CN101397580A - 在稳恒磁场条件下制备低聚壳聚糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了在稳恒磁场条件下制备低聚壳聚糖的方法，该方法包括：壳聚糖乙酸溶液的配置；磁性壳聚糖微球的制备；磁性固定化纤维素酶的制备；低聚壳聚糖的制备；本发明不但可以提高高分子物质的降解率，而且为实现连续化生产提供理论依据，同时能够便于酶的回收、提高固定化酶的利用率，降低成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备低聚壳聚糖的方法，特别涉及由直流电产生的稳恒磁场三相流化床酶解反应器中将高分子壳聚糖降解为小分子壳聚糖的制备方法。
背景技术
低聚壳聚糖因其具有独特的、优越的生理活性和功能性质，如：在人体肠道内活化增殖双歧杆菌、提高巨噬细胞的吞噬能力、促进脾脏抗体的生长、抑制肿瘤细胞的生长；降低血压、血糖、血脂、吸附胆固醇；在微环境中具有较强抑菌抗菌作用和显著的保湿吸湿能力等，因而在食品保健和生物医药领域中的开发和应用具有巨大的市场潜力，发展前途广阔。
低聚壳聚糖的制备方法主要有化学法、物理法和酶解法等在内的多种降解方法。由于酶法降解可特异性地、选择性地切断壳聚糖的β(1，4)糖苷键，降解过程和降解产物的分子量易于控制，从而可以较好地实现对该生物降解过程的监控，得到所需分子量范围的低聚壳聚糖。而且，酶解法可以在较温和的条件下直接进行，相对于另外两种化学方法，酶解法不需要加入大量的反应试剂，不发生副反应，对环境基本不造成污染。因此，酶解法是制备低聚壳聚糖的较理想的方法。
然而，由于酶的价格比较贵，特别是专一性酶的价格更是昂贵，因而大大增加了生产成本，且难以实现大批量工业化生产。因此，寻求一种能够降低生产成本、同时又能实现连续化生产的方法成为实现商业化的期望。目前，常用的固定化酶反应器是流化床，不过，国内外研究的流化床基本是以降解底物为液相、固定化酶颗粒为固相组成的间歇式液、固流化床，然而，对于高粘度粘稠物系(例如天然壳聚糖大分子物系)，此种反应器的液固传质系数低，造成产物生成率低，反应效率低，并且不利于酶的回收。
发明内容
为了克服现有的流化床液固传质系数低、酶回收困难的不足，本发明的目的在于提供一种利用磁场三相(气、液、固)流化床酶解反应器(见发明名称“磁场三相流化床酶解反应器”，专利号200720061568.x)来降解分子量大的壳聚糖物质制备低聚壳聚糖(分子量<10000)的方法。稳恒磁场的施加可以使得磁性固定化酶在一定区域内运动，而通入的气体对大分子壳聚糖粘稠物系起着类似搅拌的作用及气体对物系表观粘度的降低作用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：在稳恒磁场条件下制备低聚壳聚糖的方法，包括如下步骤：
第一步，壳聚糖乙酸溶液的配置
用体积百分比浓度1～3％的乙酸溶液将壳聚糖溶解配置成1～30mg/mL的壳聚糖乙酸溶液，用碱液调pH为4.0～5.0，得到壳聚糖乙酸溶液。
第二步，磁性壳聚糖微球的制备
在100～200mL壳聚糖乙酸溶液中加入2.0～3.5g Fe3O4粉末，搅拌混合均匀，加入4～10mL Span—80(司班-80)、8～30mL正丁醇和100～300mL石蜡，待分散均匀后，在40～80℃条件下加入2～8.0mL甲醛，反应10～60min后，继续加入4～8.0mL甲醛，反应1～3h后，升温至60～100℃，再加入6～10.0mL戊二醛，继续搅拌反应1～3h，反应结束，得到磁性微球，静置冷却至室温，冲洗磁性微球，用磁场收集磁性微球，置于30～60℃烘干；将干燥的磁性微球筛分，得到磁性壳聚糖微球。
第三步，磁性固定化纤维素酶的制备
