CN107815448A - 一种二元金属改性纤维素酶催化剂的制备方法和应用 - Google Patents

一种二元金属改性纤维素酶催化剂的制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107815448A
CN107815448A CN201710941254.7A CN201710941254A CN107815448A CN 107815448 A CN107815448 A CN 107815448A CN 201710941254 A CN201710941254 A CN 201710941254A CN 107815448 A CN107815448 A CN 107815448A
Authority
CN
China
Prior art keywords
xylan
solution
cao
aldehyde
particle
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710941254.7A
Other languages
English (en)
Inventor
贺含悦
李超
操家顺
薛朝霞
方芳
冯骞
周仕华
赵俊宇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hohai University HHU
Original Assignee
Hohai University HHU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hohai University HHU filed Critical Hohai University HHU
Priority to CN201710941254.7A priority Critical patent/CN107815448A/zh
Publication of CN107815448A publication Critical patent/CN107815448A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2445—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01091—Cellulose 1,4-beta-cellobiosidase (3.2.1.91)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种二元金属改性纤维素酶催化剂的制备方法和应用，首先采用共沉淀法制备磁性颗粒Fe3O4，加入缓冲剂和阴离子表面活性剂，对磁性颗粒Fe3O4的尺寸大小及表面特性进行修饰得到磁性粉体Fe3O4，后向磁性粉体Fe3O4中加入CaO得到二元金属纳米颗粒，并添加木聚糖醛作为连接分子包覆纳米颗粒，最后将纤维素酶混合物与涂有木聚糖醛的二元金属纳米颗粒混合沉淀，制得CaO‑Fe3O4复合纤维素酶催化剂，进一步提高了藻类纤维素的水解。

Description

一种二元金属改性纤维素酶催化剂的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及纤维素酶催化剂的制备，具体地涉及一种CaO-Fe3O4纤维素酶催化剂的制备方法及其在藻类水解中的应用，进而提高藻类纤维素的水解效率。
背景技术
随着全球社会和经济的高速发展，能源的消耗日益增加，石油的需求量也随之大幅度提升，因此不可食用的生物质燃料吸引了研究人员的广泛关注。像微藻这类的光敏性微生物，可对其直接固碳获得淀粉、纤维素以及脂质生物等成分，此外，由于这些藻类生长简单、粒径小、无定形且多酚含量较低，多糖富集的微藻亦可应用于乙醇的生产。在大多数的藻类中，纤维素被报道为主要的成分，因此可由纤维素酶水解藻类产生可发酵糖，但酶的生产和净化成本占糖成本很多大一部分。
在过去的十几年中，酶的固定化方法众多，例如交联、载体结合、包封或者捕获等技术均在酶的循环利用中得到应用。其中，由有机物或者无机物制成的各种载体获得了较为广泛的研究。事实证明，金属氧化物对酚类、挥发性酸和木质纤维素有一定的抑制作用，例如，Ca2+和Mg2+可络合形成酚类和金属化合物，从而减少或消除了非生产性酶的吸附。此外，金属氧化物和酶形成的聚合物载体为反应提高了自由运动的程度，增强了酶的迁移，减少了酶反应的限制阻碍。研究发现，酶固定在带电磁性金属氧化物上的作用效果较直接使用游离酶作用的效果好，因此，磁性金属氧化物Fe3O4由于其易于回收而在酶固定方面独具优势。为了提高磁化率并为酶分子提供较大的比表面积，可用醛活化的壳聚糖，淀粉，纤维素，聚乙二醇和透明质酸等物质对酶加以改性，使其在高温条件也具有改善藻类纤维素水解的特性。
