CN110734503B - 一种阿拉伯低聚半乳糖及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种阿拉伯低聚半乳糖及其制备和应用。该阿拉伯低聚半乳糖由重量百分含量为99％以上的多糖组成，所述多糖由阿拉伯糖与半乳糖组成，其中阿拉伯糖与半乳糖的摩尔比为1:16；阿拉伯低聚半乳糖的重均分子量为4000Da‑5000Da。其制备方法采用两步酶解，并采用超滤和纳滤耦合的方式对降解后的阿拉伯低聚半乳糖进行分离纯化，定向获得重均分子量4000Da‑5000Da阿拉伯低聚半乳糖，大大缩短了纯化时间，解决了现有技术不容易分离出某一固定值分子量低聚多糖的问题。本发明阿拉伯低聚半乳糖的支链取代度降低，其生物功能活性明显增强，对双歧杆菌等益生菌具有明显的体外促生长作用，因此阿拉伯低聚半乳糖可作为功能性低聚多糖应用于食品添加剂、保健品及医药领域。

Description

一种阿拉伯低聚半乳糖及其制备和应用

技术领域

本发明涉及多糖技术领域，具体涉及一种阿拉伯低聚半乳糖及其制备和应用。

背景技术

阿拉伯半乳聚糖(Arabinogalactan，AG)是一类具有高度支链的中性多糖，具有多种生物活性如抗肿瘤、抗氧化、免疫调节等，已有研究表明AG还具有调节肠道的功能，在2002年就已被美国FDA认证批准为食品添加剂。AG的相对分子质量约为6.8×10⁵Da，其结构主要由半乳聚糖作为主链，阿拉伯糖作为其支链与半乳糖通过β-1,3键或β-1,6键连接，但其相对分子质量较大，需要对其进行降解才能提高其生物活性。

然而降解无法定向获得所需分子量的低聚多糖，经实验表明，降解后的阿拉伯低聚半乳糖呈非连续性分布，跨度在1×10³到5×10³不等。另外葡萄糖、乳糖等小分子糖类会不同程度的包含在降解物中，这种分布使得分离单一分子量的多糖有较大难度，从而对多糖后续的理化研究以及结构分析产生影响。因此需要根据不同的需求对低聚多糖进行定向分离，目前使用膜分离的方法定向分离制备阿拉伯低聚半乳糖还尚未见报道。已有的对其他低聚多糖膜分离的研究，中国专利ZL201210132925.2中公开了一种功率超声与膜分离耦合连续降解多糖的装置与方法，其将功率超声降解与膜分离集成起来形成一体化的装置，进行难溶及粘度太大的大分子多糖的降解改性，对降解产物多糖的分子量进行有效控制，避免过度降解，大大提高整个反应体系的效率和目标产物的收率。中国专利申请CN102676609 B中公开了一种利用膜分离技术高效制备一类不均一性安络小皮伞多糖的方法，该研究依次采用无机陶瓷微滤膜、4000-9000k的无机陶瓷超滤膜浓缩纯化得到不均一性安络小皮伞类多糖，并采用喷雾干燥的方法将多糖溶液制成粉末状产品，此法制作成本低，制作得到的产品质量好，保质期长。中国专利申请CN200610095055.0中公开了一种利用组合膜分离纯化浓缩桑黄多糖的方法，该方法采用了分子量为5000级的超滤有机膜系统纯化浓缩桑黄多糖，此法节能高效，无污染，低成本。上述这些方法无法直接用于分离纯化阿拉伯低聚半乳糖。

多糖现有的降解方法无法控制其断裂的糖苷键的位置，这带来的问题是，降解多糖的分子量分布较宽，使得降解物中可能同时含有目标分子量的多糖以及被过度降解而产生的分子量较小的多糖和寡糖和一些分子量较大的多糖，因此需要建立一种定向获得具有功能性低聚多糖的方法。

