KR100441270B1 - 수용성 유리 아민 키토산의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 순수한 수용성 유리 아민의 키토산을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 1) 키토산 올리고당의 유기산 또는 무기산 염의 용액을 염기인 트리알킬 아민으로 처리하고, 2) 상기 용액에 유기용매를 첨가하여 키토산 올리고당에 결합되어 있는 유기산 또는 무기산이 트리알킬 아민 염의 형태로 제거된 키토산 올리고당을 회수하고, 3) 상기에서 산이 제거된 키토산 올리고당 용액을 무기산 처리 후, 활성화된 탄소/이온교환수지(activated carbon/ion exchange resin) 컬럼으로 정제하여 1,000 ∼ 100,000 달톤의 분자량을 가진 순수한 수용성 유리 아민 키토산을 제조하는 것이다.

Description

수용성 유리 아민 키토산의 제조방법 {The Method for Preparation of Water Soluble Free Amine Chitosan}
본 발명은 순수한 수용성 유리 아민의 키토산을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 1) 키토산 올리고당의 유기산 또는 무기산 염의 용액을 염기인 트리알킬 아민으로 처리하고, 2) 상기 용액에 유기용매를 첨가하여 키토산 올리고당에 결합되어 있는 유기산 또는 무기산이 트리알킬 아민 염의 형태로 제거된 키토산 올리고당을 회수하고, 3) 상기에서 산이 제거된 키토산 올리고당 용액을 무기산 처리 후, 활성화된 탄소/이온교환수지(activated carbon/ion exchange resin) 컬럼으로 정제하여 1,000 ∼100,000 달톤의 분자량을 가진 순수한 수용성 유리 아민 키토산을 제조하는 것이다.
키토산은 글루코오스아민(glucosamine)의 피라노스(pyranose)단위체가 ??-1,4 결합된 것으로서, 글루코오스아민 잔기가 5,000 개 이상 결합된 분자량이 100 만 이상인 천연고분자이다. 이러한 키토산은 게 껍질이나 새우와 같은 갑각류 및 오징어를 포함하는 수산계로부터 추출할 수 있으며, 그 분자 구조로 볼 때 다당류의 일종인 셀룰로오즈와 유사한 구조로서, 생체 친화성이 우수하여 면역 반응시 거부 반응이 일어나지 않기 때문에 의약 산업에 응용되고 있고, 최근 미국의 FDA에서 식품으로서 인증을 받은 후, 키토산은 21세기의 중요한 생물산업 및 생체의료용 물질로 응용되고 있다.
상기한 키토산의 주요 용도의 일례로는 응집제, 중금속 흡착제, 염료폐수 정화제 등의 폐수처리 분야와 토양개량제, 살충제, 식물 항바이러스제, 농약 등의 농업 분야에서 널리 이용되어 왔으며, 최근에는 식품과 음료 응용분야, 보건위생 응용분야, 화장품 응용분야, 섬유관련 응용분야 및 의약품 응용분야로 더욱 확대되고 있다.
특히, 20,000 ∼ 100,000 이내의 특정 분자량의 범위를 가진 키토산은 강한 생리활성 기능을 띠고 있는 것으로 알려져 있기 때문에 건강 식품분야, 식ㆍ음료 분야, 화장품 분야, 보건위생 분야 및 의약품 분야에 대한 응용성을 기대할 수 있다. 따라서, 상기의 목적을 수행하기 위해서는 중성의 물에 쉽게 용해되어 점도를 상승시키지 않는 수용성 키토산의 개발이 요구되고 있다.
상기 수용성 키토산이 건강식품 분야에 응용된 경우 콜레스테롤 저하, 면역 기능 강화, 간 기능 강화, 혈당 조절 작용 및 혈압 상승억제의 생리활성을 보이며, 소화 기관내 흡수력을 증대시키는 역할을 한다. 또한, 피부노폐물 제거, 탁월한 보온, 보습 효과, 항균성, 피부세포의 활성화되는 기능이 밝혀지면서 샴푸, 린스, 헤어 스프레이, 헤어젤, 크림, 입욕제, 팩 및 세안제를 포함하는 화장품의 원료로응용되고 있다. 따라서 피부 내부로의 침투를 용이하게 하고 분무용 화장품의 경우 점도를 상승시키지 않는 수용성 키토산이 절실히 요구되고 있다.
