KR101457478B1

KR101457478B1 - 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물 및 이를 이용한 녹조 제거방법

Info

Publication number: KR101457478B1
Application number: KR1020130039379A
Authority: KR
Inventors: 나재운; 장미경; 박성철
Original assignee: 순천대학교 산학협력단
Priority date: 2013-04-10
Filing date: 2013-04-10
Publication date: 2014-11-06
Also published as: KR20140123130A; JP6140361B2; JP2016518360A; US20160021880A1; CN105072904B; WO2014168356A1; US9808005B2; CN105072904A

Abstract

본 발명은 녹조유발 조류에 대한 항조류 활성을 갖는 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 녹조유발 조류를 직접적으로 사멸을 유도함으로써 녹조를 억제하는 우수한 항녹조 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 담수 생물 내의 세포에 대하여 무독성이므로 이를 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물은 고형화된 댐, 저수지, 호수, 골프장 헤저드, 연못, 민물 양식장, 낚시터 등과 같은 담수 생태계에 안전한 항녹조용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물 및 이를 이용한 녹조 제거방법{Composition for anti-green algae containing water soluble free amine chitosan and method removing green algaes using the same}

본 발명은 녹조유발 조류에 대한 항조류 활성을 갖는 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물 및 이를 이용한 녹조 제거방법에 관한 것이다.

녹조현상이란 부영양화된 호수나 유속이 느린 하천에서 부유성의 조류(식물 플랑크톤)가 대량 증식하여 수면에 집적함으로써 물의 색을 현저하게 녹색으로 변화시키는 현상을 말한다. 매년 5월에서 10월 사이에 발생되는 유해성 녹조로 인해서 수 천억원의 환경 피해가 발생되고 있으며, 이는 심각한 환경재앙이라 할 수 있다. 녹조는 상층부 수온이 평균 3일 이상 23℃를 넘고 고형화된 댐, 저수지, 호수, 골프장 헤저드, 연못, 민물 양식장, 낚시터 등과 같이 물이 고여 있거나 유속이 느린 곳에서 쉽게 발생되고 있다. 국내에서 발견된 녹조류는 대부분 남조류의 일종으로 확인된 종류만 해도 약 167 종으로 그 종이 다양하다.

일반적으로 녹조가 발생되기 시작하면 조류 미생물의 번식속도가 기하급수적으로 늘어나고 물에 산소량을 대부분 조류들이 흡수해 버려 물이 빠르게 부영양화(산소 결핍)되면서 심할 경우에는 악취가 난다. 물속에 어류들은 산소량 부족과 아가미 측에 조류 부착으로 호흡이 어려워 물 상층부로 뜨면서 수온 변화가 심해 적응을 못하고 괴사하는 경우가 있다. 최근 낙동강, 대청호 등지에서 여름철 남조류가 대량 증식하여 물의 색을 변화시키는 경우가 자주 관찰되고 있다.

일단, 녹조가 발생하면 그 수역의 물은 음용수로나 산업용으로의 이용이 제한되어 막대한 비용이 소모되고 생태계도 파괴되며, 이 밖에도 사회, 경제, 환경적인 측면에서 많은 문제가 유발된다. 전 세계적에 해외 진출한 한국기업은 예를 들면, 아르헨티나 아주리 사건의 경우 물 정수 공장의 녹조 유입으로 인한 5억 5천만 달러 규모의 피해보상액 소송사건과 같은 녹조로 인한 직접적, 간접적 피해 또한 증가하는 추세이다(중국 타이후 호수 녹조발생으로 중국진출 한국기업 2곳 폐업, 2007. 7).

또한, 녹조를 일으키는 조류 증식의 또 다른 피해로 호수나 저수지에서 수영을 하거나 물을 마신 사람에게 질병을 일으킬 수 있는 마이크로시스틴(microcystin)이라는 독성의 고리형 펩타이드가 생성된다. 이는 녹조가 고농도로 발생하였을 경우, 기존의 녹조 방제기술들을 이용한 조류의 사멸은 마이크로시스틴의 분비를 오히려 촉진시킬 수 있는데, 대량으로 방출된 마이크로시스틴은 수중 생물의 생장에도 영향을 미칠 뿐 아니라, 사람에게도 영향을 미친다.

