KR20110023307A - 적조유발 조류에 항적조 활성을 갖는 수용성 유리 아민 키토산, 이를 유효성분으로 함유하는 항적조제 및 이를 이용한 적조 제거방법 - Google Patents

적조유발 조류에 항적조 활성을 갖는 수용성 유리 아민 키토산, 이를 유효성분으로 함유하는 항적조제 및 이를 이용한 적조 제거방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 적조유발 조류에 항적조 활성을 갖는 수용성 유리 아민 키토산, 이를 유효성분으로 함유하는 항적조제 및 이를 이용한 적조 제거방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 적조유발 조류의 세포막에 작용하여 세포막의 파괴를 유도함으로써 우수한 항적조 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 적조유발 조류에만 선택적으로 작용하므로 해양생태계에 안전한 항적조제로 유용하게 사용될 수 있다.
적조, 항적조 활성, 항적조제, 수용성 유리 아민 키토산, 해양생태계

Description

적조유발 조류에 항적조 활성을 갖는 수용성 유리 아민 키토산, 이를 유효성분으로 함유하는 항적조제 및 이를 이용한 적조 제거방법{Water soluble free amine chitosan with algicidal activity against harmful algal bloom species induced red tide, anti-red tide agent including the same as an active ingredient and removal method of red tide using the same}
본 발명은 적조유발 조류에 항적조 활성을 갖는 수용성 유리 아민 키토산, 이를 유효성분으로 함유하는 항적조제 및 이를 이용한 적조 제거방법에 관한 것이다.
적조현상이란 일반적으로 해양에 서식하는 동식물성 플랑크톤, 원생동물 및 박테리아와 같은 미생물이 일시에 다량으로 증식되거나 또는 생물, 물리적으로 집적되어 바닷물의 색깔을 변색시키고 해양생물에 나쁜 영향을 미치는 현상을 뜻한다.
상기 적조현상은 세계의 모든 연안 수역에서 널리 발생하며, 특히 일본의 세 토 내해, 미국의 캘리포니아 연안, 동남 아시아 연안과 북해 연안에서 자주 발생하고 있다. 최근 우리 나라 남해 연안과 서해 및 동해남부 연안 수역에서 자주 발생하는 적조현상은 계절에 관계없이 상습적으로 발생하고 있으며, 특히 적조생물은 규조류에서 편모조류로 바뀌어 가고 고밀도화되어 가는 경향을 보이고 있다.
우리나라의 경우, 적조현상은 1981년까지는 7, 8월에 발생하였으나 이후에는 4월에도 적조가 발생, 점점 빨리 발생하는 추세를 보이고 있다. 뿐만 아니라 어떤 해역에서는 12월에도 적조현상이 관찰되는 등 발생기간의 폭이 넓어지고 있다. 그러나 적조현상의 주 발생시기는 매년 고수온기인 6월부터 9월이고 지속기간도 1981년도에는 약 20일 정도였으나, 이후에는 마산만의 장기적조를 제외하고는 보통 일주일 내지 이주일 가량 계속되었다. 한편 적조현상은 전국 연안에서 발생하고 있는데, 동해, 서해에서는 매우 간헐적으로 일어나지만 남해안, 특히 진해만에서는 연중 발생하고 있다. 그 세력은 1980년 이전에는 폐쇄성 내만에서 소규모, 국부적으로 발생하였으나 1981년도에는 미증유의 대규모 적조가 진해만 일원에 걸쳐 발생하였다. 그러나 1982년부터는 다시 국부적으로 발생하는 추세를 보이고 있으며, 발생해역은 연도별로 다소 차이가 있으나 1984년과 비슷한 양상을 나타내고 있다. 이와 같이 적조생물은 우리 나라의 남서해안과 동해남부 연안 특히 폐쇄성 내만인 진해만, 광양만, 온산만 등에서 자주 발생하고 있다. 특히 마산만에서는 매년 상습적으로 발생하고 있으며 진해만 서부 연안인 당동만, 원문만에서도 상당히 빈발하고 있는 실정이다. 특히 1989년이래 사량도 주변해역에서는 어류를 직접 폐사시키는 유해 적조가 발생하고 있다.