이외에도, 수용성 키토산은 생리활성을 가지고 물에 대한 용해가 필수적인 의약품 분야의 약물전달체에 응용될 수 있다. 그의 일례로는 골다공증 및 류마티스 치료제 및 체내 중금속 제거제 등의 주사제로 사용되는 것이다.
그러나 키토산은 서로 이웃하는 분자간의 강한 수소결합으로 견고하게 결합된 불용성 물질로서, 상기 키토산을 녹이기 위하여 젖산, 초산, 프로피온산, 포름산, 아스코르브산, 및 주석산을 포함하는 유기산 및 염산, 질산 및 황산으로 구성되는 무기산이 사용되므로 생체에 응용하는 데 제한을 주고 있다.
종래의 수용성 키토산을 제조하기 위한 방법은 화학적 방법으로 염산(HCl) 가수분해를 이용하여 산도(pH) 7.0 부근에서 녹게 하는 방법이 있으나 키토산에 대해 다량의 염산을 사용하며, 분해시키기 위해 장시간이 요구된다는 단점이 있다.
통상적으로 사용되는 다른 방법으로는 키토산 구조의 C-2 위치에 있는 아민을 다른 화합물로 치환하거나 아민염(-NH3 +ㆍCH3CHOHCOO-, -NH3 +ㆍCH3COO-, -NH3 +ㆍCl-, -NH3 +ㆍCH3CH2COO-, -NH3 +ㆍHCOO-, -NH3 +ㆍHOOC(CHOH2)COO-, -NH3 +ㆍCO(COH)3CHOHCH2O-)의 형태로 제조하여 분자량 저하없이 수용성의 상태가 되도록 한다. 그러나 상기에서 얻어진 염의 형태는 양이온 전하를 띤 아민 그룹의 특성을 제대로 이용하지 못한다는 문제점과 물에 용해되었을 경우 pH가 3.0 (1.0 % 용액 기준)정도로써, pH가 1.2 ∼ 1.5인 위산의 조건에서는 잘 녹지 않아 생물산업 및 생체의료용 물질로의 이용율이 낮다.
또 다른 방법으로는 효소적 방법을 이용한 것으로서, 그 제조 및 정제 방법으로는 1) 키토산을 묽은 산에 용해시키는 단계; 2) 효소처리에 의한 24 시간 정도의 가수분해 단계; 및 3) 동결건조 및 포장하는 단계로 구성된다. 상기 방법은 수용성 키토산을 별도의 정제 공정없이 산성의 반응물을 그대로 건조시키므로 키토산 용해시에 투입된 산이 제거되지 않은 상태로 제품중에 존재하고 있어서, 섭취 시 인체에 악영향을 미칠 수 있다.
따라서 상기 방법에서 분리되지 않은 불순물이나 산의 염을 효과적으로 제거하여 수용성 키토산을 제조하기 위한 방법이 요구된다. 상기 노력으로는 대한민국 특허 제2000-0015959호에서 효소분해하여 수용화한 키토산 올리고당을 음이온 교환수지를 이용하여 잔존하는 염과 냄새를 제거하는 방법이 공시되어 있으나 순수한 수용성 키토산으로서의 특성이 확실히 밝혀져 있지 않으며, 그 외 이와 관련된 기술은 거의 없는 것으로 알려져 있다.
