KR100370929B1

KR100370929B1 - 수용성 키토산의 제조 방법

Info

Publication number: KR100370929B1
Application number: KR10-2000-0015959A
Authority: KR
Inventors: 조훈형; 장길윤
Original assignee: 조훈형
Priority date: 2000-03-28
Filing date: 2000-03-28
Publication date: 2003-02-05
Also published as: KR20000036774A

Abstract

이 발명은 인체의 면역력 증강 효과가 있는 키토산을 수용화시키는 수용성 키토산의 제조 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 키토산의 분자량 조정에 의한 식품용 키토산(β-1,4-poly-glucosamine, 분자량 2만∼10만)의 제조 방법에 관한 것이며, 키토산의 용해 및 효소(Chitosanase)분해에 사용되는 탈이온수를 제조하는 제 1단계, 키토산을 희 유기산(초산, 젖산)에 녹이는 제 2단계, 상기 키토산 용액을 효소 분해하여 수용화 시키는 제 3단계, 상기 용액의 반응을 조절하는 제 4단계, 상기 용액을 음이온 교환수지를 이용한 잔존하는 염과 냄새 제거 및 산도(pH 6∼7)를 조정하는 제 5단계, 상기 용액을 건조하는 제 6단계로 이루어진 수용성 키토산의 제조 방법이 제공되고, 이 발명에 따른 방법은 반응공정이 간단하며, 염과 냄새(유기산)가 존재하지 않는 순수한 수용성 키토산만을 제조 할 수 있다.

Description

수용성 키토산의 제조 방법{Preparing Methode for Aqueous Chitosan}

본 발명은 인체의 면역력 증강효과가 있는 키토산을 수용화 시키는 수용성 키토산의 제조 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 키토산의 분자량 조정에 의한 식품용 키토산(β-1,4-poly-glucosamime, 분자량 2만∼10만)의 제조 방법에 관한 것이다.

이러한 종래의 키토산 제조 방법을 3가지로 크게 대별하면 다음과 같다.

1) 화학적 방법에 의한 수용성 키토산(올리고당)의 제조(종래의 방법)

키토산은 그 분자 구조를 볼 때 인체 조직과 거의 같고 친화성이 우수하여 면역반응(거부반응)이 일어나지 않기 때문에 식품 및 의약품으로써 우수한 물질이다. 그러나 이러한 고분자 키토산은 물에 녹지 않으며, 유기산(초산, 젖산 등) 및 무기산(HCl)에 녹으므로 이용범위가 넓지 않았다.

키토산을 수용성으로 만들려면 산도(pH) 7 부근에서 녹게 해야 하나 기존의 방법 중 염산(HCl) 가수분해에 의한 수용성 키토산(올리고당)의 제조 방법은 키토산에 대해 다량의 염산(HCl)을 사용하며, 장시간을 요구한다. 그 순서는 아래와 같다.

염산 가수분해 →여과 →농축 →에탄올 분획 →이온교환 크로마토그라피 →분획 →건조

일례로, 키토산 25g에 250ml의 농염산을 가하고 80℃에서 2시간 가수분해 한다. 이 분해액의 불용물을 원심분리로 제거하고, 상등액에 활성탄을 가하여 탈색 후 감압농축 건조한다. 이 분해물에 에탄올 200ml를 가하고 실온에서 2시간 교반후, 흡입여과로 불용물을 제거, 여액을 감압농축 건조한다.

여기서 에탄올의 용해분리에 의해 14.5g의 키토산 분해물이 생성된다.

