CN110373408B - 一种以聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种以聚多巴胺‑磁性Fe3O4纳米粒子固定化D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的方法，属于食品加工技术领域。本发明步骤是：制备D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶和聚多巴胺‑磁性Fe3O4纳米粒子，再以聚多巴胺‑磁性Fe3O4纳米粒子固定化D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶。聚多巴胺‑磁性Fe3O4纳米粒子既具有强烈的磁响应性，在外加磁场的作用下能够有效被磁力控制，还能通过聚多巴胺表面的高活性酚羟基等功能基团增强固定化的效果，提高载体的稳定性和酶的负载量，固定化酶的酶活力可达450.45U/g载体以上。

Description

一种以聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子固定化D-阿洛酮糖3-差 向异构酶的方法
技术领域
本发明涉及一种以聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，属于食品加工技术领域。
背景技术
传统的甜味剂如蔗糖热量高，过多的摄入会导致糖尿病、肥胖和心血管疾病等慢性病的发生，因此开发新型的低热量功能性甜味剂已经成为国际食品科学的研究热点。目前，木糖醇、低聚果糖、赤藓糖醇等功能性甜味剂已经在发达国家被广泛应用，但由于在口感和甜度等方面与蔗糖存在一些差距，所以不能完全取代蔗糖。D-阿洛酮糖作为稀少糖的一种，其甜度是蔗糖的70％左右，几乎不含热量。此外，D-阿洛酮糖具有葡萄糖和果糖所没有的生理功能，如在吃饭时食用D-阿洛酮糖，可以很好地抑制血糖上升。D-阿洛酮糖还可以防龋齿、预防和改善糖尿病以及抑制体内脂肪的累积。美国食品药品监督管理局于2014年正式批准D- 阿洛酮糖为一般公认安全(Generally Recognized as Safe，GRAS)，允许其应用于食品、膳食补充剂以及医药制剂中。
D-阿洛酮糖又被称为D-核糖-2-己酮糖，是D-果糖C-3位上的差向异构体。它在自然界中存在的含量极少，而化学合成法存在纯化步骤复杂、副产物多、污染严重等诸多问题，因此具有高度的专一性(反应专一性和底物专一性)的生物催化法合成D-阿洛酮糖引起了广泛的关注。其中D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase，DPEase，EC5.1.3.30)可实现D-果糖和D-阿洛酮糖之间的相互转化。
由于固定化酶易于从反应溶液中分离出来，可被重复使用，生产成本低，过敏性风险低，稳定性较游离酶具有明显的优势，对绿色和可持续产品的制造环境具有不可或缺的重要性，故被广泛应用于食品工业生产中。使用固定化酶技术时，固定化酶与酶促反应混合物的有效分离是需要克服的关键难题。磁性纳米粒子具备表面效应、小尺寸效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应四项基本纳米粒子效应以及超顺磁性、高矫顽力、低居里温度和高磁化率等特殊的磁学性质，意味着这种材料比表面积大，颗粒表面存在羟基，易与酶分子产生较强的键合作用，低孔隙率和优异的机械稳定性有助于减少空间位阻，这些特征对于开发稳定的酶- 基质催化体系非常重要。Fe3O4磁性纳米粒子因比表面积大引发的高表面能而倾向于出现团聚现象，化学活性高、易氧化等特征会导致磁性和分散性的丧失，造成磁分离效率降低，影响固定化的吸附效果。因此，利用一些方法来帮助改善这些缺陷，应用改善后的固定化酶法生产功能广泛的有益物质比如D-阿洛酮糖，对于固定化酶的进一步应用有着重要的意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，是以聚多巴胺- 磁性Fe3O4纳米粒子为载体，先制备D-阿洛酮糖3-差向异构酶和聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子，再用聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶。
在本发明的一种实施方式中，所述聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子固定化D-阿洛酮糖3- 差向异构酶的具体步骤包括：
(1)将聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子加入Tris-HCl缓冲液充分浸泡，4～5h磁分离；
(2)添加D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶液，在pH 7.0～9.0、3～5℃的条件下，以100～200 rpm的转速在恒温摇床中振荡固定化24～48h；