이러한 적조의 발생은 사람과 어패류에 치명적인 피해를 초래하게 된다. 즉, 편모류에는 유독종이 많아 어패류의 폐사는 물론 이 유독화된 어패류를 식용할 경우 중독을 일으키게 되며 어패류의 아가미에 달라붙어 질식사시키기도 하고 적조의 산화분해로 말미암아 수중의 산소가 결핍되어 어패류를 폐사시키는 원인이 됨으로써 국내 양식산업에 막대한 피해를 주고 있다. 어패류는 적조가 발생하면 수중의 용존산소가 결핍되어 질식사하거나, 적조생물이 생산하는 독소 또는 2차적인 황화수소, 메탄가스, 암모니아 등 유독성 물질에 의하여 중독사 하며, 생산성이 떨어져 어장가치가 떨어진다. 또한, 유독성 식물 플랑크톤을 먹은 어패류를 사람이 먹게 되면 여러 가지 패독현상을 일으키게 된다.
적조를 일으키는 생물은 식물성 플랑크톤으로 편조류, 규조류, 원생동물을 들 수 있는데, 편조류는 편모를 가지고 이동하며 광합성 외 부식성 영양섭취도 하며, 번식속도가 느리고(1회 분열시 2 내지 5일 소요), 주로 직접 피해를 일으킨다. 또한 규조류는 편모가 없고 이동성이 없거나 약하며 번식속도가 빠르고(1회 분열시 0.5 내지 2일 소요), 주로 간접 피해를 일으킨다. 원생동물은 섬모를 가지고 이동하며 이동속도가 매우 빠르고, 주로 담수의 영향을 받는 기수지역에 발생한다고 알려져 있다. 우리 나라에서 발생하는 대표적인 적조원인생물은 코클리디움 폴리크리코이더스(Cochlodinium polykrikoides), 짐노디니움 임푸디쿰(Gymnodinium impudicum), 아카시오 상기니아(Akashiwo sanguinea), 린굴로디니늄 폴리에드 룸(Lingulodinium polyedrum), 프로로센트럼 미칸스(Prorocentrum micans), 짐노디움 카테나튬(Gymnodinium catenatum) 등 6종이 주종을 이루고 있다.
적조의 원인이 되는 생물이 증식하는 환경 요인은 크게 세 가지로 나누어 볼 수 있는데 첫째, 지형적으로 내만성이고 외양과의 해수교환이 적은 폐쇄성 해역이고, 둘째, 물리적 측면에서 볼 때, 적조생물의 생활 수온인 15 내지 20 ℃가 유지될 수 있는 여름철이어야 한다. 또한 이들 적조생물의 광합성 활동에 필요한 일조량이 풍부해야 하며 안정된 수괴가 형성되어야 하는 것도 한 조건이 된다. 셋째, 육지로부터 강우 등에 의하여 적조생물의 성장과 번식에 필요한 비료 성분인 영양염류가 유입되어 바닷물 속에 풍부하게 녹아 있어야 한다. 특히 질산염과 인산염은 적조 미생물의 성장 제한 인자로 작용하며 이 외에 비타민 복합제, 미량원소 등이 바닷물 속에 녹아있어야 한다고 알려져 있다.
현재까지 적조를 예방하거나 적조로 인한 피해를 줄이기 위한 여러 가지 방법들이 연구되었다. 화학약품을 뿌리거나(Steidinger, 1983; Ryu et al., 1998) 초음파 분쇄기, 오존 발생기, 원심분리기를 사용하여 화학적, 물리적으로 적조생물을 없애는 방법이 있다. 또한 점토를 이용하여 적조 원인생물을 흡착시켜 바닥으로 침전시키는 방법도 개발되었다(Na et al., 1996; Choi et al., 1998). 그러나 상기 방법들은 생태계에 또 다른 악영향을 미칠 수 있으며, 광범위한 적조 발생해역에서 이용되기에는 많은 문제점이 있다. 현재 적조 원인생물을 제거하는 생물학적 방법 도 연구가 진행되고 있다. 이것은 생태계 내에서 피식자-포식자 관계를 이용해 원하지 않는 생물을 제거하는 방법이다(Ishio et al., 1989; Sakata et al., Fukami et al., 1992; Park et al., 1998). 그러나 상기 방법은 생태계의 먹이 사슬을 변화시켜 또 다른 문제점을 야기할 수 있을 것이다. 또 다른 분야에서는 해양 박테리아가 분비하는 물질에 의한 적조생물을 죽이는 방법도 활발히 연구되고 있다. 최근에는 단백질 합성저해제, 세포벽 저해제 및 세포막에 작용을 하는 항생제들을 사용하여 적조생물을 방제하는 시도를 하고 있다. 또는 이러한 물질들을 모델로 하여 인위적으로 저분자 물질들을 유기합성을 하여 생산하기도 하는데 이는 바다에서 분해가 되지 않고 축적되어 결국 농업부분에서 사용되는 농약에 의해 야기되는 문제점들처럼 해양생태계나 바다에서 생산되는 먹거리를 통해 인체에까지 축적될 것이다.