본 발명자들은 생체 의료용 고분자로 응용하기 위하여 생리활성을 가지며 중성의 물에 용해되는 수용성 키토산에 관하여 연구를 계속하던 중, 효소분해 후 얻어진 1) 키토산 올리고당의 유기산 또는 무기산 염의 용액을 염기인 트리알킬 아민으로 처리하고, 2) 상기 용액에 유기용매를 첨가하여 키토산 올리고당에 결합되어 있는 유기산 또는 무기산이 트리알킬 아민 염의 형태로 제거된 키토산 올리고당을회수하고, 3) 상기에서 산이 제거된 키토산 올리고당 용액을 무기산 처리 후, 활성화된 탄소/이온교환수지(activated carbon/ion exchange resin) 컬럼으로 정제하여 1,000 ∼100,000 달톤의 분자량을 가진 순수한 수용성 유리 아민 키토산을 제조하는 방법을 개발하였고, 정성 및 정량적인 방법으로 순수한 수용성 유리 아민 키토산을 얻었음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 순수한 수용성 유리 아민 키토산을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 순수한 수용성 유리 아민의 키토산 제조방법에 대한 흐름도이며,
도 2a는 유기산 또는 무기산 염을 포함하는 키토산 올리고당의 FT-IR 스펙트럼이며,
도 2b는 본 발명의 유기산 또는 무기산이 제거된 수용성 유리 아민 키토산의 FT-IR 스펙트럼이고
도 3a는 유기산 또는 무기산 염을 포함하는 키토산 올리고당의1H-NMR 스펙럼의 결과이고,
도 3b는 본 발명의 유기산 또는 무기산이 제거된 수용성 유리 아민 키토산의1H-NMR 스펙트럼의 결과이고,
도 4a는 유기산 또는 무기산 염을 포함하는 키토산 올리고당의13C-NMR 스펙트럼의 결과이고,
도 4b는 본 발명의 유기산 또는 무기산이 제거된 수용성 유리 아민 키토산의13C-NMR 스펙트럼의 결과이고,
도 5는 본 발명의 유기산 또는 무기산이 제거된 수용성 유리 아민 키토산의 질량분석 결과를 나타낸 그래프이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 순수한 수용성 유리 아민 키토산을 제조하는 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, 1) 키토산 올리고당의 유기산 또는 무기산 염의 용액을 염기인 트리알킬 아민으로 처리하고, 2) 상기 용액에 유기용매를 첨가하여 키토산 올리고당에 결합되어 있는 유기산 또는 무기산이 트리알킬 아민 염의 형태로 제거된 키토산 올리고당을 회수하고, 3) 상기에서 산이 제거된 키토산 올리고당 용액을 무기산 처리 후, 활성화된 탄소/이온교환수지(activated carbon/ion exchange resin) 컬럼으로 정제하여 1,000 ∼ 100,000 달톤의 분자량을 가진 순수한 수용성 유리 아민 키토산을 제조하는 것이다.
또한, 본 발명의 제조방법은 1,000 ∼ 100,000 달톤의 분자량을 가짐으로써, 생리활성을 유지하는 수용성 유리 아민 키토산을 제조하는 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 키틴으로부터 추출한 불용성 키토산을 젖산, 초산, 프로피온산, 포름산, 아스코르브산, 및 주석산을 포함하는 유기산과 염산, 질산 및 황산을 포함하는 무기산을 이용하여 염의 형태로 만들어 용해시킨다. 상기의 키토산 용액을 효소분해하여 키토산 올리고당을 얻는다.
상기 키토산 올리고당의 산 용액은 젖산, 초산, 프로피온산, 포름산, 아스코르브산, 및 주석산을 포함하는 유기산 염과 염산, 질산 및 황산을 포함하는 무기산 염의 용액을 제조하기 위하여 사용된 용매는 PBS(Phosphate buffered saline) 7.0, 7.2 및 7.4 군에서 선택되어 용해시킨다.
상기 키토산 올리고당에 포함되어 있는 유기산 또는 무기산 염의 형태를 효과적으로 제거하기 위하여, 트리알킬 아민을 키토산 올리고당의 아민기 1 당량에 대해 2 ∼ 3 당량의 비율로 첨가하며, 바람직하게는 2 당량을 첨가하는 것이다.
상기에서 첨가되는 트리알킬 아민의 정량비는 키토산 올리고당의 한 단위체에서 C-2 위치의 아민기에 있는 유기산 또는 무기산이 트리알킬 아민 염의 형태로 제거되고, C-6 위치의 -CH2OH기를 보호하는 역할을 위해 필요하다. 보다 상세히 설명하면, 상기 불용성 키토산을 유기산 또는 무기산에 녹이는 과정에서 C-2 위치가젖산 염의 경우 -NH3 +ㆍCH3CHOHCOO-, 초산 염의 경우 -NH3 +ㆍCH3COO-, 프로피온산 염의 경우 -NH3 +ㆍCH3CH2COO-, 포름산의 경우 -NH3 +ㆍHCOO-, 아스코르브산의 경우 -NH3 +ㆍCO(COH)3CHOHCH2O-및 주석산 염의 경우 -NH3 +ㆍHOOC(CHOH2)COO-, 그리고 무기산인 염산 염의 경우 -NH3 +ㆍCl-, 황산 염의 경우 -NH3 +ㆍHSO4 -, 및 질산 염의 경우 -NH3 +ㆍNO3 -형태가 된다. 이때, 트리알킬 아민이 첨가되면, 강한 산성을 띠고 있는 키토산 올리고당의 아민기에서 H+를 트리알킬 아민이 끌어당기고, CH3CHOHCOO-또는 CH3COO-, Cl-와 트리알킬 아민 간의 정전기적인 상호작용에 의해 결합하여 제거됨으로써 C-2 위치는 유리 아민 형태를 얻을 수 있다.