另外，现有的针对多糖的报道大多是关于多糖的一级结构研究，涉及多糖的高级结构分析的较少，比如对其单糖组成、糖苷键连接方式等的研究较少；越来越多的研究表明多糖重要功能的发挥是由其结构特征决定的，其高级结构(二级及三级结构)更为密切，多糖的生物活性与其分子量、分子链构象紧密相关，了解多糖分子的分子量、分子链构象等更有助于阐明其生物活性作用机制。所以发现新的多糖组分及活性，对研究开发新食品保健品、新药等领域是具有非常重要的科学意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种重均分子量为4000Da-5000Da的阿拉伯低聚半乳糖，其具有生物活性，且活性较阿拉伯半乳聚糖明显增强。

本发明的另一目的是提供所述阿拉伯低聚半乳糖的制备方法，该方法采用酶降解和膜法分离定向获得重均分子量为4000Da-5000Da的具有生物活性的功能性低聚多糖，具有操作简单、易于控制的优点，适于工业化大规模生产。

本发明还提供了所述阿拉伯低聚半乳糖的应用：其一是具有较强的氧自由基清除作用，可作为抗氧化剂使用，也可用于制备抗氧化剂；其二是对益生菌具有体外促生长作用，可作为碳源促进益生菌的增殖。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种阿拉伯低聚半乳糖，由重量百分含量为99％以上的多糖组成，所述多糖由阿拉伯糖(Araf)与半乳糖(Galp)组成，其中阿拉伯糖与半乳糖的摩尔比为1:16；所述阿拉伯低聚半乳糖的重均分子量为4000Da-5000Da(优选4500Da)。

进一步优选的，所述阿拉伯糖为α-阿拉伯糖，优选为α-L-阿拉伯糖；所述半乳糖为β-半乳糖，优选为β-D-半乳糖。

所述多糖的结构单元优选以(1→3)连接的β-D-半乳糖(β-D-Galp)残基(即1,3糖苷键连接的β-D-半乳糖残基)为主链，在主链上相邻的两个β-D-半乳糖残基的6位上分别被支链一和端基α-阿拉伯糖(α-Araf)(进一步优选α-L-阿拉伯糖(α-L-Araf))取代；支链一是(1→6)连接的β-D-半乳糖((1,6)-β-D-Galp)残基和端基β-D-半乳糖(β-D-Galp)。

所述阿拉伯低聚半乳糖的制备方法，包括步骤：

(1)降解：将0.05mol/L的柠檬酸缓冲液与β-1,3-半乳糖内切酶和阿拉伯半乳聚糖混合均匀，调节pH值并进行一次酶解，除去沉淀，得到上清液(即部分降解的阿拉伯低聚半乳糖降解液)，继续在上清液中加入α-阿拉伯糖苷酶，调节pH值并进行二次酶解，除去沉淀，得到降解液；

(2)膜分离纯化：将步骤(1)所得的降解液依次采用超滤膜和纳滤膜进行膜分离纯化，其中收集超滤膜透过液用纳滤膜分离纯化，收集纳滤膜截留液得到分离液；

(3)干燥：将步骤(2)中所得的分离液进行浓缩和干燥得到阿拉伯低聚半乳糖，命名为Oligo-AG2。

本发明中透过膜从膜外腔透过口流出的为透过液，未透过膜从回流口流回样品槽的为截留液。

为了达到更好的发明效果，优选：

步骤(1)中，所述阿拉伯半乳聚糖可采用市售产品，也可采用现有制备方法制备得到。

所述β-1,3-半乳糖内切酶与阿拉伯半乳聚糖的用量关系为10U-45U：1g；利于得到目标产物。

所述α-阿拉伯糖苷酶与阿拉伯半乳聚糖的用量关系为20U-65U：1g，进一步优选为40U-65U：1g；利于得到目标产物。

所述一次酶解的pH值优选为4.5-7.0(进一步优选为5.0-7.0)，酶解温度优选为35℃-55℃(进一步优选为45℃-55℃)，酶解时间优选为30h-60h。