나아가, 녹조의 발생은 담수뿐만 아니라, 해안가에서도 심각한 환경문제로 대두되고 있다. 상기 해수 녹조는 해조인 파래속(屬)이 이상 증식하여 해안선에 퇴적되는 현상에 의해 발생된다. 해수 녹조는 세계 각지에서 발생이 보고되고 있으며, 미국 체사피크만(Chesapeake Bay) 및 프랑스 브루타뉴(Bretagne) 지방, 중국 첸타오 등에서의 발생사례가 유명하다. 일본 국내에서는 1990년 이후 도쿄만 및 세토 내해, 규슈 각 지역의 해안지역 등에서 발생이 확인되고 있다. 녹조의 발생에 의해 해안지역의 경관 악화, 해조의 부패에 의한 악취, 바지락 등 어패류의 사멸 등 다양한 악영향이 초래하고 있으며, 이로 인하여 일본의 각 지자체는 연간 수 천만 엔의 비용을 투입하여 녹조의 제거 및 폐기를 실시하고 있지만, 매년 발생하는 연안 녹조에 대한 효과적인 대책이 없는 것이 현재 상태이다.

현재, 녹조로 인해 발생되는 피해를 최소화할 수 있는 방안 및 대책이 요구되고 있으나, 상기 문제를 해결하기 위하여 현재 사용할 수 있는 기존의 기술은 2차, 3차 생태계에 문제점을 야기할 수 있고 시간이 많이 소요된다는 단점이 있다. 그 예로는 다음의 녹조제거 방법을 들 수 있다.

먼저, 담수 녹조의 제거 방법으로 널리 쓰이는 방법인 황토의 살포이다. 황토는 비중이 크고 무기물로 되어 있으며 해수 중에서 입자의 전기 이중층(electricl double-layers)이 크게 압축되어 용이하게 응결 침전할 수 있으므로 녹조 생물을 응집시켜 담수나 해수 바닥으로 침전시킨다. 이 방법은 녹조 예방 및 제거를 위하여 우리나라에서 주로 사용하고 있는 방법이나, 생황토 살포 시, 2차적인 환경오염이 발생됨으로써 외국에서는 사용하지 않는 방법이다. 즉, 고형 혹은 유속이 늘인 곳에 황토를 살포하면 미세황토가 침전하여 물속의 여러 생물까지 폐사시킬 수 있을 뿐만 아니라, 최근에는 침전된 유해 조류가 휴면기를 지나 다시 생장할 수 있다는 보고되어 2차 피해를 발생시킬 수 있다.

다음으로, 물리적인 녹조 방제방법은 육상 및 양식장의 모든 폐기물과 오염 물질 등이 퇴적층에 침전되어 부패 분해되면서 용존 산소를 소비하고, 각종 유독성 물질을 생성하여 녹조를 일으키는데, 퇴적층을 준설하거나 갈아줌으로써 녹조 발생을 사전에 방지할 수 있다. 그러나 이 방법은 실제로 녹조를 일으키는 넓은 호수나 댐 등에는 효과를 거두기가 어렵다는 문제가 있다.

다음으로 인공섬 설치와 차광막 설치 등이 있는데 이 또한, 넓은 면적에는 적용되어지기 힘들다(비특허문헌 1). 그 외에 산소를 공급해주는 심층폭기법은 수심이 5 m 이내인 경우 가능하나 면적에 한계가 있다(비특허문헌 2). 최근에 국내외에서 개발된 초음파를 이용하여 유해 조류의 막을 파괴하는 장치를 개발하여 시판하고 있다(특허문헌 1). 그러나, 이 방법 역시, 초음파의 세기에 따라 다른 수생 생물의 생장에 영향을 줄 수 있는 단점이 있다. 이처럼 물리적인 방법은 녹조 방제에 있어 비용이 엄청나기 때문에 이용 가능성이 매우 낮다고 볼 수 있다.

이에, 본 발명자들은 상기의 문제점들을 고려하여, 자연친화적이며 인체 및 자연 생태계에 무해한 키토산을 녹조유발 조류에 처리하였을 경우, 녹조를 유발시키는 조류에 대하여 항조류 효과가 있을 뿐만 아니라, 수중 생물에 대하여 독성이 없는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제10-1235053호.