(3)通过磁场进行分离，用缓冲液反复洗涤，直至洗涤液中检测不到酶活，即得到固定化酶。
在本发明的一种实施方式中，所述聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子添加量为0.3～0.55g， D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶液的添加量为1～3mL，酶活为125～250U。
在本发明的一种实施方式中，所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶的制备方法包括：
(1)将重组菌Bacillus subtilis 1A751/pUB-P43dpe-dal接种至3～5mL LB液体培养基中，于35～39℃、150～200r/min培养8-14h，培养液按照2～3％的接种量转移至40～60mL LB培养基中，于35～39℃、150～200r/min发酵12～14h；
(2)收集步骤(1)得到的发酵液，6000～8000r/min离心10～15min收集菌体，用pH7.0～9.0、50～60mmol/L Tris-HCl缓冲溶液洗涤菌体三次后，用pH 7.0～9.0、50～60mmol/L Tris-HCl重悬菌体；加入20～30mg/mL溶菌酶，35～39℃水浴保温20～40min；将离心管置于冰上，超声破碎细胞10～15min；破碎后的细胞液于3～5℃条件下8000～10000r/min离心15～25 min，去除细胞碎片，取上清液。用0.45μm的滤膜过滤，得到的即为粗酶液；
(3)将粗酶液经冷冻真空干燥制成粗酶粉。
所述重组菌Bacillus subtilis 1A751/pUB-P43dpe-dal公开于公开号为CN104894047 A的专利文献中。
在本发明的一种实施方式中，所述聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子的制备方法包括：
(1)分别准备40～60mL 0.2mol/L FeCl2·4H2O和0.4mol/L FeCl3·6H2O，加入20～30mL 10 mol/L NaOH于70℃反应40～60min。反应结束后利用磁场分离磁性Fe3O4纳米粒子并用蒸馏水冲洗三次；
(2)将磁性Fe3O4纳米粒子溶解在pH 7.0～9.0、50～60mmol/L的Tris-HCl缓冲液中，超声10～15min，加入200～500mg的盐酸多巴胺，用0.1～0.2mol/L NaOH溶液调节pH至8.0～8.5，常温搅拌30～60min；
(3)反应结束后利用磁场分离聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子，用80～95％乙醇溶液和蒸馏水交替洗涤纳米颗粒，将其保存在超纯水中，于3～5℃下储存。
在本发明的一种实施方式中，Tris-HCl缓冲液pH为7.0～9.0、浓度为50～60mmol/L。
本发明的另一个目的是提供一种聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子，以FeCl2·4H2O或FeCl3·6H2O为铁源，氨水为碱，以聚多巴胺作为吸附剂，利用化学共沉淀方法一步合成。
本发明还提供了上述方法在生产D-阿洛酮糖或含D-阿洛酮糖的产品中的应用。
本发明以聚多巴胺为吸附剂，通过自聚合作用在Fe3O4纳米粒子表面形成外壳，合成具有磁性的聚多巴胺-Fe3O4纳米粒子，以此进行D-阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化。聚多巴胺 -磁性Fe3O4纳米粒子既具有强烈的磁响应性，在外加磁场的作用下能够有效被磁力控制，还能通过聚多巴胺表面的高活性酚羟基等功能基团增强固定化的效果，提高载体的稳定性和酶的负载量，固定化酶的酶活力可达450.45U/g载体以上。
具体实施方式
(一)D-阿洛酮糖3-差向异构酶的酶活测定
游离酶的酶活测定：0.9mL 80g/L的果糖和0.1mL的酶液，反应缓冲体系为50mmol/L、 pH 7.5的Tris-HCl缓冲液，混匀，在55℃水浴中保温反应10min后，立即转移至沸腾的热水中，加热5min终止反应。
固定化酶的酶活测定：取0.1g固定化酶，加入0.1mL的50mmol/L、pH 7.5的Tris-HCl 缓冲液和0.9mL 80g/L的果糖溶液，在55℃水浴中保温反应10min后，立即转移至沸腾的热水中，加热5min终止反应。
酶活定义：在上述条件下，1min生成1μmol的D-阿洛酮糖所需的酶量为一个酶活单位。
(二)高效液相色谱法(HPLC)测定D-阿洛酮糖含量：
HPLC条件：Waters e2695型高效液相色谱仪；色谱柱：Carbomix Ca-NP；流动相：超纯水；流速：0.6mL/min；柱温：85℃；检测器：示差折光检测器；检测器温度：30℃；进样量：10μL。
实施例1一种以聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法
