CN109060916A - 电化学传感器电极表面纳米材料修饰方法及传感器 - Google Patents

电化学传感器电极表面纳米材料修饰方法及传感器 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种电化学传感器电极表面纳米材料修饰方法及传感器，利用碳纸作为工作电极基底；在工作电极表面修饰石墨烯纳、硫堇和纳米金，形成复合生物敏感膜；在生物敏感膜上,固定特异抗体,利用抗原浓度与反应电流减小程度成正比,实现抗原检测。本发明的多层纳米敏感膜传感器，可实现高灵敏度癌症蛋白、多肽分子痕量检测。

Description

电化学传感器电极表面纳米材料修饰方法及传感器
技术领域
本发明涉及一种电化学传感器电极表面纳米材料修饰方法及传感器。
背景技术
肺癌肿瘤标志物(如CEA、NSE等)，这些蛋白和多肽癌症标志物的检测，对于癌症(比如：肺癌肿瘤)的早期诊断、早期干预治疗具有重要的实际应用价值。现有的标记性免疫分析法，包括酶联免疫分析(EL I SA)、电化学发光免疫分析、放射免疫分析等。但是，酶联免疫吸附(EL I SA)或电化学发光免疫方法，需要对抗原或抗体进行预标记处理，该种方法不能满足即时快速癌症蛋白或多肽分子检测需求。
目前临床上需要患者定期到医院采血检测，存在检测时间长以及身体损伤等问题。分析时间长、操作复杂，故不利于实现多指标的快速检测应用。
因此迫切需要提高癌症标志物免疫测定方法的特异性、敏感性、快速性，需要对癌症多参数疾病标志物进行可定量免疫测定；目前有多种手段想提高检测效果。
专利申请号为200510026780.8的“多种妇科肿瘤标志物集成检测反应板和蛋白芯片反应盒”，其描述了多抗原检测微点阵，但是其不具备癌症蛋白快速高灵敏功能。
专利申请号为201510882724.8的“一种人肿瘤抗原3HAA1g的制备方法以及酶联免疫试剂盒”，不具有本专利无标记电化学检测的癌症蛋白多参数定量检测的优点。
专利申请号为201610651218.2的“一种肿瘤蛋白的检测试剂盒”，该专利的生物敏感膜技术不具备本专利纳米复合材料敏感膜的针对痕量标志物的高灵敏特异特点。
专利申请号为201710803305的“用于α-2,3唾液酸化聚糖检测的生物传感器制备方法”，该专利生物敏感膜设计与本专利提出的修饰传感器的纳米复合材料不同，也不具备本专利的多参数检测功能。
综上所述，目前的技术不能解决痕量癌症蛋白或者多肽分子的快速灵敏多参数定量检测等技术问题，对于癌症的快速灵敏特异检测尚缺乏有效的解决方案。
发明内容
本发明为了解决上述问题，提出了一种电化学传感器电极表面纳米材料修饰方法及传感器，本发明采用碳纸电极表面纳米复合材料修饰技术，提高检测灵敏度与特异性，同时纳米敏感膜表面易于抗体固定。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种电化学传感器电极表面纳米材料修饰方法，包括以下步骤：
利用碳纸作为工作电极基底；
在工作电极表面修饰石墨烯纳、硫堇和纳米金，形成复合生物敏感膜；
在生物敏感膜上,固定特异抗体,利用抗原浓度与反应电流减小程度成正比,实现抗原检测。
进一步的，所述氧化石墨烯修饰在碳工作电极上，聚硫堇吸附到氧化石墨烯表面。
进一步的，所述纳米金金粒子与还原氧化石墨烯上的胺基反应,并且聚硫堇吸附带负电的纳米金颗粒,从而金粒子固定在电极表面。
进一步的，待检测抗原滴落在生物传感器表面,抗体与被测物抗原高特异性结合产生电场变化，阻碍电活性物质向电极表面的扩散,检测到的电流减小。
进一步的，利用电流抑制的差分伏安脉冲法检测抗体与抗原结合微弱反应电流；利用抗原浓度与反应电流降低程度成正比原理，换算得到抗原浓度。
一种电化学传感器，包括传感器本体，所述传感器本体的碳电极上端依次设置有石墨烯纳层、硫堇层和纳米金层，所述纳米金层上固定有特异抗体。