公开号为CN 106512962A的中国专利提供了一种装载四氧化三铁的聚合电解质纳米材料的制备方法及其用途，该制备方法是以聚合电解质(壳聚糖一多聚磷酸钠包裹物)为基材，采用离子交联方法制备装载Fe3O4的聚合电解质纳米材料。该方法制备所得的材料仅为一元金属纳米颗粒，相比于二元金属纳米颗粒，该Fe3O4聚合电解质纳米材料效果不佳。此外，在使用离子交联法制备壳聚糖纳米粒的过程中，虽然纳米粒的混悬液制备难度不大，但要将纳米粒从中分离出来却具有一定的难度，不能保证材料制备的完整性。公开号为CN102392013A的中国专利提供了一种磁性固定化交联纤维素酶聚集体及其制备方法与应用，该方法中所述的“磁性壳聚糖复合微球”的制备较为复杂，且磁性固定化交联纤维素酶聚集体的酶回收率不高。公开号为CN 102250868A的中国专利提供了一种利用磁性离子液体复合材料固定化酶的方法，该方法中通过吸附固定化酶磁性离子液体复合材料的制备过程十分复杂，而通过共价结合固定化酶磁性离子液体复合纳米材料的制备过程耗时也较长，无形中增加了一定的成本。此外，离子液体很容易吸收空气中的水分，吸水后有些离子液体会与水发生反应，而一些不发生反应的离子液体性能也会因为吸水而大大降低。
发明内容
发明目的：为避免上述现有技术中的不足，本发明提供一种二元金属改性纤维素酶催化剂的制备方法，并在藻类纤维素的水解过程中加以应用，提高了藻类纤维素的水解效率。
技术方案：为实现上述技术目的，本发明提出的二元金属改性纤维素酶催化剂的制备方法包括如下步骤：
(1)磁性粉体Fe3O4的制备：首先制备Fe3O4磁性颗粒，然后将含有Fe3O4磁性颗粒的水混合液加热升温，加入缓冲剂调节溶液pH值，搅拌的同时加入阴离子表面活性剂，静置一段时间后，用磁铁吸附沉淀物，将沉淀物洗涤烘干得到磁性粉体Fe3O4；
(2)二元金属纳米颗粒CaO-Fe3O4的制备：向磁性粉体Fe3O4中投加金属氧化物CaO，将混合物升温加热；
(3)制备木聚糖醛类物质；将木聚糖类物质溶解于高碘酸钠中，在室温下且暗光中不断搅拌，后将溶液离心，得到相对应的木聚糖醛沉淀物用超纯水透析纯化；
(4)木聚糖醛与二元金属纳米颗粒物的涂布包覆：将木聚糖醛类物质加入到蒸馏水中，用一定比例的尿素和NaOH将其溶解，溶解过程中剧烈搅拌，使其涂布并包覆二元金属纳米颗粒物CaO-Fe3O4，后将溶液在恒定搅拌速率下与硫酸铵溶液混合，所得到的沉淀用蒸馏水洗涤数次并干燥烘干；
(5)CaO-Fe3O4复合纤维素酶的制备：将由木聚糖醛涂覆的二元金属纳米粒子CaO-Fe3O4浸泡在纤维素酶混合溶液中，溶液在振荡培养箱中恒温培养，用超纯水洗涤所得到的沉淀物去除无界酶，最终产物即为CaO-Fe3O4复合纤维素酶。
在一种实施方式中，步骤(1)中，采用共沉淀法制备Fe3O4磁性颗粒，具体步骤为：将一定摩尔比的Fe3+和Fe2+两种盐溶液溶解于蒸馏水中并置于恒温水浴锅中混合均匀，快速搅拌的同时滴加NaOH溶液至混合溶液中，调节溶液的pH值，将悬浮液加热并离心，得到的颗粒物在无水乙醇中洗涤数次，静置，得到黑色颗粒即为Fe3O4磁性颗粒，其中，Fe3+和Fe2+两种盐溶液的摩尔比为1.5：1-2:1，恒温水浴锅的温度为35-45℃，滴加NaOH溶液后，调节溶液的pH值至10-12，悬浮液需在80-90℃下加热2.5-3小时，并在5000-6000×g的离心力下离心5-8分钟。按照此方法合成的磁性颗粒的粒径在10nm左右，粒度分布均匀,分布带较窄，磁化强度为98.5emu/g左右。同时也可以使用市售的具有部分类似的性质磁性颗粒。采用本发明方法制备的磁性颗粒的性能较优，效果较好，且自制较为廉价，节约能耗。
作为优选的实施方案，步骤(1)中，将含有Fe3O4磁性颗粒的混合液加热至70-80℃，加入缓冲剂后将溶液pH值调节至4-6，所述的缓冲剂与Fe2+的摩尔比为0.4：1-0.5:1，所述的阴离子表面活性剂与Fe2+的摩尔比为0.4：1-0.5:1。
具体地，所述的缓冲剂为冰乙酸或乙酸钠，所述的阴离子表面活性剂为油酸钠、油酸、十二烷基硫酸钠或十二烷基苯磺酸钠中的任意一种或几种的混合物。
步骤(2)中，金属氧化物CaO的浓度控制在100-500mg/g，加热温度控制在85-95℃，加热2.5-3小时。
步骤(3)中，所述的木聚糖醛类物质为小麦阿拉伯木聚糖醛、榉木木聚糖醛或燕麦木聚糖醛中的任意一种或几种的组合，木聚糖类物质的质量为4-5g。在一种实施方式中，通过如下方法制备得到木聚糖醛类物质：将小麦阿拉伯木聚糖、榉木木聚糖或燕麦木聚糖等木聚糖类物质溶解于高碘酸钠中，在室温下且暗光中不断搅拌9-10小时，8000-8500×g离心力下离心8-10分钟，得到相对应的木聚糖醛沉淀物用超纯水透析纯化。木聚糖的质量需要控制在一定的适宜范围内，从而制得相对应的木聚糖醛。由于不同的木聚糖相对分子质量不确定，但高碘酸钠的适宜浓度一般都为250mM，所以木聚糖类物质只是粗糙的用质量范围。
优选地，步骤(4)中，尿素和NaOH的比例控制在1:1-1:1.5，溶液搅拌10-15分钟，二元金属纳米颗粒物CaO-Fe3O4在木聚糖醛溶液中的浓度控制在20-100mg/g。
步骤(4)中，硫酸铵溶液的浓度为7-8％，所得到的沉淀需在60-70℃下烘干4.5-5小时。
步骤(5)中，由木聚糖醛涂覆的二元金属纳米粒子CaO-Fe3O4在纤维素酶混合溶液中的质量浓度控制在2-3％，振荡培养箱的温度为50-55℃，振荡25-35分钟。