所述二次酶解的pH值优选为5.5-7.5，酶解温度优选为45℃-65℃(进一步优选为50℃-65℃)，酶解时间优选为30h-60h。

所述柠檬酸缓冲液的体积与阿拉伯半乳聚糖的重量之比优选为(20mL-200mL)：(0.1g-1g)；进一步优选为(20mL-40mL)：(0.1g-0.8g)。

步骤(2)中，所述超滤膜截留分子量为3000Da-10000Da，进一步优选为4000Da-8000Da。

所述纳滤膜截留分子量为200Da-1000Da，进一步优选为200Da-800Da。

采用超滤膜和纳滤膜进行膜分离纯化的参数均为：压力差为0.1MPa-0.5Mpa(进一步优选为0.15MPa-0.3Mpa)，降解液温度为15℃-50℃(进一步优选为20℃-30℃)，膜面积为1.5m²-5m²(进一步优选为1.5m²-2.5m²)，降解液膜通量为0.1m²/h-2.5m²/h(进一步优选为0.2m²/h-0.8m²/h)。超滤膜和纳滤膜进行膜分离纯化的参数可以相同也可以不同。

所述超滤膜和纳滤膜进行膜分离纯化采用切向流的方式进行膜分离；分离效率高且纯化效果好。

所述降解液依次采用超滤膜和纳滤膜进行膜分离纯化步骤最好先将降解液稀释，分离效果更好，具体步骤包括：用水将降解液稀释至降解液重量百分比为40％-80％(进一步优选为50％-70％)。

所述阿拉伯低聚半乳糖具有生物活性，且活性较阿拉伯半乳聚糖明显增强，对益生菌具有体外促生长作用，可作为碳源促进益生菌的增殖，可用作益生菌生长促进剂或用于制备益生菌生长促进剂，可作为功能性低聚多糖应用于食品添加剂、保健品及医药领域。所述益生菌优选双歧杆菌、酪酸梭菌中的一种。

所述阿拉伯低聚半乳糖具有清除氧自由基的能力，在OH·自由基清除率测定中，在相同浓度的前提下，阿拉伯低聚半乳糖的OH·自由基清除率远大于阿拉伯半乳聚糖的OH·自由基清除率；表明本发明阿拉伯低聚半乳糖具有较强的抗氧自由基活性，可以直接作为抗氧化剂使用或者用于制备抗氧化剂，可用于食品添加剂、保健品及医药领域。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明阿拉伯低聚半乳糖重均分子量可以固定到4000Da-5000Da具体可到4500Da，并且其多糖部分的单糖组成为阿拉伯糖与半乳糖，且阿拉伯糖与半乳糖的摩尔比为1:16，这就为天然多糖产物的实际应用提供了技术支持，具备广泛的应用前景。

本发明阿拉伯低聚半乳糖与阿拉伯半乳聚糖相比，经过酶降解后的低聚多糖其分子量降低，阿拉伯低聚半乳糖的支链取代度即阿拉伯糖与半乳糖数量之比也相对降低，其生物功能活性明显增强，结构简单的低聚多糖作为微生物碳源时，可使得微生物酵解更快，因此在发酵过程中不仅可以支持双歧杆菌等益生菌的丰度增加，而且益生菌产生的短链脂肪酸也会增多，对双歧杆菌等益生菌具有明显的体外促生长作用，因此阿拉伯低聚半乳糖可作为功能性低聚多糖应用于食品添加剂、保健品及医药领域。

本发明制备方法在温和环境中采用β-1,3-半乳糖内切酶和α-阿拉伯糖苷酶分两步降解阿拉伯半乳聚糖，并采用超滤和纳滤耦合的方式对降解后的阿拉伯低聚半乳糖进行分离纯化，定向获得重均分子量4000Da-5000Da(优选4500Da)阿拉伯低聚半乳糖，且大大缩短了纯化时间，能够将阿拉伯半乳聚糖定向降解到固定值分子量并发现此段分子量的低聚多糖益生活性明显增强，解决了现有技术不容易分离出某一固定值分子量低聚多糖的问题。