이러한 문제점들을 고려해 볼 때 자연친화적이며 인체나 자연 생태계에 무해한 항적조제로 사용될 수 있는 것이 키토산 제제이다. 키토산 제제는 바다 생물인 게, 조개 등의 외골격을 이루는 키틴에서 유래되었기 때문에 대량 생산이 가능할 뿐만 아니라 바다생물에서 추출한 물질이라는 면에서 자연친화적이라 할 수 있다.
키토산은 글루코사민(glucosamine)의 피라노스(pyranose)단위체가 β-1,4 결합된 것으로서, 글루코사민 잔기가 5,000개 이상 결합된 분자량이 100만 이상인 천연고분자이다. 이러한 키토산은 게 껍질이나 새우와 같은 갑각류 및 오징어를 포함 하는 수산계로부터 추출할 수 있으며, 그 분자 구조로 볼 때 다당류의 일종인 셀룰로오즈와 유사한 구조로서, 생체 친화성이 우수하여 면역 반응시 거부 반응이 일어나지 않기 때문에 의약 산업에 응용되고 있으며, 최근 미국의 FDA에서 식품으로서 인증을 받은 후, 키토산은 21세기의 중요한 생물산업 및 생체의료용 물질로 응용되고 있다. 상기 키토산의 주요 용도의 일례로는 응집제, 중금속 흡착제, 염료폐수 정화제 등의 폐수처리 분야와 토양개량제, 살충제, 식물 항바이러스제, 농약 등의 농업 분야에서 널리 이용되어 왔으며, 최근에는 식품과 음료 응용분야, 보건위생 응용분야, 화장품 응용분야, 섬유관련 응용분야 및 의약품 응용분야로 더욱 확대되고 있다. 특히, 20,000 내지 100,000 이내의 특정 분자량의 범위를 가진 키토산은 강한 생리활성 기능을 띠고 있는 것으로 알려져 있기 때문에 건강 식품분야, 식ㆍ음료 분야, 화장품 분야, 보건위생 분야 및 의약품 분야에 대한 응용성을 기대할 수 있다.
그러나, 종래 키토산의 항적조 활성에 대한 효과는 알려진 바가 거의 없다. 이에 본 발명자들은 자연친화적이며 인체나 자연 생태계에 무해한 항적조제를 개발하기 위해 연구하던 중, 수용성 유리 아민 키토산이 우수한 항적조 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 적조유발 조류에만 선택적으로 작용하므로 해양생태계에 안전한 항적조제로 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 적조유발 조류에 항적조 활성을 갖는 수용성 유리 아민 키토산을 제공하는 데 있다.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항적조제를 제공하는 데 있다.
나아가, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항적조제를 적조 발생 수역에 살포하여 적조를 제거하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 적조유발 조류에 항적조 활성을 갖는 분자량이 20,000 내지 100,000 달톤인 수용성 유리 아민 키토산을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항적조제를 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항적조제를 적조 발생 수역에 살포하여 적조를 제거하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 적조유발 조류의 세포막에 작용 하여 세포막의 파괴를 유도함으로써 우수한 항적조 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 적조유발 조류에만 선택적으로 작용하므로 해양생태계에 안전한 항적조제로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 적조유발 조류에 항적조 활성을 갖는 키토산을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 항적조 활성을 갖는 키토산은 수용성 유리 아민 키토산으로서 본 발명자들에 의해 출원되어 등록된 대한민국등록특허 제10-0441270호에 기재된 방법에 의해 제조되는 수용성 유리 아민 키토산을 사용하는 것이 바람직하며, 이때 상기 수용성 유리 아민 키토산의 분자량은 20,000 내지 100,000 달톤인 것이 바람직하다.
상기 수용성 유리 아민 키토산은 샤토넬라 에스피(Chattonella sp .), 프로로센트럼 미니멈(Prorocentrum minimum), 프로로센트럼 미칸스(Prorocentrum micans ), 헤테로시그마 아카시오(Hetrosigma akashiwo), 코클리디움 폴리크리코이더스(Cochlodinium polykrikoides), 샤토넬라 마리나(Chatonella marina ) 등의 적조유발 해조류에 항적조 활성을 나타낼 수 있다.