한국수자원공사, 하천-저수지시스템에서 녹조발생기작 및 저감기술연구 연구보고서, 2007; 한국수자원공사, 다목적댐 수중폭기장치 설치 타당성조사 연구보고서, 1990.

본 발명의 목적은 녹조유발 조류에 항조류 활성을 갖는 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물을 제공하는 데 있다.

발명의 다른 목적은 상기 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물을 녹조 발생 담수 수역에 살포하여 녹조를 제거하는 방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 녹조유발 조류에 항조류 활성을 갖는 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물을 녹조 발생 수역에 살포하여 녹조를 제거하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 녹조유발 조류를 직접적으로 사멸을 유도함으로써 녹조를 억제하는 우수한 항녹조 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 담수 생물 내의 세포에 대하여 무독성이므로 이를 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물은 고형화된 댐, 저수지, 호수, 골프장 헤저드, 연못, 민물 양식장, 낚시터 등과 같은 담수 생태계에 안전한 항녹조용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 제조예 2의 마이크로시스티스 아에루지노사(Microcystis aeruginosa)에 대한 항조류 활성을 광학 및 형광 관찰한 사진이다;
도 2는 제조예 2의 시네더스머스 오빌리쿼스(Scenedesmus obliquus)에 대한 항조류 활성을 광학 및 형광 관찰한 사진이다;
도 3은 본 발명의 제조예 1, 제조예 2 및 비교예 1 내지 비교예 4에서 제조된 수용성 유리 아민 키토산의 담수 생물인 붕어의 적혈구에 대해 용혈률을 도시한 그래프이다;
도 4은 제조예 2에서 제조된 수용성 유리 아민 키토산을 마이크로시스티스 아에루지노사(Microcystis aeruginosa)의 배양액에 처리하고 4시간 및 36시간 경과 후의 항조류 활성을 관찰한 사진이다(제조예 2-1은 수용성 유리 아민 키토산 처리 4시간 경과한 후의 배양액이고; 및 제조예 2-2는 수용성 유리 아민 키토산 처리 36시간 경과한 후의 배양액이다);
도 5는 제조예 2에서 제조된 수용성 유리 아민 키토산을 시네더스머스 오빌리쿼스(Scenedesmus obliquus)의 배양액에 처리하고 36시간 경과 후의 항조류 활성을 관찰한 사진이다;
도 6은 제조예 2에서 제조된 수용성 유리 아민 키토산을 녹조가 발생한 연못의 물에 처리하고 1시간 경과 후의 변화를 관찰한 사진이다;
도 7은 제조예 2에서 제조된 수용성 유리 아민 키토산을 녹조가 발생한 연못의 물에 처리하고 12시간 후의 변화를 관찰한 사진이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 녹조유발 조류에 항조류 활성을 갖는 분자량이 20 kDa 내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 항녹조용 조성물은 마이크로시스티스 아에루지노사(Microcystis aeruginosa), 시네더스머스 오빌리쿼스(Scenedesmus obliquus), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) 등의 녹조유발 조류에 대하여 항조류 활성을 갖는다.

또한, 본 발명에 따른 상기 항녹조용 조성물에 유효성분으로 함유되는 수용성 유리 아민 키토산은 다음과 같은 방법에 의하여 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:

불용성 키토산에 유기산 및 무기산을 이용하여 염의 형성한 후, 효소분해하여 키토산 다당류를 제조하는 단계(단계 1);

상기 단계 1에서 제조된 키토산 다당류의 유기산 또는 무기산 염의 용액을 염기인 트라이알킬아민으로 처리하는 단계(단계 2);

상기 단계 2의 혼합 용액에 유기용매를 첨가하여 키토산 다당류에 결합되어 있는 유기산 또는 무기산을 트라이알킬아민 염과의 형태로 제거된 키토산 다당류를 제조하는 단계(단계 3); 및

단계 3에서 제조된 산이 제거된 키토산 다당류 용액을 무기산 처리 후, 활성화된 탄소/이온교환수지(activated carbon/ion exchange resin) 컬럼으로 정제하여 순수한 수용성 유리 아민 키토산을 제조하는 단계(단계 4).