상기 트리알킬 아민, 바람직하게는 트리-C1∼4알킬 아민이며, 구체적으로는 트리메틸 아민, 트리에틸 아민, 트리프로필 아민, 트리이소프로필에틸 아민 및 트리부틸 아민으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하고, 보다 바람직하게는 트리에틸 아민을 사용하는 것이다.
상기의 반응물은 상온에서 2 시간 정도 반응시킨 후 아세톤, 메탄올, 클로로포름, 디클로로메탄 군에서 선택된 유기용매를 첨가하여 교반하고 원심분리하였다.
상기 과정을 거친후, 트리알킬 아민에 의해 보호받은 C-6 위치의 -CH2OH기는 0.0005 ∼ 0.010 N 무기산 처리하여 제거되고, 상기 무기산은 염산, 질산 또는 황산으로 구성하는 무기산에서 선택되어 사용될 수 있다. 바람직하게는 0.001 N의 염산을 사용하는 것이고, 이때 (C2H5)3NH+ㆍCl-염의 형태로 제거된다.
또한, 본 발명은 유기산 또는 무기산이 제거된 키토산 올리고당의 용액을 활성화된 탄소/이온 교환수지 칼럼으로 정제하여 순수한 수용성 유리 아민 키토산을 제조한다.
상기 수용성 유리 아민 키토산은 분광학적인 방법을 통하여 그의 특성이 관찰된 바, FT-IR 스펙트럼에서는 젖산 염, 초산 염, 프로피온산 염, 포름산 염, 아스코르브산 염, 또는 주석산 염에서 유래된 카르복실기의 강한 피크인 1730 cm-1가 사라지고, 불순물로 인한 피크가 현저히 줄어들고, 상기 수용성 유리 아민 키토산의 특성 피크인 아마이드 I (-C=O)의 피크 및 아민 (-NH2)에 의한 피크가 확인되었다.
1H-NMR 스펙트럼을 통하여, 젖산 염, 초산 염, 프로피온산 염, 포름산 염, 아스코르브산 염, 또는 주석산 염에서 유래한 1.0 ∼ 1.3 ppm 부근의 피크는 사라지고, 불순물에 의한 피크도 역시 줄어 들었으며, 아세트아마이드(acetamide)의 아세틸기의 수소가 정량적으로 확인되었다.
또한,13C-NMR 스펙트럼의 결과에서 젖산 염, 초산 염, 프로피온산 염, 포름산 염, 아스코르브산 염, 또는 주석산 염에서 기인한 카르복실기의 강한 피크가 사라지고, 아세트아마이드기의 아미드(amide)와 각각의 탄소가 정량적으로 확인되었다.
상기한 분광학적인 실험 결과로부터, 본 발명의 제조방법을 이용하여 얻어진 수용성 유리 아민 키토산은 유기산 또는 무기산 염의 키토산 올리고당에서 산이 제거되었고, 질량분석을 통하여 이웃하는 두 피크 간의 차이가 키토산 글루코오스아민 단위체의 분자량과 일치하는 결과를 보임으로써, 1,000 ∼ 100,000 달톤의 분자량을 가진 순수한 수용성 유리 아민의 키토산이 제조되었음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 제조방법을 이용하여 얻어진 순수한 수용성 유리 아민의 키토산은 기존 발명에서 염의 형태 또는 다른 화합물로 개질하여 제조된 것과는 달리, 키토산 자체 유리 아민의 강한 양전하를 가짐으로써 물에 대한 용해도를 향상시킬 수 있을 뿐 아니라 생리활성을 띤 분자량 범위를 포함하는 수용성 유리 아민 키토산으로써, 상기 제조된 수용성 유리 아민이 음전하를 띤 유전자 및 DNA와 효과적으로 복합체를 형성하여, 유전적인 결함으로 생긴 질병이나 난치병으로 알려진 질병을 치료할 수 있는 유전자 전달체로 이용 가능하고, 차세대의 생물산업 및 생체의료용 물질로 가치가 높다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 수용성 유리 아민 키토산 제조
젖산을 용매로 하여 각각 5 % 키토산 용액을 제조한다. 상기 100 ml의 5 % 키토산 용액(pH 5.0 ∼ 5.5)에 5 유니트의 바실러스 푸밀러스(Bacilllus pumilus) BN-262에서 유래된 키토사네이즈(chitosanase) 효소를 혼합하여 40 ℃에서 36 시간동안 반응시켰다. 반응종료 후, 1㎛ prefilter를 사용하여 예비 여과한 후, 분자량 20,000인 중공사 여과지(hollow filter)로 재여과하였다. 상기 단계에서 얻은 여과액은 나노 여과 시스템(nano filter system)을 이용하여 농축되고, 살균과정을 거쳐 공기 분무 건조기(spray dryer)로 건조됨으로써 키토산 올리고당이 제조되었다.