将1.0～5.0g磁性壳聚糖微球加入50～250mL的0.1～0.5mol/L醋酸—醋酸钠缓冲液中溶胀2～5小时，加入100～500mL的1.0mg/mL纤维素酶液，在20～40℃、100～250r/min的恒温振荡器上振荡，让磁性壳聚糖微球吸附纤维素酶，6～16h后，在磁场强度<100kA/m的稳恒磁场作用下，将磁性壳聚糖微球沉淀，去上清液，用0.1～0.5mol/L醋酸—醋酸钠缓冲液反复冲洗磁性壳聚糖微球，直至洗液中检测不到蛋白为止；即得到磁性固定化纤维素酶。
第四步，低聚壳聚糖的制备
将30～200g磁性固定化纤维素酶加入到磁场三相流化床酶解反应器中，施加磁场强度为1.0～5.0kA/m的磁场，再将流速10～70mL/min(即Ug)的空气鼓入磁场三相流化床酶解反应器，同时，将温度20℃～50℃、流量5～30mL/min(U1)的壳聚糖乙酸溶液加入磁场三相流化床酶解反应器，反应15～360min时间后，用超滤膜分离截留分子量<10,000的低聚壳聚糖。
第一步中，所述壳聚糖的分子量>＝6万。
第一步中，所述碱液为NaOH溶液或KOH溶液等。
第二步中，所述冲洗磁性微球是用石油醚、无水乙醇依次冲洗磁性微球。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
本发明研究了磁场强度、气体流速、液体流速等工艺条件对低聚壳聚糖制备的影响，找出最优工艺条件；并结合磁敏性固化酶颗粒对磁场的响应作用，考查稳恒磁场作用下酶降解壳聚糖的降解规律。本发明反应体系是由壳聚糖、磁性固定化纤维素酶和空气构成的三相物质，反应发生在液固之间。本发明不但可以提高高分子物质的降解率，而且为实现连续化生产提供理论依据，同时能够便于酶的回收、提高固定化酶的利用率，降低成本。
附图说明
图1为气体流速(Ug)对壳聚糖降解产物的影响图。
图2为Ug对壳聚糖降解产物的影响图。
图3为壳聚糖及其低聚壳聚糖的FTIR图。
其中，(a)降解前壳聚糖；(b)低聚壳聚糖(8<DP<16)。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例一
在稳恒磁场条件下制备低聚壳聚糖的方法，包括如下步骤：
第一步，用体积百分比浓度1％的乙酸溶液与壳聚糖溶液(壳聚糖分子量为6万)配置1mg/mL的壳聚糖乙酸溶液，用NaOH溶液调pH为4.0，得到壳聚糖乙酸溶液。
第二步，磁性壳聚糖微球的制备
取100mL壳聚糖乙酸溶液置于500mL烧瓶中，加入2.0g Fe3O4粉末，搅拌混合均匀，加入4mL Span—80、8mL正丁醇、100mL石蜡，待分散均匀后，在40℃条件下滴加2mL甲醛，10min后，滴加4mL甲醛，1h后，升温至80℃，再滴加6mL戊二醛，继续搅拌反应1h，反应结束，得到磁性微球，静置冷却至室温；用石油醚、无水乙醇依次冲洗磁性微球，用磁场收集磁性微球，置于50℃烘箱烘干；将干燥的微球筛分，得到干燥的磁性壳聚糖微球。
第三步，磁性固定化纤维素酶的制备
称取1.0g磁性壳聚糖微球加入50mL 0.2mol/L醋酸—醋酸钠缓冲液溶胀3小时，加入100mL的1.0mg/mL纤维素酶液，在20℃、100r/min的恒温振荡器上振荡，让磁性壳聚糖微球吸附纤维素酶，6h后，在稳恒磁场作用下(磁场强度1kA/m)将磁性壳聚糖微球沉淀，倒出上清液，用0.2mol/L醋酸—醋酸钠缓冲液反复冲洗磁性壳聚糖微球，直至洗液中用考马斯亮蓝法(BSA作标准品)检测不到蛋白为止；得到磁性固定化纤维素酶，将磁性固定化纤维素酶冷冻干燥。
第四步，将50g磁性固定化纤维素酶加入到磁场三相流化床酶解反应器中，操作压力0.1MPa；施加磁场强度1.0kA/m的磁场，再将流速10mL/min(即Ug)的空气鼓入磁场三相流化床酶解反应器，同时，将温度20℃、流量5mL/min(U1)的壳聚糖乙酸溶液通入磁场三相流化床酶解反应器，反应15min时间后，用超滤膜分离截留分子量<10,000的壳聚糖降解产物，分离提纯后，得到了聚合度(DP)<8(即分子量<1500)的低聚壳聚糖，采用高效液相色谱法(HPLC)对产物进行分析，如图2所示，得到的产物为低聚壳二糖、低聚壳三糖、低聚壳四糖、低聚壳五糖和低聚壳六糖。