본 발명에 따른 상기의 제조방법에 의하여 제조되는 수용성 유리 아민 키토산은 물에 대한 용해도가 높고, 생리활성을 띄는 1 kDa 내지 100 kDa의 분자량을 갖는 수용성 유리 아민 키토산이 제조된다.

이때, 본 발명에 따른 항조류용 조성물은 수용성 유리 아민 키토산의 분자량이 녹조를 유발시키는 조류에 대하여 항조류 활성을 갖는 20 kDa 내지 100 kDa인 것을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산의 분자량이 20 kDa 미만인 경우, 녹조유발 조류에 대한 항조류 활성은 있으나, 활성력이 낮으므로 녹조 예방 및 제거하기 어려운 문제가 있고, 분자량이 100 kDa을 초과하는 경우, 항녹조 활성은 우수하나, 타 수중생물에 대한 독성이 나타나는 문제가 있다.

본 발명에 따른 항녹조용 조성물의 유효성분으로 함유되는 수용성 유리 아민 키토산의 녹조를 유발시키는 조류에 대한 항조류 활성을 평가하기 위하여 실험한 결과, 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 녹조유발 담수 조류인 마이크로시스티스 아에루지노사(Microcystis aeruginosa), 시네더스머스 오빌리쿼스(Scenedesmus obliquus) 및 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)에 대한 50% 생육 저해농도가 0.024 g/L 이하로, 낮은 농도의 사용으로도 녹조유발 담수조류에 대하여 높은 항조류 활성을 나타내는 것을 알 수 있다(실험예 1 참조). 또한, 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 담수 생물인 붕어가 존재하는 물에 처리하여도 붕어의 적혈구에 대하여 적혈구 용혈현상을 유발하지 않아 세포독성이 없는 것이 확인되었다(실험예 3 참조). 나아가, 녹조유발 조류생물의 개체수를 증가시킨 실험에서도 현저히 우수한 녹조제거 및 억제 효과가 있는 것으로 나타났으며, 본 발명의 수용성 유리 아민 키토산을 실제 녹조가 유발된 연못의 물에 처리한 경우에도 항녹조 활성이 뛰어난 것으로 나타났다(실험예 4 및 실험예 5 참조).

따라서, 본 발명에 따른 분자량이 20 kDa 내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산은 녹조유발 조류에 대하여 우수한 항조류 활성이 있을 뿐만 아니라, 담수 생물에 대하여 세포독성이 없어 생태계의 악영향을 미치지 않으므로, 이를 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물은 고형화된 댐, 저수지, 호수, 골프장 헤저드, 연못, 민물 양식장, 낚시터 등과 같은 담수 생태계에 안전한 항녹조용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 녹조유발 조류에 항조류 활성을 갖는 분자량이 20 KDa 내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물을 녹조 발생 수역에 살포하여 녹조를 제거하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 제조예 및 실험예에 의해 보다 상세히 설명한다.

단, 하기의 제조예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 제조예 1> 수용성 유리 아민 키토산의 제조 1

단계 1: 키토산 다당류의 제조

젖산을 용매로 하여 5% 키토산 용액을 제조하였다. 상기 5 % 키토산 용액(pH 5.0-5.5) 100 mL에 5 유니트(unit)의 바실러스 푸밀러스(Bacilllus pumilus) BN-262에서 유래된 키토사네이즈(chitosanase) 효소를 혼합하여 40℃에서 36시간 동안 효소반응을 수행하였다. 반응이 종료되면, 1 μm 전처리 필터(pre-filter)를 사용하여 예비 여과한 후, 분자량이 20 kDa인 중공사 여과지(hollow filter)로 재여과하였다. 상기 단계에서 얻은 여과액을 나노 여과 시스템(nanofilter system)을 이용하여 농축하고, 살균과정을 거쳐 공기 분무 건조기(spray dryer)로 건조함으로써 키토산 다당류를 제조하였다.