(1)D-阿洛酮糖3-差向异构酶的制备：将重组菌Bacillus subtilis 1A751/pUB-P43dpe-dal 接种至LB液体培养基，37℃过夜培养。以3％的接种量转移至LB培养基中，37℃培养14h。收集发酵液，冷冻离心后用pH 7.5、50mmol/L Tris-HCl缓冲溶液洗涤菌体，用pH7.5、50 mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液重悬菌体。加入20mg/mL溶菌酶，37℃水浴保温30min。超声破碎处理细胞10min后4℃离心20min，取上清液。用0.45μm的滤膜过滤，将粗酶液冷冻真空干燥制成粗酶粉。
(2)聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子的制备：分别准备50mL 0.2mol/L FeCl2·4H2O和0.4 mol/L FeCl3·6H2O，加入30mL 10mol/L NaOH于70℃反应60min。反应结束后利用磁场分离并用蒸馏水冲洗三次。加入100mL 2mg/mL的盐酸多巴胺，用0.1mol/L NaOH溶液调节pH至8.5，常温搅拌40min。反应结束后利用磁场分离，用80～95％乙醇溶液和蒸馏水交替洗涤纳米颗粒，将其保存在超纯水中，于4℃下储存。
(3)聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶：称取0.5g聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子加入pH 7.5、50mmol/L的Tris-HCl缓冲液充分浸泡，4～5h磁分离；添加126U的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，在pH6.5、4℃的条件下，以150rpm的转速在恒温摇床中振荡固定化24h；通过磁场进行分离，用缓冲液反复洗涤，直至洗涤液中检测不到酶活，即得到固定化酶。测得固定化酶的酶活力为88.28U/g载体。
实施例2一种以聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法
(1)D-阿洛酮糖3-差向异构酶的制备：将重组菌Bacillus subtilis 1A751/pUB-P43dpe-dal 接种至LB液体培养基，37℃过夜培养。以3％的接种量转移至LB培养基中，37℃培养14h。收集发酵液，冷冻离心后用pH 7.5、50mmol/L Tris-HCl缓冲溶液洗涤菌体，用pH7.5、50 mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液重悬菌体。加入20mg/mL溶菌酶，37℃水浴保温30min。超声破碎处理细胞10min后4℃离心20min，取上清液。用0.45μm的滤膜过滤，将粗酶液冷冻真空干燥制成粗酶粉。
(2)聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子的制备：分别准备50mL 0.2mol/L FeCl2·4H2O和0.4 mol/L FeCl3·6H2O，加入30mL 10mol/L NaOH于70℃反应60min。反应结束后利用磁场分离并用蒸馏水冲洗三次。加入100mL 2mg/mL的盐酸多巴胺，用0.1mol/L NaOH溶液调节pH至8.5，常温搅拌40min。反应结束后利用磁场分离，用80～95％乙醇溶液和蒸馏水交替洗涤纳米颗粒，将其保存在超纯水中，于4℃下储存。
(3)聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶：称取0.5g聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子加入pH 7.5、50mmol/L的Tris-HCl缓冲液充分浸泡，4～5h磁分离；添加126U的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，在pH 7.5、4℃的条件下，以150rpm的转速在恒温摇床中振荡固定化24h；通过磁场进行分离，用缓冲液反复洗涤，直至洗涤液中检测不到酶活，即得到固定化酶。测得固定化酶的酶活力为117.96U/g载体。
实施例3一种以聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法
(1)D-阿洛酮糖3-差向异构酶的制备：将重组菌Bacillus subtilis 1A751/pUB-P43dpe-dal 接种至LB液体培养基，37℃过夜培养。以3％的接种量转移至LB培养基中，37℃培养14h。收集发酵液，冷冻离心后用pH 7.5、50mmol/L Tris-HCl缓冲溶液洗涤菌体，用pH7.5、50 mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液重悬菌体。加入20mg/mL溶菌酶，37℃水浴保温30min。超声破碎处理细胞10min后4℃离心20min，取上清液。用0.45μm的滤膜过滤，将粗酶液冷冻真空干燥制成粗酶粉。