步骤(5)中，所述的纤维素酶混合溶液为内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶的中的任意一种或几种的混合。然而上述的纤维素酶混合溶液并不仅仅限制于上述几种酶，具有其他类似性质的酶都可以作为纤维素酶来使用。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明的制备方法简单，采用共沉淀法制备磁性颗粒Fe3O4，该方法对设备的要求比较简单，反应可以在条件较为温和的情况下进行，所用的原材料为廉价的无机盐，工艺流程简短易行，完善后易于扩大到工业化生产，且反应过程中形核容易控制，反应产物纯净度高，粒子分散性比较好，并且可以使酶固定在带电磁性的金属氧化物上，其作用效果优于游离状态的酶。此外，相对于其他金属而言，Fe3O4金属氧化物回收方便，大大提高了二次使用的效率；
(2)作为本发明的改进，通过加入缓冲剂和阴离子表面活性剂，对Fe3O4磁性颗粒的尺寸大小和表面特性进行修饰，使得磁性粒子聚集体分割成细小的微粒，具有澄清净化、促进沉降的作用，提高了催化剂的使用效率；
(3)本发明金属氧化物扩展到二元范围，加入金属氧化物CaO与磁性粉体Fe3O4进行混合制备二元金属纳米颗粒。一方面，进一步加强了酶反应的迁移速率，减少了酶反应过程中的限制阻碍，另一方面，Ca2+可以形成某些金属络合物，减少或消除非生产性酶的吸附，提高生产效率；
(4)本发明用醛活化木聚糖类物质对酶加以改性，使得醛基与酶分子氨基之间产生连接，增强了酶对纳米颗粒的结合。此外，用醛活化的木聚糖类物质还可以提高磁化效率并为酶分子提供较大的比表面积，并且使其在非常高的温度也能保持了一定的活性，有益于改善藻类等物质的水解特性。
具体实施方式
实施例1
一种CaO-Fe3O4纤维素酶催化剂的制备方法及其在藻类水解中的应用，其制备方法包括步骤：
步骤1，磁性颗粒Fe3O4的制备:选用三氯化铁和七水硫酸亚铁作为Fe3+和Fe2+供体，并控制Fe3+和Fe2+两种盐溶液的摩尔比为2:1，将其溶解于蒸馏水中并置于40℃的恒温水浴锅中混合均匀，快速搅拌的同时滴加NaOH溶液至混合溶液中，调节溶液的pH值至10，将悬浮液在90℃下加热3小时，并在5000×g的离心力下离心5分钟，得到的颗粒物在无水乙醇中洗涤数次，静置，得到黑色颗粒即为Fe3O4磁性颗粒；
步骤2，磁性粉体Fe3O4的制备：将含有Fe3O4磁性颗粒的混合液加热至80℃，加入与Fe2+的摩尔比为0.4：1的冰乙酸缓冲剂，调节溶液pH值至5，搅拌的同时加入与Fe2+的摩尔比为0.4：1的油酸钠和油酸阴离子表面活性剂，静置一段时间后，用磁铁吸附沉淀物，将沉淀物洗涤烘干得到磁性粉体Fe3O4；
步骤3，二元金属纳米颗粒CaO-Fe3O4的制备：向磁性粉体Fe3O4中投加的固体浓度为400mg/g金属氧化物CaO，将混合物在90℃加热3小时；
步骤4，木聚糖醛的制备：将5g小麦阿拉伯木聚糖溶解于250mM高碘酸钠中，在室温下且暗光中不断搅拌10小时，后将溶液在8000×g离心力下离心10分钟，得到的木聚糖醛沉淀物用超纯水透析纯化；
步骤5，木聚糖醛与二元金属纳米颗粒物的涂布包覆：将小麦阿拉伯木聚糖醛加入到蒸馏水中，用1g尿素和1.5gNaOH将其溶解，溶解过程中剧烈搅拌10分钟，使其涂布并包覆浓度为50mg/g的二元金属纳米颗粒物CaO-Fe3O4，后将溶液在恒定搅拌速率下与8％的硫酸铵溶液混合，所得到的沉淀用蒸馏水洗涤数次，并在60℃下烘干5小时；
步骤6，CaO-Fe3O4复合纤维素酶的制备：将1g木聚糖醛涂覆的二元金属纳米粒子CaO-Fe3O4浸泡在50mL纤维素酶混合溶液(纤维素酶混合溶液为内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶的混合物，溶剂为水，各种酶的比例不做具体要求)中，溶液在50℃的恒温振荡培养箱中培养30分钟，用超纯水洗涤所得到的沉淀物去除无界酶，最终产物即为CaO-Fe3O4复合纤维素酶。
将优化条件下制备的CaO-Fe3O4复合纤维素酶加入到含有50mL水和3.33g藻类生物质的锥形烧瓶中，在200rpm振荡温育12小时后，将样品以8000×g离心10分钟分离纳米颗粒和水解产物，测得最终固定酶产率为72.3％，水解后的酶活性回收率为96.5％，葡萄糖产率为69.7％。
其中，上述检测结果中，水解物的化学表征使用装备有折射率检测器的HPLC系统定量测定葡萄糖等糖类物质的含量，固定酶的测定则是通过将50mg金属纳米粒子连接酶和50mg滤纸加入到1.5mL的0.05M柠檬酸钠缓冲液(pH＝4.8)中，然后在50℃温育60分钟来测定固定化酶的活性，然后将二硝基水杨酸反应剂加入到反应混合物中，并使用离心(8000×g，10分钟)后获得的上清液在540nm下比色测定活性，比较前后差值，从而计算得到固定酶产率、酶活性和葡萄糖产率，下述实施例相同。
实施例2
一种CaO-Fe3O4纤维素酶催化剂的制备方法及其在藻类水解中的应用，其制备方法包括步骤：