단계 2: 산이 제거된 키토산 다당류의 제조

상기에서 얻어진 키토산 다당류를 1 L의 PBS 7.0에 용해시키고, 0.52 L의 트리에틸 아민을 천천히 떨어뜨렸다. 이때, 키토산 올리고당의 아민기 1 당량에 대해 트리에틸 아민 2 당량으로 반응시켰다. 상기의 반응물을 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 아세톤을 첨가하여 교반하고 원심분리하였다. 상기 과정을 2 내지 3회 반복한 후 공기 건조 및 동결 건조하여 산이 제거된 키토산 다당류를 제조하였다. 이때, 원심분리는 Supra 30 K를 이용하여 4℃에서 15,000 rpm으로 20분 동안 실시하였다.

단계 3: 수용성 유리 아민 키토산의 제조

상기 단계 2에서 제조된 키토산 다당류에 30 mL 내지 50 mL의 0.001 N 염산을 첨가한 후 2시간 동안 반응시키고, 상기 반응물에 아세톤을 첨가하여 교반하고 상기와 동일한 조건으로 원심분리하였다. 이러한 과정을 2 내지 3 회 반복한 후 공기 건조 및 동결 건조하였다. 상기에서 건조된 생성물을 2차 증류수에 녹인 후, 활성화된 탄소/이온교환 수지 컬럼으로 정제하고 얻어진 수용액을 동결 건조하였고 이를 물에 녹여 투과 분자량이 20 kDa 셀룰로오스 아세테이트 막을 통하여 분자량이 20 kDa인 수용성 유리 아민 키토산을 얻었다.

< 제조예 2> 수용성 유리 아민 키토산의 제조 2

상기 제조예 1의 단계 3에서 20 kDa 셀룰로오스 아세테이트 막을 사용하는 대신에 100 kDa 셀룰로오스 아세테이트 막의 사용하는 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하여 분자량이 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산을 얻었다.

< 비교예 1> 수용성 유리 아민 키토산의 제조 3

상기 제조예 1의 단계 3에서 20 kDa 셀룰로오스 아세테이트 막을 사용하는 대신에 1 kDa 셀룰로오스 아세테이트 막의 사용하는 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하여 분자량이 1 kDa인 수용성 유리 아민 키토산을 얻었다.

< 비교예 2> 수용성 유리 아민 키토산의 제조 4

상기 제조예 1의 단계 3에서 20 kDa 셀룰로오스 아세테이트 막을 사용하는 대신에 3 kDa 셀룰로오스 아세테이트 막의 사용하는 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하여 분자량이 3 kDa인 수용성 유리 아민 키토산을 얻었다.

< 비교예 3> 수용성 유리 아민 키토산의 제조 5

상기 제조예 1의 단계 3에서 20 kDa 셀룰로오스 아세테이트 막을 사용하는 대신에 5 kDa 셀룰로오스 아세테이트 막의 사용하는 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하여 분자량이 5 kDa인 수용성 유리 아민 키토산을 얻었다.

< 비교예 4> 수용성 유리 아민 키토산의 제조 6

상기 제조예 1의 단계 3에서 20 kDa 셀룰로오스 아세테이트 막을 사용하는 대신에 10 kDa 셀룰로오스 아세테이트 막의 사용하는 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하여 분자량이 10 kDa인 수용성 유리 아민 키토산을 얻었다.

< 비교예 5> 수용성 유리 아민 키토산의 제조 7

상기 제조예 1의 단계 1에서 키토산 용액의 효소 반응 및 단계 3의 20 kDa 셀룰로오스 아세테이트 막 여과를 수행하지 않는 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하여 분자량이 150 kDa인 수용성 유리 아민 키토산을 얻었다.

< 실험예 1> 수용성 유리 아민 키토산의 항녹조 활성 평가 1

본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산의 항녹조 활성을 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