상기에서 얻어진 키토산 올리고당을 1 ℓ의 PBS 7.0에 용해한 후 0.52 ℓ의 트리에틸 아민을 천천히 떨어뜨렸다. 이때, 키토산 올리고당의 아민기 1 당량에 대해 트리에틸 아민 2 당량으로 반응시킨다. 상기의 반응물은 상온에서 2 시간 정도 반응시킨 후, 아세톤을 첨가하여 교반하고 원심분리하였다. 상기 과정을 2 ∼ 3 회 반복한 후 공기 건조 및 동결 건조하였다. 이때, 원심분리는 Supra 30 K를 이용하여 15,000 rpm으로 4 ℃에서 20 분동안 실시하였다.
상기 과정에서 얻어진 생성물에 30 ∼ 50 ml의 0.001 N HCl을 첨가한 후 2시간 정도 반응시키고, 상기 반응물에 아세톤을 첨가하여 교반하고 상기 동일한 조건으로 원심분리하였다. 이 과정을 2 ∼ 3 회 반복 후 공기 건조 및 동결 건조시켰다. 상기에서 건조된 생성물을 2 차 증류수에 녹인 후, 활성화된 탄소/이온교환 수지 컬럼으로 정제하고 얻어진 수용액을 동결 건조하여 백색의 유리 아민 키토산을 얻었다.
본 발명의 제조방법을 이용하여 얻어진 수용성 유리 아민 키토산을 다양한 분광학적인 방법을 이용하여 하기와 같이 실험하였다.
1. FT-IR 스펙트럼의 비교
유기산 또는 무기산 염을 포함하는 키토산 올리고당 및 본 발명의 유기산 또는 무기산이 제거된 수용성 유리 아민 키토산의 FT-IR 스펙트럼을 비교하기 위하여 하기와 같이 실시하였다.
<비교예 1> 유기산 또는 무기산 염을 포함하는 키토산 올리고당
유기산 또는 무기산 염을 포함하는 키토산 올리고당 3 mg과 KBr 300 mg을 혼합하여 막자사발 (agate mortar and pestle)에 넣고 10 분 동안 잘 갈아준다. 혼합된 분말을 전체량에서 200 mg을 정량하여 얻어진 KBr 팰랫(pellet)은 감압하에 60 ℃에서 진공 건조하여 시마즈(Shimadzu)사의 FT-IR 8700D의 FT-IR 분광계를 이용하여 측정하였다.
도 2a는 유기산 또는 무기산 염을 포함하는 키토산 올리고당의 FT-IR 스펙트럼의 결과로서, 1730 cm-1부근에서 젖산 염에서 유래된 카르복실기의 강한 피크를 확인하였고, 2100 cm-1부근에서 효소 분해과정에서 생성된 불순물 피크 (A = 0.038)를 확인하였다.
<비교예 2> 유기산 또는 무기산이 제거된 수용성 유리 아민 키토산
본 발명의 유기산 또는 무기산이 제거된 수용성 유리 아민 키토산을 사용한 것을 제외하고는 상기 비교예 1과 동일한 농도와 실험방법으로 FT-IR 스펙트럼을 측정하였다.
도 2b는 본 발명의 유기산 또는 무기산이 제거된 수용성 유리 아민 키토산의 FT-IR 스펙트럼의 결과로서, 상기도 2a에서 관찰된 1730 cm-1부근의 카르복실 기의 강한 피크가 사라졌고, 2100 cm-1부근의 효소 분해과정에서 생성된 불순물 피크가 현저하게 감소(A=0.024)하였다.
