。磁性分离洗涤未被磁性纳米Fe₃O₄-Au固定的Ab1，洗涤过后重新分散在1mL pH7.4的PBS溶液中。得到具有磁性的捕获探针(Fe₃O₄-Au/Ab1)；

(2)磁性捕获探针捕获甲胎蛋白抗原：上述制备的磁性捕获探针用于甲胎蛋白抗原(AFP)的捕获。首先在上述捕获探针溶液中加入1mL50μg mL^-1的AFP在4℃的温度下搅拌24h，然后通过磁性分离洗涤将未被磁性探针捕获的AFP洗脱，得到磁性捕获探针捕获AFP的复合物(Fe₃O₄-Au/Ab1/AFP)；

(3)信号标签的制备：信号标签是基于量子点CdS-Au复合材料固定的甲胎蛋白抗体(Ab2)构建的能够发射光信号的复合物。首先是吸取5mg mL^-1的CdS-Au分散溶液1mL(分散在pH7.4的PBS中)，然后和1mL50μg mL^-1的Ab2在4℃温度下搅拌24h，离心分离得到信号标签CdS-Au/Ab2；

(4)夹心免疫复合物的制备：将上述Fe₃O₄-Au/Ab1/AFP和CdS-Au/Ab2在室温下(20℃)搅拌60min，通过磁性洗涤分离未与磁性捕获探针的信号标签，然后重新分散在50μLpH7.4的PBS溶液中，得到Fe₃O₄-Au/Ab1/AFP/Ab2/CdS-Au夹心免疫复合物；

(5)免疫传感器的构建：吸取上述制备好的Fe₃O₄-Au/Ab1/AFP/Ab2/CdS-Au夹心免疫复合物10μL涂覆在已经处理好的玻碳电极工作区域表面，自然干燥，得到免疫传感器。

实施例2几种不同修饰电极的电致化学发光响应比较

不同修饰电极的电致化学发光响应信号比较研究，其结果如图1。裸电极(曲线a)在0.1mol/L的KCl中含有0.1mol/L PBS(pH＝7.4)和0.1mol/LK₂S₂O₈溶液中，其电致化学发光响应信号很弱；电极表面修饰有Fe₃O₄-Au/Ab1/AFP(曲线b)后，其电致化学发光信号同样很弱，这是因为电极表面以及修饰的复合物均没有发光信号源物质，故电致发光信号很弱，是背景信号；当电极表面修饰有Fe₃O₄-Au/Ab1/AFP/Ab2/CdS(曲线c)其电致化学发光信号明显增大，这是带有信号源物质的夹心免疫复合物修饰到电极表面，通过施加的电压产生电致化学发光信号；在Fe₃O₄-Au/Ab1/AFP/Ab2/CdS-Au(曲线d)修饰到电极表面后，电致化学发光信号进一步增加，显示出CdS-Au的优越性能，纳米金良好的导电性能与信号扩增作用，将电致化学发光信号明显增强。

实施例3一种基于磁性分离的体外夹心免疫对甲胎蛋白抗原检测方法的建立

配制标准甲胎蛋白抗原溶液，浓度分布为0～5.0ng/mL；首先将已经抛光处理的裸电极在0.1mol/L的KCl中含有0.1mol/L PBS(pH＝7.4)和0.1mol/LK₂S₂O₈溶液中扫描背景信号，记录信号强度I₀；然后按照上述建立标准曲线步骤测定不同浓度的甲胎蛋白抗原对应的电致化学发光信号强度值，其扫描溶液均相同即：0.1mol/L的KCl中含有0.1mol/L PBS(pH＝7.4)和0.1mol/L K₂S₂O₈溶液，不同甲胎蛋白抗原对应的电致化学发光信号强度分别记录为I₁，I₂，I₃…，如图2所示。上述实验都是在同样的实验条件下进行，实验条件设置为：扫描范围，-1.4～0.2V；扫描速率，100mV/s；灵敏度，1.0×10^-5。

结果表明，随着甲胎蛋白浓度的增加，其检测信号逐渐增大，定义裸电极电致化学发光信号I₀(空白背景信号)，在含不同浓度的甲胎蛋白电致化学发光检测信号其响应值为I_x(I₁，I₂，I₃…)，则电致化学发光响应信号强度增加值ΔI(ΔI＝I_x-I₀)的对数与甲胎蛋白浓度(0.0005～5.0ng/mL)的对数成正比。

绘制logΔI-log C标准工作曲线如图3所示。其线性回归方程为：

logΔI＝2.7638+0.2906log C(mg/mL)

以大于3倍噪声信号的电流信号浓度为最低检测限，上述实验方法最低检测限为0.2pg/mL(n＝5)。

实施例4实际血清样品的检测

根据上述实施例3所建立的方法，采用本发明的方法测定实际血清样品中甲胎蛋白的含量，采用标准曲线法进行定量，并且与商品化的酶联免疫分析方法进行比较，结果如表1所示。

(1)取3个不同的血清样品，编号A1，A2，A3，分别将A1稀释100，1000，10000倍；A2和A3稀释1000倍。按照上述传感器构建方法与实施例3所建立的分析方法测定样品中所含甲胎蛋白浓度。将A1，A2，A3不经过稀释，通过商品化的酶联免疫分析方法检测其甲胎蛋白浓度，结果如表1所示。

^a，b，c分别为：稀释10000，1000，100倍的样品。

Claims (7)

1.一种对甲胎蛋白检测的磁性分离体外夹心免疫分析方法，该检测方法步骤如下：a，磁性探针的制备；b，信号标签的制备；c，磁性探针捕获甲胎蛋白抗原；c，具有磁性的免疫夹心复合物的制备；d，免疫传感器的制备；e，通过电致化学发光方法检测信号。

2.根据权利要求1所述的一种对甲胎蛋白检测的磁性分离体外夹心免疫分析方法，其特征在于，通过磁性的分离技术，能够在复杂的样品环境中快速分离目标物，其磁性探针的制备必须是在4℃的环境中，这样避免其他物质干探针的制备。

3.根据权利要求1所述的一种对甲胎蛋白检测的磁性分离体外夹心免疫分析方法，其特征在于，信号标签制备材料是量子点复合纳米材料CdS-Au，其性质优于纯的CdS信号标签。

4.根据权利要求1所述的一种对甲胎蛋白检测的磁性分离体外夹心免疫分析方法，其特征在于，具有磁性的免疫夹心复合物的制备需控制溶液的pH为8.0，在该pH的条件下，形成的夹心免疫复合物稳定。

5.根据权利要求1所述的一种对甲胎蛋白检测的磁性分离体外夹心免疫分析方法，其特征在于，在通过电致化学发光检测过程中所用的底液pH必须控制在pH为7.4，其电致化学发光效率稳定。

6.根据权利要求1所述的一种对甲胎蛋白检测的磁性分离体外夹心免疫分析方法，其特征在于，所述修饰电极原基底电极是常见的玻碳电极，工作区域直径为3mm，通过导线与连同参比电极和对电极与控制系统连接，构成三电极系统。

7.根据权利要求1所述的一种对甲胎蛋白检测的磁性分离体外夹心免疫分析方法，其特征在于，参比电极和对电极分别是Ag/AgCl电极和铂丝电极。

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