本发明在使用膜法分离纯化阿拉伯低聚半乳糖的整个过程中没有发生相变，能对降解产物即阿拉伯低聚半乳糖的分子量进行有效控制，能够有效地去除降解液中的小分子，使得目标产物的产率大大提高，并且绿色环保，不会对环境产生污染。

附图说明

图1为实施例4中降解后阿拉伯半乳聚糖绝对重均分子质量的结果图，其中，横坐标为出峰时间(time/min)，纵坐标为仪器响应相对值(relative scale)。

图2为实施例5中红外光谱分析图，其中，图2(a)为AG在4000-400cm^-1波长范围内的红外光谱扫描图；图2(b)为Oligo-AG2在4000-400cm^-1波长范围内的红外光谱扫描图。

图3为实施例6中Oligo-AG2的核磁共振光谱图，其中图3(a)为Oligo-AG2的¹H-NMR谱，图3(b)为Oligo-AG2的¹³C-NMR谱，图3(c)为Oligo-AG2的HMBC谱，图3(d)为Oligo-AG2的COSY谱。

图4为实施例6中经过结构分析解析出的Oligo-AG2的结构式。

图5(a)为实施例7中AG的原子力显微镜扫描图，图5(b)为实施例7中Oligo-AG2的原子力显微镜扫描图。

图6(a)为实施例8中阿拉伯半乳聚糖和阿拉伯低聚半乳糖对动物双歧杆菌生长曲线的影响图。

图6(b)为实施例8中阿拉伯半乳聚糖和阿拉伯低聚半乳糖对酪酸梭菌生长曲线的影响图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。此外应理解，在阅读本发明公开的内容之后，本领域技术人员可以在本发明基础上做各种改动和修改，这些等价形式同样属于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

阿拉伯低聚半乳糖的制备：

(1)降解：取0.1g阿拉伯半乳聚糖于100ml的水解瓶中，在水解瓶中加入0.05mol/L的柠檬酸缓冲液20mL，按10U/g阿拉伯半乳聚糖的用量加入β-1,3-半乳糖内切酶(即每克阿拉伯半乳聚糖中加入10Uβ-1,3-半乳糖内切酶)，添加蒸馏水使酶解总体积为50mL，调节pH值为5.0，于200转/分、45℃的恒温摇床中酶解30h，离心去沉淀，得到上清液；继续在上清液中按65U/g阿拉伯半乳聚糖的用量加入α-阿拉伯糖苷酶(即每克阿拉伯半乳聚糖中加入65Uα-阿拉伯糖苷酶)，添加蒸馏水使酶解总体积为50mL，调节pH值为5.5，于200转/分、50℃的恒温摇床中酶解30h，离心去沉淀，最终得到降解后的上清液，即降解液。

(2)膜分离纯化：将步骤(1)所得的降解液用蒸馏水稀释至降解液的重量百分比为50％，依次采用分子量为4500Da的超滤膜和分子量为200Da的纳滤膜进行膜分离纯化，膜面积均为1.5m²，膜通量均为0.2m²/h，均在压力差为0.15MPa、料液温度为20℃的条件下采用切向流的方式进行膜分离，其中收集超滤透过液用纳滤膜分离纯化，收集纳滤截留液得到分离液。

