CN102250868A

CN102250868A - 一种利用磁性离子液体复合材料固定化酶的方法

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Publication number: CN102250868A
Application number: CN2010101866662A
Authority: CN
Inventors: 郭晨; 高红帅; 江洋洋; 刘春朝; 刘会州
Original assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Current assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Priority date: 2010-05-21
Filing date: 2010-05-21
Publication date: 2011-11-23

Abstract

本发明涉及酶的固定化领域，具体地，本发明涉及一种利用磁性离子液体复合材料固定化酶的方法。根据本发明的方法包括以下步骤：1)制备磁性纳米颗粒；2)将离子液体负载至磁性纳米颗粒，得到磁性离子液体复合材料；3)使用所述磁性离子液体复合材料固定化酶。根据本发明的方法，将离子液体负载于磁性纳米载体，形成磁性离子液体复合材料固定化酶体系，不仅引入了离子液体微环境，离子液体几乎没有蒸汽压，具有绿色环保特性和可设计性，能提高酶活性及稳定性；而且磁性纳米材料作为固定化酶的载体能够有效提高催化剂的分散性。

Description

一种利用磁性离子液体复合材料固定化酶的方法

技术领域

本发明涉及酶的固定化领域，具体地，本发明涉及一种利用磁性离子液体复合材料固定化酶的方法。

背景技术

酶作为一种高效专一的生物催化剂，在21世纪工业化学的发展中占有重要的地位。这归因于酶具有专一性、反应条件温和、低污染、选择性高等优点。酶在医学、能源、食品、有机合成等与人类生活息息相关的领域中起着举足轻重的作用。传统的游离酶在应用中存在易失活、分散性差、回收难以及难以连续使用等问题。酶的固定化技术是解决这些问题的有效措施之一，固定化酶不仅保留了酶的催化特性，可以提高酶的分散性和操作稳定性，还可以实现酶的回收和连续利用，从而降低了生产中酶的投入成本。

近年来，离子液体中酶催化反应的研究逐渐受到重视。许多种酶在离子液体中的稳定性、活性、选择性都比在传统有机溶剂中高；离子液体独特的溶解性能使原来在传统有机溶剂中无法溶解而不能反应的过程能得以进行；通过改变离子液体结构能够控制催化条件；同时离子液体无蒸汽压，产物分离较传统有机溶剂更容易，过程更绿色化。

磁性纳米材料不仅具有高比表面积及良好的分散性，而且具有超顺磁。磁性纳米材料作为固定化酶的载体能够有效提高催化剂的分散性，同时易于酶催化反应后催化剂、底物、产物的分离。将离子液体负载于磁性纳米载体，形成磁性离子液体复合材料固定化酶体系，不仅引入了离子液体微环境，提高酶活性及稳定性，同时能够解决离子液体与酶的回收再生问题。此外，磁性离子液体复合材料中离子液体结构可调的特性为酶催化提供结构可设计的载体。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种利用磁性离子液体复合材料固定化酶的方法。

根据本发明的利用磁性离子液体复合材料固定化酶的方法包括以下步骤：

1)制备磁性纳米颗粒；

2)将离子液体负载至磁性纳米颗粒，得到磁性离子液体复合材料；

3)使用所述磁性离子液体复合材料固定化酶。

根据本发明的方法，优选所述纳米颗粒为Fe₃O₄纳米颗粒，可以采用共沉淀法合成磁性Fe₃O₄纳米颗粒。

根据本发明的方法，优选所述离子液体为咪唑类离子液体，该类离子液体具有以下特性：不可燃性；几乎无蒸气压，与传统有机溶剂相比，不会造成环境污染且可用于低压条件，因此被称为“绿色溶剂”；溶解能力强，能溶解许多有机化合物和无机化合物；它的极性及亲水、憎水性等可通过选择阴、阳离子而加以调控，因而又被称为“可设计性”溶剂。另外该类离子液体有两个取代基位置，可以通过修饰功能团，使其中的一个取代基与磁性颗粒相连，另一个取代基与酶相连。此时，优选所述纳米颗粒与所述咪唑类离子液体的质量比为1∶10～20。