상기 수용성 유리 아민 키토산은 본 발명자들에 의해 출원되어 등록된 대한민국등록특허 제10-0441270호에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 보다 구체적으로, 1)키토산 올리고당의 유기산 또는 무기산 염의 용액을 염기인 트리알킬 아민으로 처리하고, 2)상기 용액에 유기용매를 첨가하여 키토산 올리고당에 결합되어 있는 유기산 또는 무기산이 트리알킬 아민 염의 형태로 제거된 키토산 올리고당을 회수하고, 3)상기에서 산이 제거된 키토산 올리고당 용액을 무기산 처리 후, 활성화된 탄소/이온교환수지(activated carbon/ion exchange resin) 컬럼으로 정제하여 순수한 수용성 유리 아민 키토산을 제조할 수 있다. 상기의 방법을 수행하여 제조되는 순수한 수용성 유리 아민 키토산은 물에 대한 용해도가 높을 뿐만 아니라, 1,000 내지 100,000 달톤의 분자량을 가짐으로써 생리활성을 띤다.
본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 항적조 활성을 나타냄으로써 자연친화적인 항적조제로 사용될 수 있다. 이를 구체적인 실험결과를 근거로 설명한다.
먼저, 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 수용성 유리 아민 키토산의 항적조 활성 측정 실험에서 적조유발 해조류의 생육 저해농도가 0.25 ㎎/㎖ 이하를 나타내며, 100% 생육 저해농도가 0.5 ㎎/㎖ 이하를 나타냄으로써 우수한 항적조 활성을 나타내는 것을 알 수 있다(실시예 1, 표 1 및 도 1 참조).
또한, 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 적조유발 조류의 선택적 사멸 정도 측정 실험에서 무해 해조류인 스케렉토네마 코스타툼(Skeletonema costatum)의 세포 밀도에는 거의 영향을 미치지 않으나, 적조유발 해조류의 세포 밀도를 거의 0으로 감소시켜 사멸시킴으로써 적조유발 해조류에만 선택적으로 작용하여 사멸시키는 것을 알 수 있다(실시예 2, 도 2 및 도 3 참조).
또한, 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 적조유발 조류에서의 작용부위 분석 실험에서 적조유발 해조류의 세포막에 작용하여 세포막의 파괴를 유도함으로써 항적조 활성을 나타내는 것을 알 수 있다(실시예 3, 도 4 및 도 5 참조).
따라서, 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 적조유발 조류의 세포막에 작용하여 세포막의 파괴를 유도함으로써 우수한 항적조 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 적조유발 조류에만 선택적으로 작용하므로 해양생태계에 안전한 항적조제로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 적조유발 조류에 항적조 활성을 갖는 분자량이 20,000 내지 100,000 달톤인 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항적조제를 제공한다.
나아가, 적조유발 조류에 항적조 활성을 갖는 분자량이 20,000 내지 100,000 달톤인 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항적조제를 적조 발생 수역에 살포하여 적조를 제거하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 제조예 1> 분자량이 20,000 달톤인 수용성 유리 아민 키토산의 제조
젖산을 용매로 하여 5% 키토산 용액을 제조하였다. 상기 5 % 키토산 용액(pH 5.0-5.5) 100 ㎖에 5 유니트의 바실러스 푸밀러스(Bacilllus pumilus) BN-262에서 유래된 키토사네이즈(chitosanase) 효소를 혼합하여 40 ℃에서 36시간 동안 반응시켰다. 반응종료 후, 1 ㎛ 전처리필터(prefilter)를 사용하여 예비 여과한 후, 분자량 20,000인 중공사 여과지(hollow filter)로 재여과하였다. 상기 단계에서 얻은 여과액을 나노 여과 시스템(nano filter system)을 이용하여 농축하고, 살균과정을 거쳐 공기 분무 건조기(spray dryer)로 건조함으로써 키토산 올리고당을 제조하였다.
상기에서 얻어진 키토산 올리고당을 1 ℓ의 PBS 7.0에 용해한 후 0.52 ℓ의 트리에틸 아민을 천천히 떨어뜨렸다. 이때, 키토산 올리고당의 아민기 1 당량에 대해 트리에틸 아민 2 당량으로 반응시켰다. 상기의 반응물을 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 아세톤을 첨가하여 교반하고 원심분리하였다. 상기 과정을 2 내지 3 회 반복한 후 공기 건조 및 동결 건조하였다. 이때, 원심분리는 Supra 30 K를 이용하여 15,000 rpm으로 4 ℃에서 20분 동안 실시하였다.