(3)冷冻干燥：将步骤(2)中所得的分离液进行蒸发浓缩、冷冻干燥得到经过纯化的阿拉伯低聚半乳糖，命名为Oligo-AG2。

经检测，Oligo-AG2的重均分子量为4500Da。

实施例2

阿拉伯低聚半乳糖的制备：

(1)降解：取0.5g阿拉伯半乳聚糖于100ml的水解瓶中，在水解瓶中加入0.05mol/L的柠檬酸缓冲液30mL，按45U/g阿拉伯半乳聚糖的用量加入β-1,3-半乳糖内切酶(即每克阿拉伯半乳聚糖中加入45Uβ-1,3-半乳糖内切酶)，添加蒸馏水使酶解总体积为50mL，调节pH值为7.0，于200转/分、55℃的恒温摇床中酶解60h，离心去沉淀，得到上清液；继续在上清液中按50U/g阿拉伯半乳聚糖的用量加入α-阿拉伯糖苷酶(即每克阿拉伯半乳聚糖中加入50Uα-阿拉伯糖苷酶)，添加蒸馏水使酶解总体积为50mL，调节pH值为7.5，于200转/分、65℃的恒温摇床中酶解60h，离心去沉淀，最终得到降解后的上清液，即降解液。

(2)膜分离纯化：将步骤(1)所得的降解液用蒸馏水稀释至降解液的重量百分比为60％，依次采用分子量为5000Da的超滤膜和分子量为500Da的纳滤膜进行膜分离纯化，膜面积均为2.0m²，膜通量均为0.5m²/h，均在压力差为0.20MPa、料液温度为25℃的条件下采用切向流的方式进行膜分离，其中收集超滤透过液用纳滤膜分离纯化，收集纳滤截留液得到分离液。

(3)冷冻干燥：将步骤(2)中所得的分离液进行蒸发浓缩、冷冻干燥得到经过纯化的阿拉伯低聚半乳糖，命名为Oligo-AG2。

经检测，Oligo-AG2的重均分子量为4500Da。

实施例3

阿拉伯低聚半乳糖的制备：

(1)降解：取0.8g阿拉伯半乳聚糖于100ml的水解瓶中，在水解瓶中加入0.05mol/L的柠檬酸缓冲液40mL，按30U/g阿拉伯半乳聚糖的用量加入β-1,3-半乳糖内切酶(即每克阿拉伯半乳聚糖中加入30Uβ-1,3-半乳糖内切酶)，添加蒸馏水使酶解总体积为50mL，调节pH值为5.5，于200转/分、45℃的恒温摇床中酶解48h，离心去沉淀，得到上清液；继续在上清液中按40U/g阿拉伯半乳聚糖的用量加入α-阿拉伯糖苷酶(即每克阿拉伯半乳聚糖中加入40Uα-阿拉伯糖苷酶)，添加蒸馏水使酶解总体积为50mL，调节pH值为6.5，于200转/分、50℃的恒温摇床中酶解50h，离心去沉淀，最终得到降解后的上清液，即降解液。

(2)膜分离纯化：将步骤(1)所得的降解液用蒸馏水稀释至降解液的重量百分比为70％，依次采用分子量为8000Da的超滤膜和分子量为800Da的纳滤膜进行膜分离纯化，膜面积均为2.5m²，膜通量均为0.8m²/h，均在压力差为0.30MPa、料液温度为30℃的条件下采用切向流的方式进行膜分离，其中收集超滤透过液用纳滤膜分离纯化，收集纳滤截留液得到分离液。

(3)冷冻干燥：将步骤(2)中所得的分离液进行蒸发浓缩、冷冻干燥得到经过纯化的阿拉伯低聚半乳糖，命名为Oligo-AG2。

经检测，Oligo-AG2的重均分子量为4500Da。

下面是对Oligo-AG2结构鉴定或性能分析的实施例：

实施例4：分子量检测

具体试验流程：进样量为200μL-300μL(即2-3倍样品环体积)，数据收集60min，柱温为室温。配制0.1mol/L NaNO₃水溶液(含有质量百分浓度0.02％NaN₃)作为流动相，过0.22μm膜，超声脱气30min。称取3mg样品溶解于1mL 0.1mol/L NaNO₃水溶液(含有质量百分浓度0.02％NaN₃)中，磁力搅拌溶解4h，过0.22μm膜。样品采用实施例1中的阿拉伯低聚半乳糖，降解后多糖的绝对重均分子量结果见图1。