항녹조 활성을 측정하기 위한 녹조유발 조류로서 한국 해양미세조류 은행으로부터 분양받은 마이크로시스티스 아에루지노사(Microcystis aeruginosa), 시네더스머스 오빌리쿼스(Scenedesmus obliquus), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)를 사용하였다. 상기 각 조류를 NaNO₃(15 mg), 40 mg K₂HPO₄(40 mg), MgSO₄·7H₂O(75 mg), CaCl₂·2H₂O(36 mg), 시트르산(6 mg), 구연산 철 암모늄(6 mg), EDTA(1 mg), NaCO₃(20 mg), H₃BO₃(2.86 mg), MnCl₂·4H₂O(1.81 mg), ZnSO₄·7H₂O(0.222 mg), CuSO₄·5H₂O(0.079 mg), Co(NO₃)₂·6H₂O(0.0494 mg/1L)를 포함하는 BG-11 배지에서 22℃, 조도 3,000 럭스(lux)에서 14시간/10시간 명암 주기로 일정하게 두고 배양하였다. 전배양된 녹조 생물 세포를 세포 수 2×10⁵세포/mL 또는 5×10⁵세포/mL의 농도로 희석하여 24 웰(well) 마이크로 타이트레이트 플레이트에 접종하였다. 상기 제조예 1, 제조예 2 및 비교예 1 내지 비교예 5에서 제조된 각 수용성 유리 아민 키토산을 6.25(mg/mL)/웰(well) 농도로부터 시작하여 1/2배씩 희석하여 상기 균주가 접종된 플레이트에 주입하였다. 또한, 수용성 유리 아민 키토산을 함유하지 않는 BG-11배지를 수용성 유리 아민 키토산 대신 첨가하여 무처리군으로 사용하였다. 상기 배양조건에서 2일 동안 배양하면서 6시간 마다 녹조 생물수를 헤모사이토메터(hemocytometer)를 이용하여 측정하여, 50% 생육 저해농도(50% of inhibitory concentration, 이하 IC₅₀라 약칭함) 값을 결정하였고, 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

	IC₅₀ (g/L)
	마이크로시스티스 아에루지노사	시네더스머스 오빌리쿼스	클로렐라 불가리스
제조예 1	0.39	0.097	0.049
제조예 2	＜0.012	＜0.024	＜0.012
비교예 1	12.5	25	0.195
비교예 2	1.56	0.56	0.049
비교예 3	1.56	0.39	0.049
비교예 4	0.78	0.195	0.049
비교예 5	＜0.012	＜0.024	＜0.012

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 분자량이 20 kDa 내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산은 녹조유발 조류에 대하여 우수한 항조류 활성이 있는 것을 알 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 20 kDa 내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산은 녹조유발 조류인 마이크로시스티스 아에루지노사(Microcystis aeruginosa), 시네더스머스 오빌리쿼스(Scenedesmus obliquus), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)에 대하여, 분자량 의존적인 것으로 나타났으며, 분자량이 100 kDa인 경우, IC₅₀ 값이 0.024 g/L 이하로 녹조를 유발하는 조류에 대한 항조류 활성이 우수한 것으로 나타났다. 또한, 분자량이 20 kDa인 경우에도 녹조유발 조류에 대한 항조류 활성이 우수한 것으로 나타났으며 특히, 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)의 경우, 0.049 g/L의 현저히 우수한 항조류 활성이 있는 것으로 확인되었다. 반면, 분자량이 100 kDa를 초과하는 비교예 5의 경우에는 항조류 활성이 우수한 것으로 확인되었으나 비교예 1 내지 비교예 4에서 제조된 분자량이 20 kDa 미만인 수용성 유리 아민 키토산을 처리한 경우, 녹조유발 조류에 대한 항조류 활성이 있는 것으로 나타나지만, 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)를 제외한 나머지 조류에 대해서는 그 농도가 본 발명에 따른 20 kDa 내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산을 사용한 경우와 대비하여 최소 2배 이상의 농도로 처리를 하여야 항조류 활성이 나타나는 것을 알 수 있다. 이로부터, 본 발명에 따른 20 kDa 내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산은 녹조유발 조류에 대하여 우수한 항조류 활성이 있는 것을 알 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 20 kDa 내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산은 녹조유발 조류에 대하여 항조류 활성이 우수하여, 녹조를 감소 및 증식을 억제하는 효과가 뛰어나므로, 이를 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물은 고형화된 댐, 저수지, 호수, 골프장 헤저드, 연못, 민물 양식장, 낚시터 등과 같은 담수 생태계에 안전한 항녹조용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