(2)聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子的制备：分别准备50mL 0.2mol/L FeCl2·4H2O和0.4 mol/L FeCl3·6H2O，加入30mL 10mol/L NaOH于70℃反应60min。反应结束后利用磁场分离并用蒸馏水冲洗三次。加入100mL 2mg/mL的盐酸多巴胺，用0.1mol/L NaOH溶液调节pH至8.5，常温搅拌40min。反应结束后利用磁场分离，用80～95％乙醇溶液和蒸馏水交替洗涤纳米颗粒，将其保存在超纯水中，于4℃下储存。
(3)聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶：称取0.55g聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子加入pH 7.5、50mmol/L的Tris-HCl缓冲液充分浸泡，4～5h磁分离；添加250U的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，在pH8.5、4℃的条件下，以150rpm的转速在恒温摇床中振荡固定化48h；通过磁场进行分离，用缓冲液反复洗涤，直至洗涤液中检测不到酶活，即得到固定化酶。测得固定化酶的酶活力为400.15U/g载体。
实施例4一种以聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法
(1)D-阿洛酮糖3-差向异构酶的制备：将重组菌Bacillus subtilis 1A751/pUB-P43dpe-dal 接种至LB液体培养基，37℃过夜培养。以3％的接种量转移至LB培养基中，37℃培养14h。收集发酵液，冷冻离心后用pH 7.5、50mmol/L Tris-HCl缓冲溶液洗涤菌体，用pH7.5、50 mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液重悬菌体。加入20mg/mL溶菌酶，37℃水浴保温30min。超声破碎处理细胞10min后4℃离心20min，取上清液。用0.45μm的滤膜过滤，将粗酶液冷冻真空干燥制成粗酶粉。
(2)聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子的制备：分别准备50mL 0.2mol/L FeCl2·4H2O和0.4 mol/L FeCl3·6H2O，加入30mL 10mol/L NaOH于70℃反应60min。反应结束后利用磁场分离并用蒸馏水冲洗三次。加入100mL 3mg/mL的盐酸多巴胺，用0.1mol/L NaOH溶液调节pH至8.5，常温搅拌40min。反应结束后利用磁场分离，用80～95％乙醇溶液和蒸馏水交替洗涤纳米颗粒，将其保存在超纯水中，于4℃下储存。
(3)聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶：称取0.55g聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子加入pH 7.5、50mmol/L的Tris-HCl缓冲液充分浸泡，4～5h磁分离；添加250U的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，在pH8.5、4℃的条件下，以150rpm的转速在恒温摇床中振荡固定化48h；通过磁场进行分离，用缓冲液反复洗涤，直至洗涤液中检测不到酶活，即得到固定化酶。测得固定化酶的酶活力为435.46U/g载体。
实施例5一种以聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法
(1)D-阿洛酮糖3-差向异构酶的制备：将重组菌Bacillus subtilis 1A751/pUB-P43dpe-dal 接种至LB液体培养基，37℃过夜培养。以3％的接种量转移至LB培养基中，37℃培养14h。收集发酵液，冷冻离心后用pH 7.5、50mmol/L Tris-HCl缓冲溶液洗涤菌体，用pH7.5、50 mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液重悬菌体。加入20mg/mL溶菌酶，37℃水浴保温30min。超声破碎处理细胞10min后4℃离心20min，取上清液。用0.45μm的滤膜过滤，将粗酶液冷冻真空干燥制成粗酶粉。
(2)聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子的制备：分别准备50mL 0.2mol/L FeCl2·4H2O和0.4 mol/L FeCl3·6H2O，加入30mL 10mol/L NaOH于70℃反应60min。反应结束后利用磁场分离并用蒸馏水冲洗三次。加入100mL 4mg/mL的盐酸多巴胺，用0.1mol/L NaOH溶液调节pH至8.5，常温搅拌40min。反应结束后利用磁场分离，用80～95％乙醇溶液和蒸馏水交替洗涤纳米颗粒，将其保存在超纯水中，于4℃下储存。