图1是本发明酶降解和膜法分离纯化低聚多糖分离效果的绝对重均分子量的结果图，由图1知，本发明酶降解和膜分离制备低聚多糖可以定向获得目标分子量，大大减少了分离纯化时间。且经光散射测定绝对重均分子质量(Mw)为4500Da的阿拉伯低聚半乳糖的活性显著增加。

实施例5：红外光谱分析

将AG2.0mg和实施例中Oligo-AG2 2.0mg分别与200mgKBr颗粒置于玛瑙研钵中并在红外光照射下研磨成粉末。将混合物均匀混合，并通过压片方法将适量的混合物制成透明片。对降解前后两种多糖构型进行初步分析。

AG与实施例中Oligo-AG2的红外光谱分析如下：

如附图2(a)、图2(b)所示，多糖AG和Oligo-AG2在4000-400cm^-1范围内都具有明显的多糖特征吸收峰，且峰型十分相似，这表明了本发明的酶法降解并没有改变多糖的骨架结构。两种多糖在近3400cm^-1处和近2930cm^-1处都各有一个宽的O-H伸缩振动特征峰和一个相对较弱的C-H伸缩振动峰。在1600cm^-1、1400cm^-1附近处存在的强吸收峰分别为糖分子的C-H变角、弯曲振动特征峰；在1200-1000cm^-1间存在吸收峰的为C＝O的伸缩振动吸收峰。多糖均在836-884cm^-1间有吸收峰，表明多糖主要含有α、β-糖苷键。实施例1-3中Oligo-AG2的红外光谱在4000-400cm^-1范围内的多糖特征吸收峰、峰形相同。

实施例6：核磁共振光谱分析

称取60mg冷冻干燥后的实施例中Oligo-AG2样品溶解于1mLD₂O中，离心、去除沉淀，真空冷冻干燥，将冷冻干燥后样品按“溶解于1mLD₂O中、离心、去除沉淀，真空冷冻干燥，”过程反复处理4次；最后再将反复冻干后的样品用1mL D₂O溶解放入5mm核磁管中，采用瑞士Bruker AVANCE 600核磁共振仪在600MHz进行核磁信号扫描，进而对核磁共振氢谱(¹H-NMR谱)、碳谱(¹³C-NMR谱)、TOCSY谱和HMBC谱等进行分析。

AG与实施例中Oligo-AG2的NMR分析如下：

各残基的化学位移见表1，分析推断所有残基的氢、碳化学位移，耦合常数与标准残基对照发现，D归属于Ara糖残基，A、B、C归属于Gal糖残基。一般通过各个糖残基异头氢的化学位移可以判断异头碳的构型，δ>5.00ppm为α-型，δ<5.00ppm为β-型，从核磁解析结果可以发现Ara异头氢的化学位移处于相对低场(δ>5.00)，为α-构型，Gal的异头氢的化学位移均处于相对高场(δ<5.00)，为β-构型。

表1 Oligo-AG2糖残基的化学位移归属(δ,ppm)

大约106.0的信号被分配给A(1,3,6-β-Galp)、B(1,3-β-Galp)和C(1,6-β-Galp)，残基A和C都含有C-6键，但残基B含有C-3键。因此，残基B是1,3-β-Galp，残基C是1,6-β-Galp，残基A是1,3,6-β-Galp。在112.09处的共振对应于末端D，对于残留物D(T-L-Araf)，C-1信号为112.09和Ara的C-5在77.73的匹配信号表明存在终端α-Araf。