步骤1，磁性颗粒Fe3O4的制备:选用硫酸铁和四水氯化亚铁作为Fe3+和Fe2+供体，并控制Fe3+和Fe2+两种盐溶液的摩尔比为1.5:1，将其溶解于蒸馏水中并置于45℃的恒温水浴锅中混合均匀，快速搅拌的同时滴加NaOH溶液至混合溶液中，调节溶液的pH值至11，将悬浮液在85℃下加热2.5小时，并在6000×g的离心力下离心6分钟，得到的颗粒物在无水乙醇中洗涤数次，静置，得到黑色颗粒即为Fe3O4磁性颗粒；
步骤2，磁性粉体Fe3O4的制备：将含有Fe3O4磁性颗粒的混合液加热至75℃，加入与Fe2+的摩尔比为0.5：1的乙酸钠缓冲剂，调节溶液pH值至6，搅拌的同时加入与Fe2+的摩尔比为0.5：1的十二烷基硫酸钠阴离子表面活性剂，静置一段时间后，用磁铁吸附沉淀物，将沉淀物洗涤烘干得到磁性粉体Fe3O4；
步骤3，二元金属纳米颗粒CaO-Fe3O4的制备：向磁性粉体Fe3O4中投加的固体浓度为300mg/g金属氧化物CaO，将混合物在95℃加热2.5小时；
步骤4，木聚糖醛的制备：将4.5g榉木木聚糖溶解于250mM高碘酸钠中，在室温下且暗光中不断搅拌9.5小时，后将溶液在8000×g离心力下离心8分钟，得到的木聚糖醛沉淀物用超纯水透析纯化；
步骤5，木聚糖醛与二元金属纳米颗粒物的涂布包覆：将榉木木聚糖醛加入到蒸馏水中，用1g尿素和1.2gNaOH将其溶解，溶解过程中剧烈搅拌15分钟，使其涂布并包覆浓度为80mg/g的二元金属纳米颗粒物CaO-Fe3O4，后将溶液在恒定搅拌速率下与7％的硫酸铵溶液混合，所得到的沉淀用蒸馏水洗涤数次，并在65℃下烘干4.5小时；
步骤6，CaO-Fe3O4复合纤维素酶的制备：将1g木聚糖醛涂覆的二元金属纳米粒子CaO-Fe3O4浸泡在50mL纤维素酶混合溶液中，溶液在55℃的恒温振荡培养箱中培养35分钟，用超纯水洗涤所得到的沉淀物去除无界酶，最终产物即为CaO-Fe3O4复合纤维素酶；
将优化条件下制备的CaO-Fe3O4复合纤维素酶加入到含有50mL水和3.33g藻类生物质的锥形烧瓶中，在200rpm振荡温育12小时后，将样品以8000×g离心10分钟分离纳米颗粒和水解产物，测得最终固定酶产率为73.6％，水解后的酶活性回收率为96.8％，葡萄糖产率为68.9％。
实施例3
一种CaO-Fe3O4纤维素酶催化剂的制备方法及其在藻类水解中的应用，其制备方法包括步骤：
步骤1，磁性颗粒Fe3O4的制备:选用六水三氯化铁和四水氯化亚铁作为Fe3+和Fe2+供体，并控制Fe3+和Fe2+两种盐溶液的摩尔比为1.6:1，将其溶解于蒸馏水中并置于35℃的恒温水浴锅中混合均匀，快速搅拌的同时滴加NaOH溶液至混合溶液中，调节溶液的pH值至12，将悬浮液在80℃下加热2.8小时，并在5500×g的离心力下离心7分钟，得到的颗粒物在无水乙醇中洗涤数次，静置，得到黑色颗粒即为Fe3O4磁性颗粒；
步骤2，磁性粉体Fe3O4的制备：将含有Fe3O4磁性颗粒的混合液加热至78℃，加入与Fe2+的摩尔比为0.5：1的乙酸钠缓冲剂，调节溶液pH值至4，搅拌的同时加入与Fe2+的摩尔比为0.5：1的十二烷基硫酸钠和十二烷基苯磺酸钠阴离子表面活性剂，静置一段时间后，用磁铁吸附沉淀物，将沉淀物洗涤烘干得到磁性粉体Fe3O4；
步骤3，二元金属纳米颗粒CaO-Fe3O4的制备：向磁性粉体Fe3O4中投加的固体浓度为500mg/g金属氧化物CaO，将混合物在85℃加热2.8小时；
步骤4，木聚糖醛的制备：将4.2g燕麦木聚糖溶解于250mM高碘酸钠中，在室温下且暗光中不断搅拌9小时，后将溶液在8500×g离心力下离心8分钟，得到的木聚糖醛沉淀物用超纯水透析纯化；
步骤5，木聚糖醛与二元金属纳米颗粒物的涂布包覆：将燕麦木聚糖醛加入到蒸馏水中，用1g尿素和1.3gNaOH将其溶解，溶解过程中剧烈搅拌12分钟，使其涂布并包覆浓度为60mg/g的二元金属纳米颗粒物CaO-Fe3O4，后将溶液在恒定搅拌速率下与7％的硫酸铵溶液混合，所得到的沉淀用蒸馏水洗涤数次，并在70℃下烘干4.8小时；
步骤6，CaO-Fe3O4复合纤维素酶的制备：将1g木聚糖醛涂覆的二元金属纳米粒子CaO-Fe3O4浸泡在50mL纤维素酶混合溶液中，溶液在52℃的恒温振荡培养箱中培养25分钟，用超纯水洗涤所得到的沉淀物去除无界酶，最终产物即为CaO-Fe3O4复合纤维素酶；
将优化条件下制备的CaO-Fe3O4复合纤维素酶加入到含有50mL水和3.33g藻类生物质的锥形烧瓶中，在200rpm振荡温育12小时后，将样品以8000×g离心10分钟分离纳米颗粒和水解产物，测得最终固定酶产率为74.6％，水解后的酶活性回收率为95.8％，葡萄糖产率为70.5％。
实施例4
一种CaO-Fe3O4纤维素酶催化剂的制备方法及其在藻类水解中的应用，其制备方法包括步骤：
步骤1，磁性颗粒Fe3O4的制备:选用六水三氯化铁和七水硫酸亚铁作为Fe3+和Fe2+供体，并控制Fe3+和Fe2+两种盐溶液的摩尔比为1.8:1，将其溶解于蒸馏水中并置于36℃的恒温水浴锅中混合均匀，快速搅拌的同时滴加NaOH溶液至混合溶液中，调节溶液的pH值至10，将悬浮液在82℃下加热2.6小时，并在5600×g的离心力下离心6分钟，得到的颗粒物在无水乙醇中洗涤数次，静置，得到黑色颗粒即为Fe3O4磁性颗粒；