进一步的，所述硫堇层含有两个-NH2基，通过共价结合和静电作用吸附带负电的纳米金颗粒，从而形成纳米金单层。
进一步的，所述硫堇层作为电子媒介体，硫堇具有苯环结构，与石墨烯之间产生π-π堆叠的相互作用，所述硫堇吸附到还原氧化石墨烯的表面，从而固定在碳电极表面。
基于上述电传感器的检测方法，待检测抗原滴落在生物传感器表面,抗体与被测物抗原高特异性结合产生电场变化，利用电流抑制的差分伏安脉冲法检测抗体与抗原结合微弱反应电流，利用抗原浓度与反应电流降低程度成正比原理，换算得到抗原浓度。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明的多参数癌症标志物纳米复合传感器,可实现痕量癌症蛋白、多肽分子的检测。
(2)本发明的纳米复合传感器,易于固定不同种类癌症抗体,可以实现多参数癌症标志物蛋白或多肽分子检测。
(3)本发明的多层纳米敏感膜传感器，可实现高灵敏度癌症蛋白、多肽分子痕量检测。
(4)本发明的碳工作电极传感器，其成本比较低，并且容易制备，具有普适推广应用价值。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1是本发明的纳米复合材料合成的生物敏感膜结构以及抗体、抗原固定在工作电极示意图。
具体实施方式：
下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
在本发明中，术语如“上”、“下”、“左”、“右”、“前”、“后”、“竖直”、“水平”、“侧”、“底”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，只是为了便于叙述本发明各部件或元件结构关系而确定的关系词，并非特指本发明中任一部件或元件，不能理解为对本发明的限制。
本发明中，术语如“固接”、“相连”、“连接”等应做广义理解，表示可以是固定连接，也可以是一体地连接或可拆卸连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连。对于本领域的相关科研或技术人员，可以根据具体情况确定上述术语在本发明中的具体含义，不能理解为对本发明的限制。
由于待测肺癌蛋白质和多肽小分子浓度低，检测难度大，本实施例拟采用碳纸电极表面纳米复合材料修饰技术，提高检测灵敏度与特异性，同时纳米敏感膜表面易于抗体固定。
通过物理吸附和化学交联法，在碳传感器工作电极表面固定电子媒介体、纳米材料和各类抗体，实现对多种肿瘤标志物的特异捕获，进行生物信号放大，提高检测灵敏度和即时性。
一种碳工作电极上纳米复合材料修饰方法，首先，利用碳纸作为工作电极基底；
随后，在工作电极表面通过物理吸附和化学交联法修饰金纳米/硫堇/石墨烯纳米复合敏感膜；
最后，在生物敏感膜上,固定特异抗体,待检测的癌症抗原与进行结合,利用抗原浓度与反应电流减小程度成正比,达到抗原检测的目的。
纳米复合材料修饰在传感器表面(工作电极表面)，结合降低背景电流的差分脉冲伏安法，可以进行微量抗原蛋白质、多肽分子的高灵敏特异性检测。
氧化石墨烯修饰在碳工作电极上；
聚硫堇吸附到氧化石墨烯表面；
纳米金粒子与还原氧化石墨烯上的胺基反应而,并且聚硫堇也吸附带负电的纳米金颗粒,从而纳米金粒子固定在电极表面；
将处理好的碳电极放入含一定浓度的K3Fe(CN)6和支持电解质的水溶液中，进行抛光处理，碳电极表面通过物理吸附和化学交联法，在传感器碳工作电极表面固定电子媒介体、纳米复合材料和不同抗体,利用纳米金与抗体的氨基互相作用,将特异抗体通过自组装技术把特异性抗体固定在纳米复合材料表面，有效固定好。
待检测抗原滴落在生物传感器表面,抗体与被测物抗原高特异性结合产生电场变化，阻碍了电活性物质向电极表面的扩散,检测到的电流减小；
利用电流抑制的差分伏安脉冲法检测抗体与抗原结合微弱反应电流；
利用抗原浓度与反应电流降低程度成正比原理，换算得到抗原浓度。