상기 과정에서 얻어진 생성물에 30 내지 50 ㎖의 0.001 N 염산을 첨가한 후 2시간 동안 반응시키고, 상기 반응물에 아세톤을 첨가하여 교반하고 상기와 동일한 조건으로 원심분리하였다. 이러한 과정을 2 내지 3 회 반복한 후 공기 건조 및 동결 건조하였다. 상기에서 건조된 생성물을 2차 증류수에 녹인 후, 활성화된 탄소/이온교환 수지 컬럼으로 정제하고 얻어진 수용액을 동결 건조하여 분자량이 20,000 달톤인 백색의 유리 아민 키토산을 얻었다.
< 제조예 2> 분자량이 100,000인 수용성 유리 아민 키토산의 제조
젖산을 용매로 하여 5% 키토산 용액을 제조하였다. 상기 5 % 키토산 용액(pH 5.0-5.5) 100 ㎖에 5 유니트의 바실러스 푸밀러스(Bacilllus pumilus) BN-262에서 유래된 키토사네이즈(chitosanase) 효소를 혼합하여 40 ℃에서 36시간 동안 반응시켰다. 반응종료 후, 1 ㎛ 전처리필터(prefilter)를 사용하여 예비 여과한 후, 분자량 100,000인 중공사 여과지(hollow filter)로 재여과하였다. 상기 단계에서 얻은 여과액을 나노 여과 시스템(nano filter system)을 이용하여 농축하고, 살균과정을 거쳐 공기 분무 건조기(spray dryer)로 건조함으로써 키토산 올리고당을 제조하였다.
상기에서 얻어진 키토산 올리고당을 1 ℓ의 PBS 7.0에 용해한 후 0.52 ℓ의 트리에틸 아민을 천천히 떨어뜨렸다. 이때, 키토산 올리고당의 아민기 1 당량에 대 해 트리에틸 아민 2 당량으로 반응시켰다. 상기의 반응물을 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 아세톤을 첨가하여 교반하고 원심분리하였다. 상기 과정을 2 내지 3 회 반복한 후 공기 건조 및 동결 건조하였다. 이때, 원심분리는 Supra 30 K를 이용하여 15,000 rpm으로 4 ℃에서 20분 동안 실시하였다.
상기 과정에서 얻어진 생성물에 30 내지 50 ㎖의 0.001 N 염산을 첨가한 후 2시간 동안 반응시키고, 상기 반응물에 아세톤을 첨가하여 교반하고 상기와 동일한 조건으로 원심분리하였다. 이러한 과정을 2 내지 3 회 반복한 후 공기 건조 및 동결 건조하였다. 상기에서 건조된 생성물을 2차 증류수에 녹인 후, 활성화된 탄소/이온교환 수지 컬럼으로 정제하고 얻어진 수용액을 동결 건조하여 분자량이 100,000 달톤인 백색의 유리 아민 키토산을 얻었다.
< 실시예 1> 수용성 유리 아민 키토산의 항적조 활성 측정
본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산의 항적조 활성을 측정하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.
<1-1> 적조 생물에 대한 생육 저해농도
본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산의 항적조 활성을 적조 생물에 대한 생육 저해농도 분석을 통해 측정하였다.