步骤2，磁性粉体Fe3O4的制备：将含有Fe3O4磁性颗粒的混合液加热至76℃，加入与Fe2+的摩尔比为0.4：1的冰乙酸缓冲剂，调节溶液pH值至5，搅拌的同时加入与Fe2+的摩尔比为0.5：1的油酸和十二烷基苯磺酸钠阴离子表面活性剂，静置一段时间后，用磁铁吸附沉淀物，将沉淀物洗涤烘干得到磁性粉体Fe3O4；
步骤3，二元金属纳米颗粒CaO-Fe3O4的制备：向磁性粉体Fe3O4中投加的固体浓度为200mg/g金属氧化物CaO，将混合物在88℃加热2.9小时；
步骤4，木聚糖醛的制备：将4.4g小麦阿拉伯木聚糖溶解于250mM高碘酸钠中，在室温下且暗光中不断搅拌9.2小时，后将溶液在8000×g离心力下离心9分钟，得到的木聚糖醛沉淀物用超纯水透析纯化；
步骤5，木聚糖醛与二元金属纳米颗粒物的涂布包覆：将小麦阿拉伯木聚糖醛加入到蒸馏水中，用1g尿素和1.4gNaOH将其溶解，溶解过程中剧烈搅拌13分钟，使其涂布并包覆浓度为30mg/g的二元金属纳米颗粒物CaO-Fe3O4，后将溶液在恒定搅拌速率下与8％的硫酸铵溶液混合，所得到的沉淀用蒸馏水洗涤数次，并在66℃下烘干4.5小时；
步骤6，CaO-Fe3O4复合纤维素酶的制备：将1g木聚糖醛涂覆的二元金属纳米粒子CaO-Fe3O4浸泡在50mL纤维素酶混合溶液中，溶液在54℃的恒温振荡培养箱中培养30分钟，用超纯水洗涤所得到的沉淀物去除无界酶，最终产物即为CaO-Fe3O4复合纤维素酶；
将优化条件下制备的CaO-Fe3O4复合纤维素酶加入到含有50mL水和3.33g藻类生物质的锥形烧瓶中，在200rpm振荡温育12小时后，将样品以8000×g离心10分钟分离纳米颗粒和水解产物，测得最终固定酶产率为62.6％，水解后的酶活性回收率为90.7％，葡萄糖产率为60.3％。
实施例5
一种CaO-Fe3O4纤维素酶催化剂的制备方法及其在藻类水解中的应用，其制备方法包括步骤：
步骤1，磁性颗粒Fe3O4的制备:选用九水硝酸铁和七水硫酸亚铁作为Fe3+和Fe2+供体，并控制Fe3+和Fe2+两种盐溶液的摩尔比为1.5:1，将其溶解于蒸馏水中并置于43℃的恒温水浴锅中混合均匀，快速搅拌的同时滴加NaOH溶液至混合溶液中，调节溶液的pH值至12，将悬浮液在87℃下加热2.9小时，并在5800×g的离心力下离心5分钟，得到的颗粒物在无水乙醇中洗涤数次，静置，得到黑色颗粒即为Fe3O4磁性颗粒；
步骤2，磁性粉体Fe3O4的制备：将含有Fe3O4磁性颗粒的混合液加热至73℃，加入与Fe2+的摩尔比为0.5：1的冰乙酸缓冲剂，调节溶液pH值至5，搅拌的同时加入与Fe2+的摩尔比为0.4：1的油酸钠阴离子表面活性剂，静置一段时间后，用磁铁吸附沉淀物，将沉淀物洗涤烘干得到磁性粉体Fe3O4；
步骤3，二元金属纳米颗粒CaO-Fe3O4的制备：向磁性粉体Fe3O4中投加的固体浓度为400mg/g金属氧化物CaO，将混合物在85℃加热2.6小时；
步骤4，木聚糖醛的制备：将4.8g小麦阿拉伯木聚糖溶解于250mM高碘酸钠中，在室温下且暗光中不断搅拌9.8小时，后将溶液在8200×g离心力下离心10分钟，得到的木聚糖醛沉淀物用超纯水透析纯化；
步骤5，木聚糖醛与二元金属纳米颗粒物的涂布包覆：将小麦阿拉伯木聚糖醛加入到蒸馏水中，用1g尿素和1gNaOH将其溶解，溶解过程中剧烈搅拌12分钟，使其涂布并包覆浓度为70mg/g的二元金属纳米颗粒物CaO-Fe3O4，后将溶液在恒定搅拌速率下与8％的硫酸铵溶液混合，所得到的沉淀用蒸馏水洗涤数次，并在67℃下烘干5小时；
步骤6，CaO-Fe3O4复合纤维素酶的制备：将1g木聚糖醛涂覆的二元金属纳米粒子CaO-Fe3O4浸泡在50mL纤维素酶混合溶液中，溶液在55℃的恒温振荡培养箱中培养28分钟，用超纯水洗涤所得到的沉淀物去除无界酶，最终产物即为CaO-Fe3O4复合纤维素酶；
将优化条件下制备的CaO-Fe3O4复合纤维素酶加入到含有50mL水和3.33g藻类生物质的锥形烧瓶中，在200rpm振荡温育12小时后，将样品以8000×g离心10分钟分离纳米颗粒和水解产物，测得最终固定酶产率为71.3％，水解后的酶活性回收率为94.9％，葡萄糖产率为69.4％。

Claims (10)

1.一种二元金属改性纤维素酶催化剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)磁性粉体Fe3O4的制备：首先制备Fe3O4磁性颗粒，然后将含有Fe3O4磁性颗粒的水混合液加热升温，加入缓冲剂调节溶液pH值，搅拌的同时加入阴离子表面活性剂，静置一段时间后，用磁铁吸附沉淀物，将沉淀物洗涤烘干得到磁性粉体Fe3O4；
(2)二元金属纳米颗粒CaO-Fe3O4的制备：向磁性粉体Fe3O4中投加金属氧化物CaO，将混合物升温加热；
(3)制备木聚糖醛类物质；
(4)木聚糖醛与二元金属纳米颗粒物的涂布包覆：将木聚糖醛类物质加入到蒸馏水中，用一定比例的尿素和NaOH将其溶解，溶解过程中剧烈搅拌，使其涂布并包覆二元金属纳米颗粒物CaO-Fe3O4，后将溶液在恒定搅拌速率下与硫酸铵溶液混合，所得到的沉淀用蒸馏水洗涤数次并干燥烘干；