如图1所示，纳米复合材料载体为碳纸工作电极(利用三电极工作系统：工作电极、对电极与参比电极)，其为碳工作电极表面修饰实现；
本发明利用成本低的碳工作电极作为传感器基底，在其表面上进行纳米修饰与抗体固定；
充分利用石墨烯-硫堇-纳米金电活性复合材料的纳米效应；
聚硫堇具有很好的电化学可逆性、稳定性以及快速的电子传递能力是一种良好的电子媒介体，且含有两个-NH2基，可以通过共价结合和静电作用吸附带负电的纳米金颗粒，从而形成纳米金单层；
采用硫堇作为电子媒介体，硫堇具有苯环结构，与石墨烯之间会产生π-π堆叠的相互作用，依靠这种相互作用，硫堇吸附到还原氧化石墨烯的表面，从而固定在碳电极表面；
石墨烯具备单片性、高传导性、大比表面积、抗毒性及良好的电子传度动力学等独特物理化学性质，广泛应用于电化学传感和生物传感；
制备合成纳米金粒子，纳米粒子通过与还原氧化石墨烯上的胺基反应而固定从而形成复合物，纳米金粒子用于固定特异性抗体，同时纳米金粒子具有良好的导电能力也能起到电流放大的作用；
合成的纳米复合材料修饰在电极表面，提高表面体积比和电子传递能力，对信号进行放大，以提高检测灵敏度；
使用的工作电极为碳电极，经表面处理后，然后在工作电极上成金纳米/硫堇/石墨烯纳米复合膜，之后加入抗体，通过纳米金与蛋白质的氨基作用，将抗体固定在工作电极上。
综上，本发明通过在传感电极表面电沉积技术定向修饰纳米复合材料和电活性物质，再通过自组装技术将抗体固定在纳米材料表面，通过抗体与被测物抗原高特异性结合产生电场变化，阻碍了电活性物质向电极表面的扩散，使得检测到的电流减小，从而使待测抗原浓度与检测到电流的大小成反比关系。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (9)

1.一种电化学传感器电极表面纳米材料修饰方法，其特征是：包括以下步骤：
利用碳纸作为工作电极基底；
在工作电极表面修饰石墨烯纳、硫堇和纳米金，形成复合生物敏感膜；
在生物敏感膜上,固定特异抗体,利用抗原浓度与反应电流减小程度成正比,实现抗原检测。
2.如权利要求1所述的一种电化学传感器电极表面纳米材料修饰方法，其特征是：所述氧化石墨烯修饰在碳工作电极上，聚硫堇吸附到氧化石墨烯表面。
3.如权利要求1所述的一种电化学传感器电极表面纳米材料修饰方法，其特征是：所述纳米金金粒子与还原氧化石墨烯上的胺基反应,并且聚硫堇吸附带负电的纳米金颗粒,从而金粒子固定在电极表面。
4.如权利要求1所述的一种电化学传感器电极表面纳米材料修饰方法，其特征是：待检测抗原滴落在生物传感器表面,抗体与被测物抗原高特异性结合产生电场变化，阻碍电活性物质向电极表面的扩散,检测到的电流减小。
5.如权利要求1所述的一种电化学传感器电极表面纳米材料修饰方法，其特征是：利用电流抑制的差分伏安脉冲法检测抗体与抗原结合微弱反应电流；利用抗原浓度与反应电流降低程度成正比原理，换算得到抗原浓度。
6.一种电化学传感器，其特征是：包括传感器本体，所述传感器本体的碳电极上端依次设置有石墨烯纳层、硫堇层和纳米金层，所述纳米金层上固定有特异抗体。
7.如权利要求6所述的一种电化学传感器，其特征是：所述硫堇层含有两个-NH2基，通过共价结合和静电作用吸附带负电的纳米金颗粒，从而形成纳米金单层。
8.如权利要求6所述的一种电化学传感器，其特征是：所述硫堇层作为电子媒介体，硫堇具有苯环结构，与石墨烯之间产生π-π堆叠的相互作用，所述硫堇吸附到还原氧化石墨烯的表面，从而固定在碳电极表面。
9.基于如权利要求6-8中任一项所述的电传感器的检测方法，其特征是：待检测抗原滴落在生物传感器表面,抗体与被测物抗原高特异性结合产生电场变化，利用电流抑制的差分伏安脉冲法检测抗体与抗原结合微弱反应电流，利用抗原浓度与反应电流降低程度成正比原理，换算得到抗原浓度。
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