CN104677892A - 一种基于负载石墨相氮化碳电化学发光生物传感界面的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于负载石墨相氮化碳电化学发光生物传感界面的制备方法及应用,涉及纳米科学、生物免疫技术、电化学传感等领域。本发明利用石墨相氮化碳纳米片优异的电化学发光性能和纳米多孔金独特的三维多孔结构及良好的生物相容性,将石墨相氮化碳纳米片负载在纳米多孔金骨架中,用于构建无标记电化学发光生物传感界面。三维多孔结构使石墨相氮化碳纳米片的发光性能大大提高,同时纳米多孔金良好的生物相容性实现了生物识别单元的简单快速固定。该方法不仅步骤简单,操作容易,而且具有较高的发光稳定性及良好的响应性能,解决了常规方法步骤繁琐、信号重现性差等问题。该方法可以适用于多种生物标志物电化学发光生物传感界面的制备,在科研和临床中具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及纳米科学、生物免疫技术、电化学传感等领域,具体涉及一种基于负载石墨相氮化碳电化学发光生物传感界面的制备方法及应用。
背景技术
生物标志物检测是目前唯一无创的早期预警癌症等疾病的方法,在临床中对肿瘤的普查、诊断及判断预后等具有十分重要的意义。在众多的生物标志物检测方法中,电化学发光免疫分析是目前最先进的免疫测定技术,具有操作简便、样品量少、快速灵敏、成本低廉且易于实现微型化等优点,在临床和科研中得到了广泛应用。
早期的电化学发光免疫传感器通常通过对抗原或抗体等生物分子进行标记来检测信号,但标记过程复杂,操作费时,并且生物分子容易失活。因此基于具有良好发光性能的纳米材料构建的无标记型电化学发光传感器引起了人们极大的研究兴趣。无标记型电化学发光传感器具有步骤简单、方便快速、重现性好等优点,具有良好的应用前景。
具有稳定发光性能和良好生物相容性的传感界面制备是构建无标记型电化学发光传感器的关键。石墨相氮化碳纳米片是一种具有良好发光性能的二维纳米材料,近来被用于构建电化学发光传感器,与传统半导体发光纳米材料相比,具有合成简单,成本低廉,生物相容性好等特点。但依然存在石墨相氮化碳纳米片修饰困难、缺乏简单而有效的标记方法等问题。传统的发光材料在电极上固定方法一般采用壳聚糖等成膜物质进行固定,但成膜物质较差的导电性使材料的发光性能大大降低,同时生物分子识别单元的固定需要复杂的修饰过程。
本发明利用石墨相氮化碳纳米片优异的电化学发光性能和纳米多孔金独特的三维多孔结构及良好的生物相容性,将石墨相氮化碳纳米片负载在纳米多孔金骨架中,用于构建无标记电化学发光生物传感界面。三维多孔结构使石墨相氮化碳纳米片的发光性能大大提高,同时纳米多孔金良好的生物相容性实现了生物识别单元的简单快速固定,避免了对石墨相氮化碳纳米片进行功能化修饰和共价标记,实现对生物标志物的电化学发光免疫分析。
经对现有技术文献的检索发现, CN103771565A公开了一种氮化碳/二氧化钛纳米管的复合电极的制备方法。CN103713030A公开了一种石墨型氮化碳纳米棒修饰电极的制备方法。CN103219503A公开了一种复合电极材料及其制备方法。CN103021662A公开了一种超级电容器用纳米多层介孔金属氮化物/石墨烯复合材料及其制备方法。CN101728085A公开了一种碳复合金属氮化物电极材料及非对称电化学超级电容器。以上技术文献均未涉及电化学发光传感分析。CN104014370A公开了一种过氧化物模拟酶、制备及其应用,未涉及石墨相氮化碳纳米片自身的发光性能及纳米多孔金的使用。
CN104034777A公开了一种基于三维纳米多孔金修饰硼掺杂金刚石电极的电化学生物传感器的制备及应用。CN103698509A公开了一种基于纳米多孔金片电极的电化学免疫传感器对巯基乙酸的检测方法。CN102072895A公开了一种检测痕量抗生素残留的量子点修饰纳米多孔金碳糊电极电致化学发光传感器。以上技术文献均未涉及石墨相氮化碳纳米片用于构建电化学发光传感器。
发明内容
本发明的目的之一是提供简单易行的无标记型电化学发光传感界面的制备方法,解决电极修饰步骤复杂、重现性差等问题。
本发明的目的之二是提供快速、低成本、通用的生物标志物检测方法,为电化学发光免疫传感器在临床中的应用提供技术基础。
一种基于负载石墨相氮化碳电化学发光生物传感界面的制备方法及应用,包括以下步骤:
(1)负载型石墨相氮化碳的制备:将1 mL纳米多孔金的乙醇分散液(1~2.5 mg·mL-1)与1 mL石墨相氮化碳纳米片的水溶液(0.2~1 mg·mL-1)混合,振荡2~4小时,离心去掉上清液,加入1 mL超纯水,超声1~2小时,制得负载型石墨相氮化碳的纳米复合物溶液;
所述的纳米多孔金为用金银合金薄膜进行脱合金的方法制备的具有三维双连续多孔结构的纳米多孔金;所用合金薄膜的金银质量比为1:1,用浓硝酸进行腐蚀;
所述的石墨相氮化碳纳米片制备过程为:用三聚氰胺作为前驱体通过550℃高温缩聚反应制备石墨相氮化碳,然后将100 mg石墨相氮化碳在100 mL超纯水中超声剥离10~24小时,5000转离心去掉未剥离的石墨相氮化碳,制得石墨相氮化碳纳米片的水溶液。
(2)电极的修饰:用移液枪将3~10 µL步骤(1)制得的纳米复合物溶液滴涂在处理、活化好直径为3 mm或4 mm的玻碳电极表面,室温晾干。
(3)捕获抗体固定:用移液枪将5~8 µL生物标志物抗体溶液(10 µg·mL-1)滴涂在步骤(2)制得的电极表面,4℃条件下晾干;所述的生物标志物为人免疫球蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原、糖蛋白抗原、甲胎蛋白、乳腺癌易感基因中的一种。
(4)非特异性位点封闭:用超纯水多次冲洗步骤(3)制得的电极,用移液枪将6 µL质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液滴涂在步骤(3)制得的电极表面,4℃条件下晾干,即制得一种电化学发光生物传感界面。
(5)用超纯水多次冲洗构建的电化学发光生物传感界面,用移液枪滴涂5 µL生物标志物标准溶液或未知样品溶液,4℃条件下晾干后作为工作电极,Ag/AgCl电极作为参比电极,Pt电极作为对电极,用pH为7.4的PBS缓冲溶液配制的20 mmol·mL-1的K2S2O8溶液作为底液,在电化学发光工作站上以循环伏安模式测定-1.2~0 V电势下的发光信号,实现对生物标志物的检测。
与现有技术相比,本发明具有如下优点:
(1)该界面制备方法不仅步骤简单,操作容易,成本低廉,而且具有较高的发光稳定性及良好的响应性能,解决了纳米材料常规固定方法困难、缺乏简单而有效的功能化方法等问题;
(2)纳米多孔金良好的生物相容性实现了生物识别单元的简单快速固定,避免了复杂的抗体固定过程及由此引起的失活问题。
(3)该方法可以适用于多种生物标志物电化学发光生物传感器的制备,在科研和临床中具有广泛的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
1
(1)负载型石墨相氮化碳的制备:将金银质量比为1:1的金银合金薄膜用浓硝酸进行腐蚀,制备具有三维双连续多孔结构的纳米多孔金,分散于乙醇中;将5 g三聚氰胺通过550℃高温缩聚反应制备石墨相氮化碳,然后将100 mg石墨相氮化碳在100 mL超纯水中超声剥离24小时,5000转离心去掉未剥离的石墨相氮化碳,制得石墨相氮化碳纳米片的水溶液;将1 mL纳米多孔金的乙醇分散液(1.5 mg·mL-1)与1 mL石墨相氮化碳纳米片的水溶液(0.4 mg·mL-1)混合,振荡2小时,离心去掉上清液,加入1 mL超纯水,超声2小时,制得负载型石墨相氮化碳的纳米复合物溶液。
(2)电极的修饰:用移液枪将6 µL步骤(1)制得的纳米复合物溶液滴涂在处理、活化好直径为4 mm的玻碳电极表面,室温晾干。
(3)捕获抗体固定:用移液枪将5 µL人免疫球蛋白抗体溶液(10 µg·mL-1)滴涂在步骤(2)制得的电极表面,4℃条件下晾干。
(4)非特异性位点封闭:用超纯水多次冲洗步骤(3)制得的电极,用移液枪将6 µL质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液滴涂在步骤(3)制得的电极表面,4℃条件下晾干。
(5)用超纯水多次冲洗构建的电化学发光生物传感界面,用移液枪滴涂5 µL人免疫球蛋白标准溶液或未知样品溶液,4℃条件下晾干后作为工作电极,Ag/AgCl电极作为参比电极,Pt电极作为对电极,用pH为7.4的PBS缓冲溶液配制的20 mmol·mL-1的K2S2O8溶液作为底液,在电化学发光工作站上以循环伏安模式测定-1.2~0 V电势下的发光信号,实现对人免疫球蛋白的检测。
实施例
2