이 부분 분해물 3.0g을 물에 용해하고 200ml의 이온교환수지 칼럼(Dowex × 50w OH^-form)에 흡착 시키고, 염산 농도를 순차로 1.15N(150ml), 1.81N(300ml), 2.54N(400ml)로 단계적으로 상승시켜 용출 한다. 수용성 키토산(올리고당) 검출은 닌하이드린 발색으로 510nm의 흡광도를 측정하여 행하고 일련의 수용성 키토산(올리고당)을 분획한다. 이 결과

D-글루코사민염산염(GlcN·HCl) 0.25g(8.3% 키토올리고당 혼합물 3g 으로 부터의 수율),

키토비오스염산염(GlcN₂·HCl) 0.82(27.3%),

키토트리오스염산염(GlcN₃·HCl) 0.62(20.7%),

키토테트라오스염산염(GlcN₄·HCl) 0.14(4.7%),

키토펜타오스염산염(GlcN₅·HCl) 0.10(3.3%),

키토헥사오스염산염(GlcN₆·HCl) 0.05(1.7%)를 얻는 방법으로서, 그 공정도 복잡할 뿐만 아니라 400∼2,000의 저분자(MW) 수용성 키토산을 생산 할 수밖에 없는 단점이 있다.

2) 효소적 방법에 의한 수용성 키토산(올리고당)의 제조(종래의 방법)

지금까지 통상적인 수용성 키토산의 제조 및 정제 방법은 다음과 같다.

① 키토산을 묽은 산에 용해 시키는 단계;

② 효소처리에 의한 24시간 정도의 가수분해 단계;

③ 동결건조 및 포장 단계; ⇒ 종래에는 저분자 수용성 키토산(올리고당)을 정제하지 않고 산성의 반응물을 건조 시켰다.

그러나, 상기 방법은 키토산 용해시에 투입한 산(염산, 초산, 젖산 등)이 제거되지 않은 상태로 제품중에 존재하고 있어서, 섭취 시 인체에 악영향을 미칠 수 있다.

또한 24시간 정도의 효소분해에 의해 생성된 물질은 대부분이 올리고당화 되어 있으므로 수용성 키토산이라기 보다는 키토산 올리고당(MW 400∼2,000)이라고 해야 할 것이다. 이 올리고당은 고분자량의 키토산에 비해 인체 면역력 증강 효과등이 떨어지는 것으로 알려져 있다.

3) 염을 도입한 키토산의 수용성화 방법

또한, 수용성 키토산의 다른 제법으로는 키토산에 염을 붙여서 키토산의 분자량 저하 없이 고분자이면서 수용성의 상태가 되도록 하는 방법이 있다.

그러나 이 또한 물에 용해되었을 경우 나타내는 산도(pH)가 3(1% 용액 기준)정도로써 매우 강산이며, 산도(pH) 2.0 이하의 염산 용액(위산의 산도(pH)는 1.0∼1.5)에서는 잘 녹지 않는다. 이러한 이유, 즉 생체 내 용해성이 열등하기 때문에 건강보조식품으로써의 고유한 기능에 문제가 있다.

일반적으로 키토산은 글루코사민(glucosamine)의 피라노스(pyranose)단위체가 β-1,4 결합된 것으로서, 글루코사민(glucosamine) 잔기가 5,000개 이상 결합된 분자량이 100만 이상인 천연 고분자이다. 화학명이 poly-β-1,4-glucosamine인 키토산은 서로 이웃하는 분자와의 수소 결합에 의해 견고하게 결합된 강고한 구조를 갖고 있어서 물에 녹지 않는 불용성 물질로서 키토산은 묽은 유기산(초산, 젖산 등) 및 묽은 무기산(염산 등)에 녹는 성질이 있어서 최초에는 식초에 녹인 제품을 건강식품에 이용하게 되었다. 그러나 기존 화학적 처리에 의한 수용성 키토산을 제조할 경우 농염산 상태에서 가수분해 시 분자량(MW)이 극히 감소되어 저분자 수용성 키토산(올리고당) 밖에 제조 할 수밖에 없었다.