Oligo-AG2的一维和二维核磁波谱如附图3(a-d)所示。实施例1、2或3中的Oligo-AG2是含有1,3,6-、1,3-和1,6-连接的半乳糖基骨架的中性AG，其摩尔比为1:6:1。通过研究发现Oligo-AG2具有一些新颖的结构特征，其结构是以1,3糖苷键连接的β-半乳糖残基为主链，1,3糖苷键连接的6位上被(1,6)-β-D-Galp或端基Araf取代连接，其结构表示如图4所示，具体为：以(1→3)连接的β-D-半乳糖(β-D-Galp)残基(即1,3糖苷键连接的β-D-半乳糖残基)为主链，在主链上相邻的两个β-D-半乳糖残基的6位上分别被支链一和端基α-阿拉伯糖(α-Araf)(优选α-L-阿拉伯糖(α-L-Araf))取代；支链一是(1→6)连接的β-D-半乳糖((1,6)-β-D-Galp)残基和端基β-D-半乳糖(β-D-Galp)；阿拉伯糖与半乳糖的摩尔比为1:16，与AG的支链取代度3:7相比，明显降低。

实施例7：原子力显微镜(AFM)形貌分析

(1)样品溶液的制备：分别称取1mg干燥后的AG与实施例中Oligo-AG2样品，溶解于1mL SDS(十二烷基硫酸钠、浓度0.1mg/mL)水溶液中，水浴搅拌溶解2h，加热促进样品溶解完全，冷却至室温，再用浓度0.1mg/mL SDS水溶液逐级稀释至样品浓度为50μg/mL，磁力搅拌溶解24h。

(2)AFM样品的制备：将5μL的2mmol·L^-1二氯化硅(NiCl₂)水溶液置于新剥离的云母片上。吸附处理10min，用超纯水冲洗，在空气中自然干燥；在云母片表面滴加5μL AG和5μL Oligo-AG2溶液，置于空气中10min，然后用注射器吸收大量超纯水，冲洗掉未吸附的残留物。干燥备用(所有试剂均需要过0.22μm滤膜)。

(3)AFM样品观察条件：在室温、空气湿度在50％-60％条件下进行样品观察，仪器型号为韩国Park公司XE-70型原子力显微镜。探针Si₃N₄具有200μm的微悬臂长度和0.2N/m的力弹性常数，并且在轻敲模式下获得图像。

AG和Oligo-AG2的AFM形貌分析如下：

图5(a)为AG的AFM图谱，图5(b)为Oligo-AG2的AFM图谱，样品浓度为50μg/mL。AFM图中观察到AG与Oligo-AG2在水溶液中大量形貌呈无规线团状的分子链平铺在云母片上，并带有许多支链，形成无规卷曲的构象，此外，一般单链多糖分子的直径约在0.1-1.0nm范围之间，本研究中测得原始AG呈现柔顺链状，分子直径为1.32nm。其单位围长摩尔质量ML＝782nm^-1，持续长度q＝5.43nm，d＝1.05nm。降解后的Oligo-AG2分子更小，分子直径变为0.78nm，但仍然呈现短小的柔顺链状。

实施例8：对AG与Oligo-AG2的生物活性评价

将实施例1得到的低聚多糖Oligo-AG2，采用体外模型测定降解前后的多糖对两种益生菌的促生长作用。

具体步骤如下：

菌种活化：在无菌无氧操作条件下，取动物双歧杆菌和酪酸梭菌冻干粉，用基础培养基溶解后并接种，(37±1)℃厌氧培养48h，然后按5％(重量百分比)的接种量继续传代培养。活化后，传代3次，取第3代菌液-80℃保存备用。

体外培养：在150mL三角瓶中接入50mL改良MRS培养基(青岛海博生物科技有限公司提供)，分别接入动物双歧杆菌第3代菌液和酪酸梭菌第3代菌液，加入质量分数为0.5％的多糖，静置培养48h，每隔4h从三角瓶中吸取0.1mL发酵液，采用平板计数法，测定培养基中活菌数，以葡萄糖基础培养基为对照，研究本发明阿拉伯低聚半乳糖对两种益生菌外生长曲线的影响。