(1)负载型石墨相氮化碳的制备:将金银质量比为1:1的金银合金薄膜用浓硝酸进行腐蚀,制备具有三维双连续多孔结构的纳米多孔金,分散于乙醇中;将5 g三聚氰胺通过550℃高温缩聚反应制备石墨相氮化碳,然后将100 mg石墨相氮化碳在100 mL超纯水中超声剥离24小时,5000转离心去掉未剥离的石墨相氮化碳,制得石墨相氮化碳纳米片的水溶液;将1 mL纳米多孔金的乙醇分散液(2.0 mg·mL-1)与1 mL石墨相氮化碳纳米片的水溶液(0.6 mg·mL-1)混合,振荡2小时,离心去掉上清液,加入1 mL超纯水,超声3小时,制得负载型石墨相氮化碳的纳米复合物溶液。
(2)电极的修饰:用移液枪将6 µL步骤(1)制得的纳米复合物溶液滴涂在处理、活化好直径为4 mm的玻碳电极表面,室温晾干。
(3)捕获抗体固定:用移液枪将5 µL甲胎蛋白抗体溶液(10 µg·mL-1)滴涂在步骤(2)制得的电极表面,4℃条件下晾干。
(4)非特异性位点封闭:用超纯水多次冲洗步骤(3)制得的电极,用移液枪将6 µL质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液滴涂在步骤(3)制得的电极表面,4℃条件下晾干。
(5)用超纯水多次冲洗构建的电化学发光生物传感界面,用移液枪滴涂5 µL人甲胎蛋白标准溶液或未知样品溶液,4℃条件下晾干后作为工作电极,Ag/AgCl电极作为参比电极,Pt电极作为对电极,用pH为7.4的PBS缓冲溶液配制的20 mmol·mL-1的K2S2O8溶液作为底液,在电化学发光工作站上以循环伏安模式测定-1.2~0 V电势下的发光信号,实现对甲胎蛋白的检测。
Claims (5)
1.一种基于负载石墨相氮化碳电化学发光生物传感界面的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)负载型石墨相氮化碳的制备:将1 mL纳米多孔金的乙醇分散液(1~2.5 mg·mL-1)与1 mL石墨相氮化碳纳米片的水溶液(0.2~1 mg·mL-1)混合,振荡2~4小时,离心去掉上清液,加入1 mL超纯水,超声1~2小时,制得负载型石墨相氮化碳的纳米复合物溶液;
(2)电极的修饰:用移液枪将3~10 µL步骤(1)制得的纳米复合物溶液滴涂在处理、活化好直径为3 mm或4 mm的玻碳电极表面,室温晾干;
(3)捕获抗体固定:用移液枪将5~8 µL生物标志物抗体溶液(10 µg·mL-1)滴涂在步骤(2)制得的电极表面,4℃条件下晾干;
(4)非特异性位点封闭:用超纯水多次冲洗步骤(3)制得的电极,用移液枪将6 µL质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液滴涂在步骤(3)制得的电极表面,4℃条件下晾干,即制得一种电化学发光生物传感界面。
2.根据权利要求1所述的一种基于负载石墨相氮化碳电化学发光生物传感界面的制备方法,其特征在于,所述的纳米多孔金为用金银合金薄膜进行脱合金的方法制备的具有三维双连续多孔结构的纳米多孔金;所用合金薄膜的金银质量比为1:1,用浓硝酸进行腐蚀。
3.根据权利要求1所述的一种基于石墨相氮化碳电化学发光生物传感界面的制备方法,其特征在于,所述的石墨相氮化碳纳米片制备过程为:用三聚氰胺作为前驱体通过550℃高温缩聚反应制备石墨相氮化碳,然后将100 mg石墨相氮化碳在100 mL超纯水中超声剥离10~24小时,5000转离心去掉未剥离的石墨相氮化碳,制得石墨相氮化碳纳米片的水溶液。
4.根据权利要求1所述的一种基于负载石墨相氮化碳电化学发光生物传感界面的制备方法,其特征在于,所述的生物标志物为人免疫球蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原、糖蛋白抗原、甲胎蛋白、乳腺癌易感基因中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种基于负载石墨相氮化碳电化学发光生物传感界面的制备方法,制备的传感界面用于生物标志物检测,其特征在于,步骤如下:用超纯水多次冲洗构建的电化学发光生物传感界面,用移液枪滴涂5 µL生物标志物标准溶液或未知样品溶液,4℃条件下晾干后作为工作电极,Ag/AgCl电极作为参比电极,Pt电极作为对电极,用pH为7.4的PBS缓冲溶液配制的20 mmol·mL-1的K2S2O8溶液作为底液,在电化学发光工作站上以循环伏安模式测定-1.2~0 V电势下的发光信号,实现对生物标志物的检测。
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