< 실험예 2> 수용성 유리 아민 키토산의 항녹조 활성 평가 2

상기 실험예 1에서 사용한 녹조유발 조류를 NaNO₃(15 mg), 40 mg K₂HPO₄(40 mg), MgSO₄·7H₂O(75 mg), CaCl₂·2H₂O(36 mg), 시트르산(6 mg), 구연산 철 암모늄(6 mg), EDTA(1 mg), NaCO₃(20 mg), H₃BO₃(2.86 mg), MnCl₂·4H₂O(1.81 mg), ZnSO₄·7H₂O(0.222 mg), CuSO₄·5H₂O(0.079 mg) 및 Co(NO₃)₂·6H₂O(0.0494 mg/1L)를 포함하는 BG-11 배지에서 배양하였다. 배양된 녹조생물을 10⁵세포/mL의 농도로 24 웰 마이크로 타이트레이트 플레이트에 접종한 뒤 상기 제조예 2에서 제조된 수용성 유리 아민 키토산을 웰당 12 mg/mL의 농도로 상기 녹조생물이 접종된 플레이트에 주입하여 22℃에서 2시간 동안 배양하였다. 또한, 수용성 유리 아민 키토산을 함유하지 않는 BG-11배지를 수용성 유리 아민 키토산 대신 첨가하여 무처리군으로 사용하였다. 배양 후, 가시화하기 위하여 광학과 형광 현미경상에서 관찰하였으며, 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.

도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 녹조유발 조류에 대항 항조류 활성이 있는 것을 알 수 있다. 보다 구체적으로 녹조류 생물의 살아있는 상태에서는 자체적으로 형광을 발하고, 죽은 상태에서는 형광을 발하지 않는 성질을 이용한 형광 현미경 관찰 결과, 무처리군의 경우 생물의 수가 유지되고 외형적으로 변화가 없는 반면, 제조예 2에서 제조된 수용성 유리 아민 키토산을 처리한 경우 형광이 발하는 정도가 무처리군과 대비하여 현저히 감소할 뿐만 아니라, 개체수의 증가가 관찰되지 않았다. 이로부터, 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 녹조유발 조류의 사멸을 초래함을 알 수 있다.

< 실험예 3> 담수 생물에 대한 세포독성 평가

본 발명에 따른 20 kDa 내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산의 담수 생물에 대한 세포독성을 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 담수 생물인 붕어로부터 혈액을 채취한 후 헤파린으로 혈액응고를 방지하고 적혈구 세포를 분리하였다. 분리된 적혈구의 농도를 8%로 조절한 후 제조예 1, 제조예 2 및 비교예 1 내지 비교예 5에서 제조된 각 수용성 유리 아민 키토산을 10 mg/mL에서 2배씩 희석하여 처리하였다. 2시간 후, 상층액을 분리하여 유리된 헤모글로빈의 수치를 마이크로 플레이트 리더기를 통해 측정하여 적혈구 용혈률을 구하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 20 kDa 내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산은 담수 생물에 대한 세포독성이 없는 것을 알 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 제조예 1 및 제조예 2에서 제조된 수용성 유리 아민 키토산은 농도에 상관없이 5% 미만의 낮은 용혈률을 나타내는 것으로 나타났다. 반면, 비교예 5에서 제조된 분자량이 100 kDa을 초과하는 수용성 유리 아민 키토산의 경우 낮은 농도에서도 높은 용혈률을 나타내는 것으로 확인되었다. 이로부터, 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 세포독성이 없어 담수 생물에 대하여 안전한 것을 알 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 20 kDa 내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산은 녹조유발 조류에 대하여 항조류 활성이 우수할 뿐만 아니라, 세포독성이 없어 담수 생물에 대한 안전성이 높으며, 이로 인하여 2차 생태계 문제를 발생되지 않으므로, 이를 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물은 고형화된 댐, 저수지, 호수, 골프장 헤저드, 연못, 민물 양식장, 낚시터 등과 같은 담수 생태계에 안전한 항녹조용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

< 실험예 4> 수용성 유리 아민 키토산의 녹조 제거 효과 평가 1

본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산의 녹조 제거 효과를 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

티플라스크에 상기 실험예 1과 동일한 배양조건에서 전배양된 마이크로시스티스 아에루지노사(Microcystis aeruginosa) 및 시네더스머스 오빌리쿼스(Scenedesmus obliquus)를 10⁶세포 이상을 주입하고 제조예 2에서 제조된 수용성 유리 아민 키토산을 24 mg/L을 처리한 후, 6시간 마다 녹조유발 조류의 세포수를 헤모사이토메터(hemocytometer)를 이용하여 측정하고, 24시간 이후 물의 탁도 변화를 관찰하였다. 이때, 수용성 유리 아민 키토산을 함유하지 않는 배지를 무처리군으로 사용하였으며 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.