根据本发明的方法，磁性离子液体复合材料的制备分为两类，一类是用于通过吸附来固定化酶，另一类通过共价结合固定化酶。

例如，通过吸附固定化酶磁性离子液体复合材料的制备过程具体如下：将60mmol烷基咪唑与60mmol氯丙基三乙氧基硅烷在90℃搅拌反应24h。反应结束后用乙醚反复洗涤并于室温下旋转蒸发除去乙醚得到产物1-烷基-3-丙基乙氧基硅烷基-咪唑氯盐([C_nC(S)Im]Cl，S表示硅烷基团，n表示咪唑环C1取代基团C数)，产率为96％。将60mmol 1-烷基-3-丙基乙氧基硅烷基-咪唑氯盐溶解于300mL乙腈，向混合体系中加入60mmol KPF₆(或NaBF₄)，30℃下搅拌反应三天。反应结束后，过滤除去沉淀，旋转蒸发除去乙腈。向体系中加入200mL二氯甲烷并过滤后经水洗涤至水相用AgNO₃检测不到Cl^-存在。旋转蒸发得到所需要的离子液体([C_nC(S)Im]PF₆(或[C_nC(S)Im]BF₄))。将100mg磁性纳米Fe₃O₄颗粒在甲苯中超声分散后，向体系中加入1g硅烷离子液体([C_nC(S)Im]Cl，[C_nC(S)Im]PF₆，[C_nC(S)Im]BF₄)，90℃下搅拌反应24h。反应结束后磁分离，分别用100mL乙腈和甲醇萃取洗涤两次，并真空干燥得到固体粉末并称重，得到磁性离子液体[C_nC(S)Im]Cl，[C_nC(S)Im]PF₆(或[C_nC(S)Im]BF₄)复合材料，该复合材料通过静电相互作用吸附固定化酶。

又如，通过共价结合固定化酶磁性离子液体复合纳米材料的制备过程具体如下：将100mg磁性纳米Fe₃O₄颗粒在100mL乙醇中超声分散30min后，向其中加入1g溴辛酸或溴丁酸。体系在氮气保护下超声反应15min。反应结束后，磁分离得到的固体颗粒用100mL乙腈洗涤两次，100mL甲醇洗涤两次，并真空干燥得到固体粉末。将得到的固体粉末在THF中超声分散后加入2g丁醛取代的咪唑在60℃氮气保护下反应48h。反应结束后用THF洗涤固体颗粒若干次得到磁性纳米颗粒负载的阴离子为Cl^-的离子液体。将得到的颗粒分散于乙腈，向混合体系中加入50mmolKPF₆或NaBF₄，30℃条件下搅拌反应三天。产物经去离子水洗涤若干次直至水相用AgNO₃检测不到Cl-存在。将颗粒真空干燥除水得到磁性离子液体复合纳米材料(离子液体为[C_n(A)C₄(D)Im]X，1-丁醛-3-羧酸-咪唑盐，其中A表示羧基基团，n表示其中的C数，D表示醛基基团，X表示Cl^-，BF₄ ^-，PF₆ ^-)。

根据本发明的方法，优选所述酶为脂肪酶、纤维素酶、漆酶或淀粉酶。

根据本发明的方法，将离子液体负载于磁性纳米载体，形成磁性离子液体复合材料固定化酶体系，不仅引入了离子液体微环境，离子液体几乎没有蒸汽压，具有绿色环保特性和可设计性，能提高酶活性及稳定性；同时，磁性纳米材料作为固定化酶的载体能够有效提高催化剂的分散性，同时易于酶催化反应后催化剂、底物、产物的分离，从而提高了酶的利用率，降低成本，有望在催化领域等绿色化学过程得到广泛应用。

具体实施方式

实施例1

1、磁性纳米颗粒的制备

采用共沉淀法合成磁性Fe₃O₄纳米颗粒。在通氮气和快速机械搅拌条件下，将4.66g FeCl₃·6H₂O及1.72g FeCl₂·4H₂O溶解在100mL去离子水中，加入20mL 25％NH₃·H₂O，反应体系变黑色。将体系于80℃下反应30min，反应结束后磁分离，用去离子水反复洗涤至上清呈中性。

2、通过吸附固定化酶磁性离子液体复合材料的制备

将60mmol烷基咪唑与60mmol氯丙基三乙氧基硅烷在90℃搅拌反应24h。反应结束后用乙醚反复洗涤并于室温下旋转蒸发除去乙醚得到产物1-烷基-3-丙基乙氧基硅烷基-咪唑氯盐([C₁C(S)Im]Cl，S表示硅烷基团)，产率为96％。

3、磁性离子液体[C₁C(S)Im]Cl复合材料吸附固定化脂肪酶

150mg脂肪酶与100mg磁性离子液体[C₁C(S)Im]Cl复合材料加入到50mL 10mmol/L磷酸盐缓冲液中(pH 7.0)。混合体系置于25℃的恒温水浴摇床中，转速150r/min保持20～180min。体系经去离子水清洗，记录去离子水的用量。固定化前后溶液中脂肪酶的浓度用考马斯亮蓝法测定，该固定化酶的量为580mg/g。