(3)聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶：称取0.5g聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子加入pH 7.5、50mmol/L的Tris-HCl缓冲液充分浸泡，4～5h磁分离；添加250U的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，在pH8.5、4℃的条件下，以150rpm的转速在恒温摇床中振荡固定化36h；通过磁场进行分离，用缓冲液反复洗涤，直至洗涤液中检测不到酶活，即得到固定化酶。测得固定化酶的酶活力为450.45U/g载体。
对比例
(1)D-阿洛酮糖3-差向异构酶的制备：将重组菌Bacillus subtilis 1A751/pUB-P43dpe-dal 接种至LB液体培养基，37℃过夜培养。以3％的接种量转移至LB培养基中，37℃培养14h。收集发酵液，冷冻离心后用pH 7.5、50mmol/L Tris-HCl缓冲溶液洗涤菌体，用pH7.5、50 mmol/L Tris-HCl重悬菌体。加入20mg/mL溶菌酶，37℃水浴保温30min。超声破碎处理细胞10min后4℃离心20min，取上清液。用0.45μm的滤膜过滤，将粗酶液冷冻真空干燥制成粗酶粉。
(2)Duolite A568树脂的预处理：树脂用两倍树脂体积的95％乙醇浸泡20h，弃杂液，用乙醇继续浸泡4h，再用去离子水洗去杂质和浮色，直至溶液pH呈中性，用于固定化。
(3)固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶：称取0.5g Duolite A568树脂，添加250U的D- 阿洛酮糖3-差向异构酶溶液，以150rpm的转速在恒温摇床中振荡固定化36h；通过过滤进行分离，用缓冲液反复洗涤，直至洗涤液中检测不到酶活，即得到固定化酶。测得固定化酶的酶活力为108.3U/g载体。
实施例6一种以聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法
(1)D-阿洛酮糖3-差向异构酶的制备：将重组菌Bacillus subtilis 1A751/pUB-P43dpe-dal 接种至LB液体培养基，37℃过夜培养。以3％的接种量转移至LB培养基中，37℃培养14h。收集发酵液，冷冻离心后用pH 7.5、50mmol/L Tris-HCl缓冲溶液洗涤菌体，用pH7.5、50 mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液重悬菌体。加入20mg/mL溶菌酶，37℃水浴保温30min。超声破碎处理细胞10min后4℃离心20min，取上清液。用0.45μm的滤膜过滤，将粗酶液冷冻真空干燥制成粗酶粉。
(2)聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子的制备：分别准备50mL 0.2mol/L FeCl2·4H2O和0.4 mol/L FeCl3·6H2O，加入30mL 10mol/L NaOH于70℃反应60min。反应结束后利用磁场分离并用蒸馏水冲洗三次。加入100mL 5mg/mL的盐酸多巴胺，用0.1mol/L NaOH溶液调节pH至8.5，常温搅拌40min。反应结束后利用磁场分离，用80～95％乙醇溶液和蒸馏水交替洗涤纳米颗粒，将其保存在超纯水中，于4℃下储存。
(3)聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶：称取0.5g聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子加入pH 7.5、50mmol/L的Tris-HCl缓冲液充分浸泡，4～5h磁分离；添加200U的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，在pH8.5、4℃的条件下，以150rpm的转速在恒温摇床中振荡固定化24h；通过磁场进行分离，用缓冲液反复洗涤，直至洗涤液中检测不到酶活，即得到固定化酶。测得固定化酶的酶活力为380.27U/g载体。
实施例7一种以聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法
(1)D-阿洛酮糖3-差向异构酶的制备：将重组菌Bacillus subtilis 1A751/pUB-P43dpe-dal 接种至LB液体培养基，37℃过夜培养。以3％的接种量转移至LB培养基中，37℃培养14h。收集发酵液，冷冻离心后用pH 7.5、50mmol/L Tris-HCl缓冲溶液洗涤菌体，用pH7.5、50 mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液重悬菌体。加入20mg/mL溶菌酶，37℃水浴保温30min。超声破碎处理细胞10min后4℃离心20min，取上清液。用0.45μm的滤膜过滤，将粗酶液冷冻真空干燥制成粗酶粉。