또한, 수용성 유리 아민 키토산의 특성 피크인 아마이드 I (-C=O)의 피크 및 아민 (-NH2)에 의한 피크가 수소결합의 약화로 인해 각각 1635 및 1539 cm-1부근에서 분리된 강한 피크를 보임으로써 유기산 또는 무기산 염을 포함하는 키토산 올리고당에서 유기산 또는 무기산이 제거되었음을 알 수 있었다.
2.1H-NMR 스펙트럼의 비교
유기산 또는 무기산 염을 포함하는 키토산 올리고당 및 본 발명의 유기산 또는 무기산이 제거된 수용성 유리 아민 키토산의1H-NMR 스펙트럼을 비교하기 위하여 하기와 같이 실시하였다.
<비교예 3> 유기산 또는 무기산 염을 포함하는 키토산 올리고당
유기산 또는 무기산 염을 포함하는 키토산 올리고당 10 mg(0.54 mmol)을 D2O에 용해하여 브루커(Bruker)사의 DRX-500 MHz의1H-NMR 분광계로 측정하였다.
도 3a에서 보는 바와 같이, 1.0 ∼ 1.3 ppm 부근에서 젖산 염에서 유래한 강한 피크를 확인하였고, 여러 가지 불순물들로 인하여 키토산의 특성 피크를 정의하기 어려웠다.
<비교예 4> 유기산 또는 무기산이 제거된 수용성 유리 아민 키토산
본 발명의 유기산 또는 무기산이 제거된 수용성 유리 아민 키토산을 사용한 것을 제외하고는 상기 비교예 3과 동일한 농도 및 실험방법으로1H-NMR 스펙트럼을 얻었다.
도 3b는 상기 수용성 유리 아민 키토산의 스펙트럼 결과로서, 젖산 염에서 유래한 1.0 ∼ 1.3 ppm의 강한 피크가 사라졌고, 여러 가지 불순물에 의한 피크가현저하게 줄어 들었으며, 4.5 ∼ 4.7 ppm에서 C-1 위치의 1 개의 수소, 3.4 ∼ 3.9 ppm 부근에서 C-2, 3, 4, 5, 6 위치의 6 개의 수소 및 2.0 ppm 부근에서 아세트아마이드(acetamide)의 아세틸기 3 개의 수소를 정량적으로 확인하였다.
3.13C-NMR 스펙트럼의 비교
유기산 또는 무기산 염을 포함하는 키토산 올리고당 및 본 발명의 유기산 또는 무기산이 제거된 수용성 유리 아민 키토산의13C-NMR 스펙트럼을 비교하기 위하여 하기와 같이 실시하였다.
<비교예 5> 유기산 또는 무기산 염을 포함하는 키토산 올리고당
유기산 또는 무기산 염을 포함하는 키토산 올리고당을 10 mg (0.54 mmol)농도로 D2O에 용해하여 브루커(Bruker)사의 DRX-500 MHz의13C-NMR 분광계로 20 시간 동안 측정하였다.
도 4a의 결과를 살펴보면, 젖산 염에 기인한 카르복실기의 강한 피크가 20 ppm 부근에서 확인되었고, 여러 가지 불순물로 인하여 키토산의 특성 피크를 정의하기 어려웠다.
<비교예 6> 유기산 또는 무기산이 제거된 수용성 유리 아민 키토산
본 발명의 유기산 또는 무기산이 제거된 수용성 유리 아민 키토산을 사용한 것을 제외하고는 상기 비교예 5와 동일한 농도 및 실험방법으로13C-NMR 스펙트럼을 얻었다.
도 4b는 상기 수용성 유리 아민 키토산의 스펙트럼 결과로서, 상기도 4a의 스펙트럼에서 보인 20 ppm 부근에서 카르복실기의 강한 피크가 사라지고, 본 공정에서 제조된 수용성 유리 아민 키토산의 분자량이 18,579 달톤과 93.0 %의 탈아세틸화도를 감안할 때, 잔존하는 7.0 % 내에 키틴 단위체인 아세트아마이드기의 아미드(amide) Ⅲ (-NHCOCH3) 피크가 20 ppm 부근에서 정량적으로 확인되었다.
또한, 100 ppm 부근에서 C-1 위치의 탄소, 79 ∼ 70 ppm 부근에서 C-4, C-3 및 C-5 위치의 탄소 및 60 ∼ 55 ppm 부근에서 C-6과 C-2 위치에 있는 탄소를 정량적으로 확인할 수 있었다.