(5)CaO-Fe3O4复合纤维素酶的制备：将由木聚糖醛涂覆的二元金属纳米粒子CaO-Fe3O4浸泡在纤维素酶混合溶液中，溶液在振荡培养箱中恒温培养，用超纯水洗涤所得到的沉淀物去除无界酶，最终产物即为CaO-Fe3O4复合纤维素酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，采用共沉淀法制备Fe3O4磁性颗粒，具体步骤为：将一定摩尔比的Fe3+和Fe2+两种盐溶液溶解于蒸馏水中并置于恒温水浴锅中混合均匀，快速搅拌的同时滴加NaOH溶液至混合溶液中，调节溶液的pH值，将悬浮液加热并离心，得到的颗粒物在无水乙醇中洗涤数次，静置，得到黑色颗粒即为Fe3O4磁性颗粒，其中，Fe3+和Fe2+两种盐溶液的摩尔比为1.5：1-2:1，恒温水浴锅的温度为35-45℃，滴加NaOH溶液后，调节溶液的pH值至10-12，悬浮液需在80-90℃下加热2.5-3小时，并在5000-6000×g的离心力下离心5-8分钟。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，将含有Fe3O4磁性颗粒的混合液加热至70-80℃，加入缓冲剂后将溶液pH值调节至4-6，所述的缓冲剂与Fe2+的摩尔比为0.4：1-0.5:1，所述的阴离子表面活性剂与Fe2+的摩尔比为0.4：1-0.5:1。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述的缓冲剂为冰乙酸或乙酸钠，所述的阴离子表面活性剂为油酸钠、油酸、十二烷基硫酸钠或十二烷基苯磺酸钠中的任意一种或几种的混合物。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，金属氧化物CaO的浓度控制在100-500mg/g，加热温度控制在85-95℃，加热2.5-3小时。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的木聚糖醛类物质为小麦阿拉伯木聚糖醛、榉木木聚糖醛或燕麦木聚糖醛中的任意一种或几种的组合，木聚糖类物质的质量为4-5g。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，尿素和NaOH的比例控制在1:1-1:1.5，溶液搅拌10-15分钟，二元金属纳米颗粒物CaO-Fe3O4在木聚糖醛溶液中的浓度控制在20-100mg/g。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，硫酸铵溶液的浓度为7-8％，所得到的沉淀需在60-70℃下烘干4.5-5小时。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，由木聚糖醛涂覆的二元金属纳米粒子CaO-Fe3O4在纤维素酶混合溶液中的质量浓度控制在2-3％，振荡培养箱的温度为50-55℃，振荡25-35分钟。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的纤维素酶混合溶液为内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶的中的任意一种或几种的混合。
CN201710941254.7A 2017-10-11 2017-10-11 一种二元金属改性纤维素酶催化剂的制备方法和应用 Pending CN107815448A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710941254.7A CN107815448A (zh) 2017-10-11 2017-10-11 一种二元金属改性纤维素酶催化剂的制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710941254.7A CN107815448A (zh) 2017-10-11 2017-10-11 一种二元金属改性纤维素酶催化剂的制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107815448A true CN107815448A (zh) 2018-03-20

Family

ID=61608066

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710941254.7A Pending CN107815448A (zh) 2017-10-11 2017-10-11 一种二元金属改性纤维素酶催化剂的制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107815448A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117142505A (zh) * 2023-09-15 2023-12-01 杭州宏鑫钙业有限公司 一种氢氧化钙的制备方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101397580A (zh) * 2008-10-31 2009-04-01 华南理工大学 在稳恒磁场条件下制备低聚壳聚糖的方法