(2)聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子的制备：分别准备50mL 0.2mol/L FeCl2·4H2O和0.4 mol/L FeCl3·6H2O，加入30mL 10mol/L NaOH于70℃反应60min。反应结束后利用磁场分离并用蒸馏水冲洗三次。加入100mL 4mg/mL的盐酸多巴胺，用0.1mol/L NaOH溶液调节pH至8.5，常温搅拌30min。反应结束后利用磁场分离，用80～95％乙醇溶液和蒸馏水交替洗涤纳米颗粒，将其保存在超纯水中，于4℃下储存。
(3)聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶：称取0.5g聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子加入pH 7.5、50mmol/L的Tris-HCl缓冲液充分浸泡，4～5h磁分离；添加200U的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，在pH8.5、4℃的条件下，以150rpm的转速在恒温摇床中振荡固定化24h；通过磁场进行分离，用缓冲液反复洗涤，直至洗涤液中检测不到酶活，即得到固定化酶。测得固定化酶的酶活力为325.16U/g载体。
实施例8一种以聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法
(1)D-阿洛酮糖3-差向异构酶的制备：将重组菌Bacillus subtilis 1A751/pUB-P43dpe-dal 接种至LB液体培养基，37℃过夜培养。以3％的接种量转移至LB培养基中，37℃培养14h。收集发酵液，冷冻离心后用pH 7.5、50mmol/L Tris-HCl缓冲溶液洗涤菌体，用pH7.5、50 mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液重悬菌体。加入20mg/mL溶菌酶，37℃水浴保温30min。超声破碎处理细胞10min后4℃离心20min，取上清液。用0.45μm的滤膜过滤，将粗酶液冷冻真空干燥制成粗酶粉。
(2)聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子的制备：分别准备50mL 0.2mol/L FeCl2·4H2O和0.4 mol/L FeCl3·6H2O，加入30mL 10mol/L NaOH于70℃反应60min。反应结束后利用磁场分离并用蒸馏水冲洗三次。加入100mL 4mg/mL的盐酸多巴胺，用0.1mol/L NaOH溶液调节pH至8.5，常温搅拌50min。反应结束后利用磁场分离，用80～95％乙醇溶液和蒸馏水交替洗涤纳米颗粒，将其保存在超纯水中，于4℃下储存。
(3)聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶：称取0.5g聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子加入pH 7.5、50mmol/L的Tris-HCl缓冲液充分浸泡，4～5h磁分离；添加200U的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，在pH8.5、4℃的条件下，以150rpm的转速在恒温摇床中振荡固定化36h；通过磁场进行分离，用缓冲液反复洗涤，直至洗涤液中检测不到酶活，即得到固定化酶。测得固定化酶的酶活力为372.22U/g载体。
实施例9一种以聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法
(1)D-阿洛酮糖3-差向异构酶的制备：将重组菌Bacillus subtilis 1A751/pUB-P43dpe-dal 接种至LB液体培养基，37℃过夜培养。以3％的接种量转移至LB培养基中，37℃培养14h。收集发酵液，冷冻离心后用pH 7.5、50mmol/L Tris-HCl缓冲溶液洗涤菌体，用pH7.5、50 mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液重悬菌体。加入20mg/mL溶菌酶，37℃水浴保温30min。超声破碎处理细胞10min后4℃离心20min，取上清液。用0.45μm的滤膜过滤，将粗酶液冷冻真空干燥制成粗酶粉。
(2)聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子的制备：分别准备50mL 0.2mol/L FeCl2·4H2O和0.4 mol/L FeCl3·6H2O，加入30mL 10mol/L NaOH于70℃反应60min。反应结束后利用磁场分离并用蒸馏水冲洗三次。加入100mL 4mg/mL的盐酸多巴胺，用0.1mol/L NaOH溶液调节pH至8.5，常温搅拌60min。反应结束后利用磁场分离，用80～95％乙醇溶液和蒸馏水交替洗涤纳米颗粒，将其保存在超纯水中，于4℃下储存。