따라서, 유기산 또는 무기산 염을 포함하는 키토산 올리고당 및 본 발명의 유기산 또는 무기산이 제거된 수용성 유리 아민 키토산을 상기의 FT-IR 스펙트럼,1H-NMR 스펙트럼 및13C-NMR 스펙트럼의 분광학적인 방법을 이용하여 비교한 결과, 본 발명의 제조방법을 통하여 유기산 또는 무기산이 효과적으로 제거되었고, 순수한 수용성 유리 아민 키토산이 제조되었음을 확인하였다.
<실험예 1> 질량분석 결과
본 발명의 유기산 또는 무기산이 제거된 수용성 유리 아민 키토산에 대해 반복단위체인 글루코오스아민의 질량을 알아보기 위해 시마즈(Shimadzu) 사의 AXIMA-CFR의 질량분석기(MALDI-TOF Mass Spectrometer)를 이용하여 분석하였다.
도 5는 본 발명의 유기산 또는 무기산이 제거된 수용성 유리 아민 키토산의 질량분석의 결과를 나타낸 것이며, 이웃하는 두 피크 간의 차이가 키토산 글루코오스아민 단위체의 분자량인 161과 키토산 중량 평균 분자량이 18,579 달톤과 일치함을 확인하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 효소분해 후 얻어진 유기산 또는 무기산 염을 포함하는 키토산 올리고당으로부터 트리알킬 아민을 첨가하여 유기산 또는 무기산을 제거하며, 연속적으로 산 처리하고, 활성화된 탄소/이온교환수지 컬럼으로 정제함으로써, 순수한 수용성 유리 아민의 키토산을 제조하는 방법이며, 본 발명의 제조방법을 이용하여 유기산 또는 무기산이 제거된 순수한 수용성 유리 아민 키토산을 FT-IR 스펙트럼,1H-NMR 스펙트럼 및13C-NMR 스펙트럼의 분광학적인 결과를 통하여 확인하였고, 질량분석의 결과로부터 이웃하는 두 피크 간의 차이가 키토산 글루코오스아민 단위체의 분자량과 일치하고 생리활성을 띠는 분자량 범위가 포함된 1,000 ∼ 100,000의 분자량을 가진 수용성 유리 아민 키토산이 제조되었음을 확인하였다. 상기 수용성 유리 아민 키토산은 키토산 자체의 유리 아민의 강한 양전하를 이용하여 기능성 식품분야에서 뿐만 아니라, 음전하를 띠고 있는 DNA 및 유전적인 결함으로 생긴 질병을 치료할 수 있는 약물전달체에 응용될 수 있다.

Claims (10)

1) 키토산 올리고당의 유기산 또는 무기산 염의 용액을 염기인 트리알킬 아민으로 처리하고,
2) 상기 용액에 유기용매를 첨가하여 키토산 올리고당에 결합되어 있는 유기산 또는 무기산이 트리알킬 아민 염의 형태로 제거된 키토산 올리고당을 회수하고, 3) 상기에서 산이 제거된 키토산 올리고당 용액을 무기산 처리 후, 활성화된 탄소/이온교환수지(activated carbon/ion exchange resin) 컬럼으로 정제하여 1,000 ∼100,000 달톤의 분자량을 가진 순수한 수용성 유리 아민 키토산을 제조하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 유기산이 젖산, 초산, 프로피온산, 포름산, 아스코르브산, 및 주석산으로 구성하는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 1) 단계의 무기산이 염산, 질산 및 황산으로 구성하는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 트리알킬 아민은 트리-C1∼4알킬 아민이며, 트리메틸 아민, 트리에틸 아민, 트리프로필 아민, 트리이소프로필에틸 아민 및 트리부틸 아민으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 트리알킬 아민이 트리에틸 아민인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 트리알킬 아민이 키토산 올리고당의 아민기 1 당량에 대해 2 ∼ 3 당량의 비율로 첨가되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 3) 단계의 무기산이 염산, 질산 및 황산으로 구성되는 산에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 7 항에 있어서, 상기 무기산이 0.001 N의 염산인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 키토산 올리고당의 유기산 또는 무기산 염 용액에 사용된 용매가 PBS 7.0, 7.2 및 7.4로 구성하는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 키토산 올리고당의 유기산 또는 무기산 염이 불용성 키토산을 유기산 또는 무기산에 용해시키고, 얻어진 키토산 용액을 효소분해로 얻어진 것을 특징으로 하는 제조방법.
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