CN102250868A (zh) * 2010-05-21 2011-11-23 中国科学院过程工程研究所 一种利用磁性离子液体复合材料固定化酶的方法
CN102898600A (zh) * 2012-11-08 2013-01-30 山东轻工业学院 一种固定化酶用的磁性三组分环氧大孔树脂及其制备方法
CN104342431A (zh) * 2014-11-03 2015-02-11 遵义医学院 一种固定化酶用磁性纳米载体的制备方法
CN105255853A (zh) * 2015-11-10 2016-01-20 河南工业大学 一种磁性羟基磷灰石固定化脂肪酶的制备方法及在食用油脂加工中的应用
CN106520751A (zh) * 2016-12-16 2017-03-22 浙江医药高等专科学校 固定化铁螯合物酶的制备方法及应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101397580A (zh) * 2008-10-31 2009-04-01 华南理工大学 在稳恒磁场条件下制备低聚壳聚糖的方法
CN102250868A (zh) * 2010-05-21 2011-11-23 中国科学院过程工程研究所 一种利用磁性离子液体复合材料固定化酶的方法
CN102898600A (zh) * 2012-11-08 2013-01-30 山东轻工业学院 一种固定化酶用的磁性三组分环氧大孔树脂及其制备方法
CN104342431A (zh) * 2014-11-03 2015-02-11 遵义医学院 一种固定化酶用磁性纳米载体的制备方法
CN105255853A (zh) * 2015-11-10 2016-01-20 河南工业大学 一种磁性羟基磷灰石固定化脂肪酶的制备方法及在食用油脂加工中的应用
CN106520751A (zh) * 2016-12-16 2017-03-22 浙江医药高等专科学校 固定化铁螯合物酶的制备方法及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAO LIU: "Eliminating Inhibition of Enzymatic Hydrolysis by Lignosulfonate in Unwashed Sulfite-Pretreated Aspen Using Metal Salts", 《BIORESOUR TECHNOL》 *
RAJENDRAN VELMURUGAN: "MgO-Fe3O4 linked cellulase enzyme complex improves the hydrolysis of cellulose from Chlorella sp. CYB2", 《BIOCHEMICAL ENGINEERING JOURNAL》 *
SAMET AZMAN: "Mitigation of Humic Acid Inhibition in Anaerobic Digestion of Cellulose by Addition of Various Salts", 《BIOENGINEERING (BASEL)》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117142505A (zh) * 2023-09-15 2023-12-01 杭州宏鑫钙业有限公司 一种氢氧化钙的制备方法
CN117142505B (zh) * 2023-09-15 2024-03-12 杭州宏鑫钙业有限公司 一种氢氧化钙的制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sanchez-Ramirez et al. Cellulases immobilization on chitosan-coated magnetic nanoparticles: application for Agave Atrovirens lignocellulosic biomass hydrolysis
Li et al. Fabrication of graphene oxide decorated with Fe 3 O 4@ SiO 2 for immobilization of cellulase
Khoshnevisan et al. Immobilization of cellulase enzyme on superparamagnetic nanoparticles and determination of its activity and stability
Wu et al. Novel process for immobilizing an enzyme on a bacterial cellulose membrane through repeated absorption