由图6(a)、图6(b)可得，同一时间内，AG作为碳源的培养基中双歧杆菌活菌数对数值比对照组高11.20％，酪酸梭菌活菌数对数值比对照组高13.23％，而相对于AG，同一时间内，Oligo-AG2所在的培养基内双歧杆菌活菌数的对数值比AG高14.34％，酪酸梭菌活菌数的对数值比AG高13.28％。相对于AG，同一时间内，实施例2、3中低聚多糖Oligo-AG2所在的培养基内双歧杆菌活菌数的对数值比AG分别高14.32％、14.35％，酪酸梭菌活菌数的对数值比AG分别高13.20％、13.25％。与阿拉伯半乳聚糖相比，本发明酶降解和膜法分离纯化获得的重均分子量为4500Da的样品阿拉伯低聚半乳糖Oligo-AG2能够明显促进两种益生菌的体外生长，表明Oligo-AG2的生物活性相对于AG显著增强。Oligo-AG2可用作益生菌生长促进剂或用于制备益生菌生长促进剂，可作为功能性低聚多糖应用于食品添加剂、保健品及医药领域。

本发明制备方法中参数的变化并不影响阿拉伯低聚半乳糖的制备，因此本发明制备方法中任意参数的组合均可实现阿拉伯低聚半乳糖的制备。在此不再赘述。

Claims (5)

1.一种阿拉伯低聚半乳糖，其特征在于，由重量百分含量为99％以上的多糖组成，所述多糖由阿拉伯糖与半乳糖组成，其中阿拉伯糖与半乳糖的摩尔比为1:16；所述阿拉伯低聚半乳糖的重均分子量为4000Da-5000Da；

所述阿拉伯糖为α-L-阿拉伯糖，所述半乳糖为β-D-半乳糖；

所述多糖的结构单元以(1→3)连接的β-D-半乳糖残基为主链，在主链上相邻的两个β-D-半乳糖残基的6位上分别被支链一和端基α-阿拉伯糖取代；支链一是(1→6)连接的β-D-半乳糖残基和端基β-D-半乳糖。

2.根据权利要求1所述的阿拉伯低聚半乳糖的制备方法，包括步骤：

(1)降解：将0.05mol/L的柠檬酸缓冲液与β-1,3-半乳糖内切酶和阿拉伯半乳聚糖混合均匀，调节pH值并进行一次酶解，除去沉淀，得到上清液，继续在上清液中加入α-阿拉伯糖苷酶，调节pH值并进行二次酶解，除去沉淀，得到降解液；

所述一次酶解的pH值为4.5-7.0，酶解温度为35℃-55℃，酶解时间为30h-60h；

所述二次酶解的pH值为5.5-7.5，酶解温度为45℃-65℃，酶解时间为30h-60h；

所述β-1,3-半乳糖内切酶与阿拉伯半乳聚糖的用量关系为10U-45U：1g；

所述α-阿拉伯糖苷酶与阿拉伯半乳聚糖的用量关系为20U-65U：1g；

(2)膜分离纯化：将步骤(1)所得的降解液依次采用超滤膜和纳滤膜进行膜分离纯化，其中收集超滤膜透过液用纳滤膜分离纯化，收集纳滤膜截留液得到分离液；

所述超滤膜截留分子量为3000Da-10000Da；

所述纳滤膜截留分子量为200Da-1000Da；

(3)干燥：将步骤(2)中所得的分离液进行浓缩和干燥得到阿拉伯低聚半乳糖。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，采用超滤膜和纳滤膜进行膜分离纯化的参数为：压力差为0.1MPa-0.5Mpa，降解液温度为15℃-50℃，膜面积为1.5m²-5m²，降解液膜通量为0.1m²/h-2.5m²/h。

4.根据权利要求1所述的阿拉伯低聚半乳糖在作为抗氧化剂或者在作为益生菌生长促进剂中的应用。

5.根据权利要求1所述的阿拉伯低聚半乳糖在制备抗氧化剂或者在制备益生菌生长促进剂中的应用。

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