본 발명자는 효율적인 키토산의 제조방법을 개발키 위하여 다대한 노력을 기울인 결과, 키토산이 분자량의 크기에 따라 용해되는 pH가 다르다는 점에 착안하여 중성의 물 즉, pH 7의 물에 용해될 수 있는 분자량 2만∼10만의 수용성 키토산을 제조하게 되었고, 이온교환수지(Dowex 4급 아민 형 OH^--form)를 이용하여 과잉의 염을 제거한 수용성 키토산을 수득하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 수용성이면서 고분자이며 유기산 냄새 및 염이 정제된 수용성 키토산의 제조 방법을 제공하는 것이다.

이때, 음이온 교환수지를 사용하여 이들 산을 제거하였다. 예를 들어, 초산(CH₃COOH)의 경우 반응용액 중에 CH₃COO^-와 H⁺로 해리 되어 있다. 음이온 교환수지는 R-OH 의 형태로 이온교환 탑에 충진되어 있는데, 여기에 효소 반응액을 통과시키면 CH₃COO^-기가 음이온 교환수지에 결합하고 음이온 교환수지에 있던 OH^-기가 교환되어 배출되게 된다. 이렇게 하여, 산이 제거된다.

이외에, 수용성 키토산 제품의 순도 향상(또는 정제)의 방법으로써 다음과 같은 것을 시행한다.

① 키토산(원료) 규격을 엄격하게 규정하여 사용한다.

② 제조 공정에 사용되는 물은 모두 활성탄을 이용한 여과(Carbon filtering) 및 탈이온화 하여, 용수(用水)에 의한 이물질의 혼입을 방지한다.

③ 키토산의 용해에 사용되는 산(酸)은 모두 약전용만을 사용한다.

마지막 단계에서는 상기 용액을 건조한다. 건조는 동결건조(F/D) 방식을 채택하여 수용성 키토산의 분자량 저하를 최대한 억제한다.

상기와 같은 제조방법에 의한 제조에 의해 수율 99%이상, 분자량 2∼10만인수용성 키토산을 얻을 수 있다.

1) 수용성 키토산의 품질관리키토산은 보통 분자량이 100만 이상(잔기수 5,000 이상) 으로써, 이 키토산을 분자량(MW)이 20,000∼100,000인 수용성 키토산으로 분해 제조 하기 위하여 키토산을 유기산(초산, 젖산 등) 및 무기산(염산 등)에 가수분해 후, 40∼50℃ 사이에서 효소(Chitosnase)를 넣고 키토산 분해 과정을 시간별로 체크하여 분자량을 조절하는 방법으로서는 pH에 의한 검사법에 의해 행한다. pH검사법이란, 키토산은 분자량이 낮을수록 높은 pH에서도 석출되지 않고 분자량이 높을수록 낮은 pH에서도 석출 된다는 원리를 이용하여 키토산의 분해 반응을 조절(control)하는 방법으로서 키토산 용액의 pH 6∼7.5에서 반응을 조절하여 고분자 수용성 키토산을 제조한다.

2) 수용성 키토산의 정제

수용성 키토산을 정제하는 과정에서 제일 중요하게 여기는 것으로써 키토산을 산(무기산, 유기산)에 가수분해하여 염의 형태로 만든 다음, 이때 투입되는 "산"의 양이 과량 사용되므로(키토산의 적정 용해도 pH 6.5 정도) 키토산의 순수한 염의 형태(R-NH₃+ Cl^-, CH₃COO^-, CH₃CH(OH)COO^-)와 잔존염(Cl^-, CH₃COO^-, CH₃CH(OH)COO^-)이 존재하는 상태이므로 효소(Chitosanase) 분해반응(적정온도, 시간, 농도) 후에도 잔존염이 존재하게 되고, 또한 유기산(CH₃COOH)으로 반응했을 경우 반응 후 냄새(유기산 냄새)가 나타난다. 이 문제를 해결하기 위하여 수용성 키토산 용액중에 잔존된 염(Cl^-, CH₃COO^-, CH₃CH(OH)COO^-)과 유기산 냄새를 음이온교환수지(Dowex 4급 아민 형 OH^-form)를 이용하여 진공상태에서 정제하였다.