도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 녹조유발 조류인 마이크로시스티스 아에루지노사(Microcystis aeruginosa) 및 시네더스머스 오빌리쿼스(Scenedesmus obliquus)에 대하여 뛰어난 항조류 활성을 나타내는 것을 알 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산을 처리하지 않은 무처리군은 물의 탁도가 높아 현탁할 뿐만 아니라, 녹조유발 조류인 마이크로시스티스 아에루지노사(Microcystis aeruginosa) 및 시네더스머스 오빌리쿼스(Scenedesmus obliquus)의 개체수가 증가된 반면, 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산이 처리된 경우 물의 탁도가 낮아져 맑은 것을 관찰할 수 있었으며, 플라스크 바닥에 죽은 조류들이 침전되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 이로부터, 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 녹조유발 조류에 대하여 높은 항조류 활성이 있는 것을 알 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 20 kDa 내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산은 녹조유발 조류에 대하여 항조류 활성이 우수하여, 녹조를 감소 및 증식을 억제하는 효과가 뛰어나고, 이로 인하여 녹조가 발생된 물에 대한 녹조 제거 효과가 상당히 우수하므로, 이를 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물은 고형화된 댐, 저수지, 호수, 골프장 헤저드, 연못, 민물 양식장, 낚시터 등과 같은 담수 생태계에 안전한 항녹조용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

< 실험예 5> 수용성 유리 아민 키토산의 녹조 제거 효과 평가 2

본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산의 실제 녹조가 발생된 담수에 대한 녹조 제거 효과를 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 녹조가 심한 인근의 연못의 물을 700 L를 채취하여 수조로 옮겼다. 그 후, 본 발명에 따른 제조예 2에서 제조된 수용성 유리 아민 키토산을 60 mg/mL 처리하고, 1시간 및 12시간이 경과한 후의 수조 내 물 상태를 촬영하였다. 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.

도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 실제 녹조가 발생된 연못물 내에 존재하는 녹조유발 조류에 대해서도 항조류 활성이 우수한 것을 알 수 있다. 보다 구체적으로, 도 6으로부터 본 발명에 따른 제조예 2의 수용성 유리 아민 키토산을 처리하고 1시간이 경과한 후에 연못물 내에 존재하는 녹조유발 조류가 사멸하여 침전되기 시작하는 것으로 나타났다. 또한, 도 7로부터 수용성 유리 아민 키토산을 처리하고 12시간이 경과한 후에는 녹조유발 조류가 모두 사멸하여 모두 침전되고, 연못물의 탁도가 상당히 맑아진 것을 확인할 수 있다. 이로부터, 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 실제 녹조가 발생된 담수에 대하여 녹조를 제거하는 효과가 우수한 것을 알 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 20 kDa 내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산은 녹조유발 조류에 대하여 항조류 활성이 우수하여, 녹조를 감소 및 증식을 억제하는 효과가 뛰어나고, 이로 인하여 실제 녹조가 발생된 담수에 대한 녹조 제거 효과가 탁월하므로, 이를 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물은 고형화된 댐, 저수지, 호수, 골프장 헤저드, 연못, 민물 양식장, 낚시터 등과 같은 담수 생태계에 안전한 항녹조용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

녹조유발 조류에 항조류 활성을 갖는 분자량이 20 KDa 내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 항녹조용 조성물은 마이크로시스티스 아에루지노사(Microcystis aeruginosa), 시네더스머스 오빌리쿼스(Scenedesmus obliquus), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 녹조유발 조류에 대하여 항조류 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 항녹조용 조성물.
녹조유발 조류에 항조류 활성을 갖는 분자량이 20 KDa 내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물을 녹조 발생 수역에 살포하여 녹조를 제거하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 녹조를 제거하는 방법은 마이크로시스티스 아에루지노사(Microcystis aeruginosa), 시네더스머스 오빌리쿼스(Scenedesmus obliquus), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 녹조유발 조류를 제거하여 수행되는 것을 특징으로 하는 녹조를 제거하는 방법.