实施例二
在稳恒磁场条件下制备低聚壳聚糖的方法，包括如下步骤：
第一步，用体积百分比浓度2％的乙酸溶液与壳聚糖溶液(壳聚糖分子量为6万)配置10mg/mL的壳聚糖乙酸溶液，用NaOH溶液调pH为4.5，得到壳聚糖乙酸溶液。
第二步，磁性壳聚糖微球的制备
取150mL壳聚糖乙酸溶液置于500mL烧瓶中，加入3.0g Fe3O4粉末，搅拌混合均匀，加入6mL Span—80、10mL正丁醇、150mL石蜡，待分散均匀后，在60℃条件下滴加6.0mL甲醛，130min后，滴加6.0mL甲醛，2h后，升温至60℃，再滴加8.0mL戊二醛，继续搅拌反应2h，反应结束，得到磁性微球，静置冷却至室温；用石油醚、无水乙醇依次冲洗磁性微球，用磁场收集磁性微球，置于50℃烘箱烘干；将干燥的微球筛分，得到干燥的磁性壳聚糖微球。
第三步，磁性固定化纤维素酶的制备
称取3.0g磁性壳聚糖微球加入150mL 0.1mol/L醋酸—醋酸钠缓冲液溶胀2小时，加入300mL的1.0mg/mL纤维素酶液，在30℃、150r/min的恒温振荡器上振荡，让磁性壳聚糖微球吸附纤维素酶，10h后，在稳恒磁场作用下(磁场强度1.5kA/m)将磁性壳聚糖微球沉淀，倒出上清液，用0.1mol/L醋酸—醋酸钠缓冲液反复冲洗磁性壳聚糖微球，直至洗液中用考马斯亮蓝法(BSA作标准品)检测不到蛋白为止；得到磁性固定化纤维素酶，将磁性固定化纤维素酶冷冻干燥。
第四步，将30g磁性固定化纤维素酶加入到磁场三相流化床酶解反应器中，操作压力0.15MPa；施加磁场强度3.0kA/m的磁场，再将流速50mL/min(即Ug)的空气鼓入磁场三相流化床酶解反应器，同时，将温度30℃、流量20mL/min(U1)的壳聚糖乙酸溶液通入磁场三相流化床酶解反应器，反应240min时间后，用超滤膜分离截留分子量<10,000的壳聚糖降解产物，分离提纯后，得到了聚合度(DP)<8(即分子量<1500)的低聚壳聚糖(低聚壳二糖、低聚壳三糖、低聚壳四糖、低聚壳五糖和低聚壳六糖)，采用HPLC对低聚壳五糖和低聚壳六糖进行了定量分析。如图3所示，在稳恒磁场作用下，缩短了达到最大产物产量的时间，即提高了产物的产率，节省了成本。
实施例三
在稳恒磁场条件下制备低聚壳聚糖的方法，包括如下步骤：
第一步，用体积百分比浓度3％的乙酸溶液与壳聚糖溶液(壳聚糖分子量6万)配置30mg/mL的壳聚糖乙酸溶液，用KOH调pH为5.0，得到壳聚糖乙酸溶液。
第二步，磁性壳聚糖微球的制备
取200mL壳聚糖乙酸溶液置于500mL烧瓶中，加入3.5g Fe3O4粉末，搅拌混合均匀，加入10mL Span—80、30mL正丁醇、300mL石蜡，待分散均匀后，在80℃条件下滴加8.0mL甲醛，60min后，滴加8.0mL甲醛，3h后，升温至100℃，再滴加10.0mL戊二醛，继续搅拌反应3h，反应结束，得到磁性微球，静置冷却至室温；用石油醚、无水乙醇依次冲洗磁性微球，用磁场收集磁性微球，置于60℃烘箱烘干；将干燥的微球筛分，得到磁性壳聚糖微球。
第三步，磁性固定化纤维素酶的制备
称取5.0g磁性壳聚糖微球加入250mL的0.5mol/L醋酸—醋酸钠缓冲液溶胀5小时，加入500mL的1.0mg/mL纤维素酶液，在40℃、250r/min的恒温振荡器上振荡，让磁性壳聚糖微球吸附纤维素酶，16h后，在稳恒磁场作用下(磁场强度100kA/m)将磁性壳聚糖微球沉淀，倒出上清液，用0.5mol/L醋酸—醋酸钠缓冲液反复冲洗磁性壳聚糖微球，直至洗液中用考马斯亮蓝法(BSA作标准品)检测不到蛋白为止；得到磁性固定化纤维素酶，将磁性固定化纤维素酶冷冻干燥。