4、脂肪酶催化活性

固定化酶的活性及稳定性通过无溶剂条件下脂肪酶催化的油酸与正丁醇的酯化反应来考察。通过分子筛移除反应体系中的水。将含有30mg脂肪酶的固定化酶加入到2mL由油酸与正丁醇以摩尔浓度为1∶2比例组成的底物中。将反应体系置于30℃的恒温水浴摇床中，转速为150r/min，每隔30min取样。将反应后的体系用磁铁分离，反应产物通过0.05mol/L KOH乙醇溶液滴定法测量剩余的油酸量来测定，每个样品重复测定三次取平均值。实验结果表明，其酶活性为游离酶的1.1～1.2倍，提高离子液体疏水性能够增大固定化酶对疏水性底物的催化活性，重复使用5次后仍能保持92％的活性。

实施例2

1、磁性纳米颗粒的制备

同实施例1。

2、通过共价结合固定化酶磁性离子液体复合材料的制备

将100mg磁性纳米Fe₃O₄颗粒在100mL乙醇中超声分散30min后，向其中加入1g溴辛酸或溴丁酸。体系在氮气保护下超声反应15min。反应结束后，磁分离得到的固体颗粒用100mL乙腈洗涤两次，100mL甲醇洗涤两次，并真空干燥得到固体粉末。将得到的固体粉末在THF中超声分散后加入2g丁醛取代的咪唑在60℃氮气保护下反应48h。反应结束后用THF洗涤固体颗粒若干次得到磁性纳米颗粒负载的阴离子为Cl^-的离子液体。将得到的颗粒分散于乙腈，向混合体系中加入50mmolKPF₆或NaBF₄，30℃条件下搅拌反应三天。产物经去离子水洗涤若干次直至水相用AgNO₃检测不到Cl^-存在。将颗粒真空干燥除水得到磁性离子液体复合纳米材料(离子液体为[C₄(A)C₄(D)Im]PF₆ ^-，其中A表示羧基基团，D表示醛基基团)。

3、磁性离子液体[C₄(A)C₄(D)Im]PF₆复合材料共价结合固定化脂肪酶

20mg脂肪酶与50mg磁性[C₄(A)C₄(D)Im]PF₆复合材料加入15mL 100mmol/L磷酸盐缓冲液中(pH 7.0)。混合体系置于25℃的恒温水浴摇床中，转速150r/min保持6h。体系经磁分离、0.8mol/L NaCl溶液及去离子水清洗。在通过CDI(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)连接固定脂肪酶的过程中，将1mL 20mg/mL脂肪酶的pH 6.3的磷酸缓冲溶液加入到1mL 20mg/mL CDI的pH 6.3的磷酸缓冲溶液中。将3mL 20mg/mL磁性离子液体复合材料加入混合体系中并在室温下搅拌反应24h。得到的固定化颗粒经磁分离并用100mmol/L磷酸盐缓冲液中(pH 7.0)洗涤及去离子水清洗，记录缓冲液用量。固定化前后溶液中脂肪酶的浓度用考马斯亮蓝法测定，该固定化酶的量为56mg/g。

4、脂肪酶催化活性

固定化酶的活性及稳定性通过无溶剂条件下脂肪酶催化的油酸与正丁醇的酯化反应来考察。通过加入分子筛移除反应体系中的水。将含有30mg脂肪酶的固定化酶加入到2mL由油酸与正丁醇以摩尔浓度为1∶2比例组成的底物中。将反应体系置于30℃的恒温水浴摇床中，转速为150r/min，每隔30min取样。将反应后的体系用磁铁分离，反应产物通过0.05mol/L KOH乙醇溶液滴定法测量剩余的油酸量来测定，每个样品重复测定三次取平均值。实验结果表明，这种固定化酶与反应底物的亲和力是游离酶体系的2～3倍重复使用5次后仍能保持80％的活性。固定化后脂肪酶的稳定性提高，疏水离子液体连接脂肪酶的稳定性更好。

Claims

1.一种利用磁性离子液体复合材料固定化酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)制备磁性纳米颗粒；

3)使用所述磁性离子液体复合材料固定化酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳米颗粒为Fe₃O₄纳米颗粒。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离子液体为咪唑类离子液体。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述纳米颗粒与所述咪唑类离子液体的质量比为1∶10～20。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过吸附固定化和共价固定化固定酶。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶为脂肪酶、纤维素酶、漆酶或淀粉酶。