Zhang et al. Poly (carboxybetaine methacrylate)-grafted silica nanoparticle: A novel carrier for enzyme immobilization
Abdel-Naby et al. Preparation and some properties of immobilized Penicillium funiculosum 258 dextranase
Liu et al. Covalent immobilization of Kluyveromyces fragilis β-galactosidase on magnetic nanosized epoxy support for synthesis of galacto-oligosaccharide
Gracida et al. Improved thermal and reusability properties of xylanase by genipin cross-linking to magnetic chitosan particles
Torabizadeh et al. Inulin hydrolysis by inulinase immobilized covalently on magnetic nanoparticles prepared with wheat gluten hydrolysates
CN101113433A (zh) 一种壳聚糖微球固定化脂肪酶制备工艺
CN104099317A (zh) 一种壳聚糖磁性纳米粒子固定普鲁兰酶的方法
Yang Uniform cross-linked cellulase aggregates prepared in millifluidic reactors
CN109095623A (zh) 一种提高好氧硝化菌及亚硝化菌培养密度的微载体及其制备方法
Rani et al. Preparation of Cicer artienium amylase loaded BSA nanoparticles and their bioproteolysis to be used as detergent additive
Sun et al. Activity and stability of trypsin immobilized onto chitosan magnetic nanoparticles
Shahid et al. Chitosan hydrogel microspheres: an effective covalent matrix for crosslinking of soluble dextranase to increase stability and recycling efficiency
Hamzah et al. CELLULASE AND XYLANASE IMMOBILIZED ON CHITOSAN MAGNETIC PARTICLES FOR APPLICATION IN COCONUT HUSK HYDROLYSIS.
Lucena et al. Synthesis and characterization of magnetic cross-linked enzyme aggregate and its evaluation of the alternating magnetic field (AMF) effects in the catalytic activity
Zeng et al. Studies on Penicillium sp. ZDZ1 chitosanase immobilized on chitin by cross-linking reaction
Valentova et al. Comparison of different methods of glucose oxidase immobilization
CN107815448A (zh) 一种二元金属改性纤维素酶催化剂的制备方法和应用
Ozyilmaz et al. Preparation of regenerable magnetic nanoparticles for cellulase immobilization: Improvement of enzymatic activity and stability
CN108642040B (zh) 一种可溶-不溶性UCST型PMAAc载体、其固定化酶及应用
CN102676624A (zh) 利用固定化酶从花生饼粕中生产活性肽的方法
CN106011206A (zh) 用复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶制备活性肽的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180320