만약, 진공 상태가 아닌 상압 조건하에서 정제할 경우 수용성 키토산 용액의 pH가 12이상(분자량에 따른 문제점)으로 올라가 제품의 고형화 및 알칼리화 되는 문제점이 발생되므로 이온교환수지 탑의 설계과정이 중요하다.

도 1은 본 발명의 제조 방법에 대한 플로우 차트도이다.

도 2a, 2b, 2c는 본 발명에 따라 제조된 키토산과 기존의 키토산에 대한 적외선 스펙트럼(Infrared Spectrum)그래프들이다.

본 발명은 다음과 같은 단계로 이루어진 수용성 키토산의 제조 방법이다.

키토산 용해시 사용되는 탈이온수를 제조하는 선택적 단계로서의 제 1단계;

키토산 중량의 10 내지 100배량의 물에 키토산 중량의 0.3배량의 유기산(식초, 젖산)을 넣고(초산용액, 젖산용액) 키토산을 용해하는 제 2단계;

상기 키토산 용액을 40℃∼50℃에서 교반을 하며 효소(Chitosnase)를 투입하여 키토산을 가수분해시키는 제 3단계;

상기 용액이 pH 6∼7.5에서도 백탁(백색 혼탁 및 침전)되지 않을 때 반응을 정지시키는 제 4단계;

상기 용액을 음이온 교환수지를 사용하여 염을 제거하는 제 5단계;

상기 용액을 동결건조하는 선택적 단계로서의 제 6단계로 이루어져 있다.

이하, 본 발명을 첨부도면(도 2 a, b, c)을 참조하여 더욱 상세히 설명하기로 한다.

상기 제 1단계에서, 일반적인 순수를 카본 필터를 사용하여 부유물질(SS) 제거 및 연수화 시킨 다음 혼합형 이온교환수지를 통해 탈이온 하고 다시 카본필터를 사용하여 정제수를 만들었다.

상기 제 2단계에서, 고도로 정제된 식품용 키토산을 일정량 취하여 키토산 중량의 10 내지 100배량의 물에 키토산 중량의 약 0.3배량의 유기산(초산, 젖산)을 혼합하고 교반하여 키토산을 완전히 용해시킨다. 이때 가해주는 초산의 양은 키토산이 완전히 용해 될 수만 있다면, 본 발명에 있어서 제한적이지 않다.

상기 제 3단계에서, 상기 용액을 40℃∼50℃로 고정한 후 효소를 투입한다. 효소(Chitosanase)의 투입량은 키토산의 그램 중량당 0.5∼1.5유니트(unit)를 넣어 주어 반응이 서서히 진행 되도록 하여 분자량의 조절이 용이하도록 한다.

상기 제 4단계에서, 상기의 반응용액은 pH가 5∼5.5이며, 미황색의 투명한 용액이다. 효소에 의한 가수분해 시간의 경과에 따라 반응용액을 소량씩 채취하여 2배의 물로 희석하고 교반하면서 1N-수산화나트륨(NaOH)을 조금씩 가해준다. 이때, 반응용액의 pH가 6∼7.5가 되어도 백탁되지 않으면 반응액의 온도를 85℃로 올려서 30분간 가열하여 효소(Chitosanase)반응을 종료시킨다.

상기 제 5단계에서, 상기 반응액을 음이온 교환수지를 이용하여 염을 제거한다. 이때 사용되는 이온교환수지는 Dowex사 제품(4급 아민 형 0H^-form) 이다.

키토산은 물에 녹지 않는 불용성 물질로 약산에 녹는 성질이 있다. 수용성 키토산 생산을 위한 효소 반응을 하기 위해 키토산을 약산(초산, 염산)에 녹이게 되는데, 효소반응 정지 후, 반응액 중에 함유된 산(酸)을 제거하여 제품을 정제하는 것이 좋다.

상기 제 6단계에서는 수용성 키토산 용액을 직접 제품화하거나 동결 건조기를 사용하여 수분을 증발시켜 분말화된 수용성 키토산을 수득한다.