第四步，将200g磁性固定化纤维素酶加入到磁场三相流化床酶解反应器中，操作压力0.30MPa；施加磁场强度5.0kA/m的磁场，再将流速70mL/min(即Ug)的空气鼓入磁场三相流化床酶解反应器，同时，将温度50℃、流量30mL/min(U1)的壳聚糖乙酸溶液通入磁场三相流化床酶解反应器，反应360min时间后，用超滤膜分离截留分子量<10,000的壳聚糖降解产物，经分离提纯后，得到了8<DP<16(即分子量为1500～3000)的低聚壳聚糖(低聚壳七糖、低聚壳八糖、低聚壳九糖、低聚壳十糖、低聚壳十一糖和低聚壳十二糖、低聚壳十三糖和低聚壳十四糖、低聚壳十五糖)，如图4所示，在500cm-1～4000cm-1进行扫描，得到产物的FTIR光谱图，并与降解前的壳聚糖进行结构比较。结果表明，壳聚糖酶降解前后，其分子结构并没有非常的不同之处，只是分子链的长短发生了变化，由此可以推测降解前壳聚糖的一些生理功能降解后可能仍会保持，而且降解前后壳聚糖的晶体形态发生了明显改变，这说明低聚壳聚糖可能会产生一些新的生理特性，有助于其在食品、医药等领域进一步利用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1、在稳恒磁场条件下制备低聚壳聚糖的方法，其特征在于包括如下步骤：
第一步，壳聚糖乙酸溶液的配置
用体积百分比浓度1～3％的乙酸溶液将壳聚糖溶解配置成1～30mg/mL的壳聚糖乙酸溶液，用碱液调pH为4.0～5.0，得到壳聚糖乙酸溶液；
第二步，磁性壳聚糖微球的制备
在100～200mL壳聚糖乙酸溶液中加入2.0～3.5g Fe3O4粉末，搅拌混合均匀，加入4～10mL S司班-80、8～30mL正丁醇和100～300mL石蜡，待分散均匀后，在40～80℃条件下加入2～8.0mL甲醛，反应10～60min后，继续加入4～8.0mL甲醛，反应1～3h后，升温至60～100℃，再加入6～10.0mL戊二醛，继续搅拌反应1～3h，反应结束，得到磁性微球，静置冷却至室温，冲洗磁性微球，用磁场收集磁性微球，置于30～60℃烘干；将干燥的磁性微球筛分，得到磁性壳聚糖微球；
第三步，磁性固定化纤维素酶的制备
将1.0～5.0g磁性壳聚糖微球加入50～250mL的0.1～0.5mol/L醋酸—醋酸钠缓冲液中溶胀2～5小时，加入100～500mL的1.0mg/mL纤维素酶液，在20～40℃、100～250r/min的恒温振荡器上振荡，让磁性壳聚糖微球吸附纤维素酶，6～16h后，在磁场强度<100kA/m的稳恒磁场作用下，将磁性壳聚糖微球沉淀，去上清液，用0.1～0.5mol/L醋酸—醋酸钠缓冲液反复冲洗磁性壳聚糖微球，直至洗液中检测不到蛋白为止；即得到磁性固定化纤维素酶；
第四步，低聚壳聚糖的制备
将30～200g磁性固定化纤维素酶加入到磁场三相流化床酶解反应器中，施加磁场强度为1.0～5.0kA/m的磁场，再将流速10～70mL/min的空气鼓入磁场三相流化床酶解反应器，同时，将温度20℃～50℃、流量5～30mL/min的壳聚糖乙酸溶液加入磁场三相流化床酶解反应器，反应15～360min时间后，用超滤膜分离截留分子量<10,000的低聚壳聚糖。
2、根据权利要求1所述的在稳恒磁场条件下制备低聚壳聚糖的方法，其特征在于：第一步中，所述壳聚糖的分子量>＝6万。
3、根据权利要求1所述的在稳恒磁场条件下制备低聚壳聚糖的方法，其特征在于：第一步中，所述碱液为NaOH溶液或KOH溶液。
4、根据权利要求1所述的在稳恒磁场条件下制备低聚壳聚糖的方法，其特征在于：第二步中，所述冲洗磁性微球是用石油醚、无水乙醇依次冲洗磁性微球。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Open date: 20090401 |