(3)聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶：称取0.3g聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子加入pH 7.5、50mmol/L的Tris-HCl缓冲液充分浸泡，4～5h磁分离；添加210U的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，在pH8.5、4℃的条件下，以150rpm的转速在恒温摇床中振荡固定化48h；通过磁场进行分离，用缓冲液反复洗涤，直至洗涤液中检测不到酶活，即得到固定化酶。测得固定化酶的酶活力为186.90U/g载体。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (6)

1.一种固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）制备D-阿洛酮糖3-差向异构酶溶液；
（2）聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子的制备：分别向40~60 mL 0.2 mol/L FeCl2·4H2O和0.4 mol/L FeCl3·6H2O中，加入20~30 mL 10 mol/L NaOH于65~75°C反应40~60 min，反应结束后利用磁场分离磁性Fe3O4纳米粒子并用蒸馏水冲洗；
将用蒸馏水冲洗后的磁性Fe3O4纳米粒子溶解在Tris-HCl缓冲液中，超声10~15 min后，加入200~500 mg的盐酸多巴胺，并用0.1~0.2 mol/L NaOH溶液调节pH至8.0~8.5，常温搅拌30~60 min；
反应结束后利用磁场分离聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子，用80~95%乙醇溶液和蒸馏水交替洗涤纳米颗粒，得到聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子；
（3）聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶：将步骤（2）得到的聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子加入Tris-HCl缓冲液充分浸泡后，磁分离4~5 h；
向磁分离后的聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子中添加步骤（1）得到的D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶液，并在pH 7.0~9.0、3~5°C的条件下，以100~200 rpm的转速在恒温摇床中振荡进行固定化；
将固定了D-阿洛酮糖3-差向异构酶的聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子通过磁场进行分离，用缓冲液反复洗涤，直至洗涤液中检测不到酶活，即得到固定化酶。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子添加量为0.3~0.55 g，D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶液的添加量为1~3 mL，酶活为125~250 U。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，固定化时间为24~48 h。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶的制备方法包括：
（1）将重组菌Bacillus subtilis 1A751/pUB-P43dpe-dal接种至LB液体培养基中，于35~39°C、150~200 r/min培养8-14 h，培养液按照2~3%的接种量转移至40~60 mL LB培养基中，于35~39°C、150~200 r/min发酵12~14 h；
（2）收集步骤（1）得到的发酵液，离心，收集菌体，重悬菌体后破碎细胞；破碎后的细胞液离心去除细胞碎片，取上清液，过滤，即得粗酶液。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，Tris-HCl缓冲液pH为7.0~9.0、浓度为50~60mmol/L。
6.权利要求1-5任一所述的方法在生产D-阿洛酮糖或生产含D-阿洛酮糖的产品中的应用。
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