[실시예 1]

① 키토산(도 2 a 참조)

② 수용성 키토산(도 2 b 참조)

③ 음이온 교환수지로 처리한 수용성 키토산(도 2 c 참조)

위의 3가지 샘플을 적외선 피크를 이용하여 염이 제거된 그래프를 수록하였다.

샘플 1(키토산)

키토산을 1.5%초산 용액에 완전히 용해한 후에 이 용액을 유리판에 캐스팅하여 건조기 안에서 건조 한 후, 1N-NaOH/MeOH(1:1)용액 중에서 충분히 침적하여 초산을 제거하였다. 그 후, MeOH용액 중에서 세척하여 건조 한 후 적외선 스펙트럼을 측정하였다(도 2a 참조).

샘플 2(초산 함유 수용성 키토산 KBr 적외선 스펙트럼)

수용성 키토산 용액을 제조한 후(pH5∼5.5) 건조하여 KBr법에 의하여 적외선 스펙트럼을 측정하였다. 이 중에는 수용성 키토산 및 초산이 함유되어 있다. 이중의 키토산의 아미노기와 초산의 carboxyl기가 정전기적으로 결합되어 있는 상태이므로 적외선을 사용한 카르복실기의 존재여부 판단이 불가능하다. 그래서, 0.1N-HCl을 사용하여 pKa(4.8)이하로 조정하여(pH2) 건조한 후에 이것을 적외선 스펙트럼으로 측정한 데이터를 아래에 첨부하였다. 이 적외선 스펙트럼의 1710cm^-1부근에서 카르복실기 유래의 흡수가 존재하므로 이 피크로부터 이 물질 내에는 CH₃COOH기가 존재함을 확인할 수 있었다(도 2b 참조).

샘플 3(수용성 키토산 KBr 적외선 스펙트럼(초산 제거 후))

샘플 2에서와 동일한 방법으로 수용성 키토산 시료를 조제하여 적외선을 측 정하였다. 이온교환수지에 의하여 카르복실기(초산)가 제거됨에 따라 1710cm^-1부근에서 나타나는 카르복실기의 흡수가 나타나지 않음을 알 수 있다. 이것으로부터 처음 용해 시에 첨가한 초산이 이온교환수지에 의하여 제거되었다는 것을 알 수 있다(도 2c 참조).

상기와 같이 본 발명에 따른 수용성 키토산의 제조방법은 반응공정이 간단하면서도 염과 냄새(유기산)이 존재하지 않는 순수한 수용성 키토산을 얻을 수 있도록 되어 있다.

Claims

정제수와 유기산의 혼합 용액에 키토산을 용해시키는 단계;

상기 용액에 키토사나제를 첨가하여 반응시키는 효소 분해 반응 단계;

상기 반응 용액의 pH와 온도를 조절하여 효소 반응을 종결하는 단계; 및

상기 반응 용액을 동결 건조시켜서 분말화하여서 수용성 키토산을 제조하는 방법에 있어서,

상기 키토사나제는 분자량의 조절을 용이하게 하기 위해 키토산의 그램 중량당 0.5 내지 1.5유니트를 첨가하고,

키토산의 분자량 조절 방법으로써 상기 효소 반응 중인 용액을 소취하여 pH를 6 ~ 7.5로 하여도 백탁되지 않을 때 85℃에서 30분간 가열하여 효소 반응을 종결시키며,

상기 효소 반응이 종결된 반응 용액은 동결 건조 전에 반응액 중에 함유된 산과 염을 제거하기 위하여 추가로 음이온 교환 수지를 이용하여 정제하는 것을 특징으로 하는 수용성 키토산의 제조 방법.
삭제
제 1항에 있어서, 상기한 정제 단계에서 사용되는 음이온 교환수지로는 4급 아민형 OH^-폼을 이용하는 수용성 키토산의 제조 방법.