항적조 활성을 측정하기 위한 적조유발 조류로 한국해양미세조류은행에서 분양받은 샤토넬라 에스피(Chattonella sp .), 프로로센트럼 미니멈(Prorocentrum minimum), 프로로센트럼 미칸스(Prorocentrum micans)와 헤테로시그마 아카시 오(Hetrosigma akashiwo)를 사용하였다. 또한 남해근해에서 직접 분리한 코클리디움 폴리크리코이더스(Cochlodinium polykrikoides ), 샤토넬라 마리나(Chatonella marina)를 이용하였으며, 무해한 해조류인 스케렉토네마 코스타툼(Skletonema costatum)을 사용하였다. 상기 각 조류를 F2 배지(150 ㎎ NaNO3, 8.69 ㎎ NaH2PO4·9H2O, 10 ㎎ ferric EDTA, 0.22 ㎎ MnCl2, 0.11 ㎎ CoCl2, 0.0196 ㎎ CuSO4·5H2O, ZnSO4·7H2O, 50 ㎎ Na2SiO3·9H2O, 0.012 ㎎ Na2MoO4·2H2O, 1 ㎍ 비타민 B12, 1 ㎍ 비오틴, 0.2 ㎍ 티아민·염산 / 1L 필터된 해수)에서 배양조건 온도 22 ℃, 염분 34 ‰, 조도 3,000 럭스(lux)에서 14 시간/10시간 명암 주기로 일정하게 두고 배양하였다. 전배양된 적조 생물 세포를 세포 수 104/㎖의 농도로 희석하여 24 웰(well) 마이크로 타이트레이트 플레이트에 접종하였다. 상기 제조예 1 및 제조예 2의 수용성 유리 아민 키토산을 6.25(㎎/㎖)/웰(well) 농도로부터 시작하여 1/2배씩 희석하여 상기 균주가 접종된 플레이트에 첨가하였다. 또한, 수용성 유리 아민 키토산을 함유하지 않는 F2 배지를 수용성 유리 아민 키토산 대신 첨가하여 대조군으로 사용하였다. 상기 배양조건에서 2일 동안 배양하면서 6시간마다 적조생물 수를 헤모사이토메터(hemocytometer)를 이용하여 측정하여, 50% 생육 저해농도(50% of inhibitory concentration, 이하 ‘IC50’라 약칭함) 와 100% 생육 저해농도(100% of inhibitory concentration, 이하 ‘IC100’라 약칭함)값을 결정하였고, 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

해조류
 생육 저해농도(㎎/㎖)
제조예 1 제조예 2
IC50 IC100 IC50 IC100
헤테로시그마 아카시오 0.25 0.5 0.25 0.5
샤토넬라 에스피 0.125 0.25 0.125 0.25
샤토넬라 마리나 0.063 0.125 0.063 0.125
코클리디움 폴리크리코이더스 0.125 0.25 0.25 0.5
프로로센트럼 미니멈 0.25 0.5 0.25 0.5
프로로센트럼 미칸스 0.25 0.5 0.25 0.5
스케렉토네마 코스타툼 >8 >8 >8 >8
상기 표 1을 참조하면, 적조유발 조류인 헤테로시그마 아카시오, 샤토넬라 에스피, 샤토넬라 마리나, 코클리디움 폴리크리코이더스, 프로로센트럼 미니멈, 프로로센트럼 미칸스의 50% 생육 저해농도가 0.25 ㎎/㎖ 이하이고, 100% 생육 저해농도가 0.5 ㎎/㎖ 이하를 나타냄으로써, 제조예 1과 제조예 2는 적조유발 조류의 생육을 효과적으로 저해하는 것을 알 수 있다. 반면, 무해한 해조류인 스케렉토네마 코스타툼의 생육 저해농도가 8 ㎎/㎖ 이상을 나타냄으로써, 제조예 1과 제조예 2는 무해한 해조류인 스케렉토네마 코스타툼의 생육을 저해시키지 않은 것을 알 수 있다.
이를 통해 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 적조유발 조류의 생육을 효과적으로 저해함으로써, 우수한 항적조 활성을 나타내는 것을 알 수 있다.
<1-2> 항적조 활성의 가시화
본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산의 항적조 활성을 광학 현미경 분석을 통해 가시화하였다.
상기 실시예 1-1에서 사용한 적조유발 해조류를 F2 배지(150 ㎎ NaNO3, 8.69 ㎎ NaH2PO4·9H2O, 10 ㎎ ferric EDTA, 0.22 ㎎ MnCl2, 0.11 ㎎ CoCl2, 0.0196 ㎎ CuSO4·5H2O, ZnSO4·7H2O, 50 ㎎ Na2SiO3·9H2O, 0.012 ㎎ Na2MoO4·2H2O, 1 ㎍ 비타민 B12, 1 ㎍ 비오틴, 0.2 ㎍ 티아민·염산 / 1L 필터된 해수)에 접종한 뒤 배양하였다. 배양된 적조생물을 104/㎖의 농도로 24 웰 마이크로 타이트레이트 플레이트에 접종한 뒤 상기 제조예 1과 제조예 2를 웰(well)당 0.5 ㎎/㎖의 농도로 상기 적조생물이 접종된 플레이트에 첨가하여 20 ℃에서 2시간 동안 배양하였다. 또한, 수용성 유리 아민 키토산을 함유하지 않는 F2 배지를 수용성 유리 아민 키토산 대신 첨가하여 대조군으로 사용하였다. 배양 후, 가시화하기 위하여 광학 현미경상에서 관찰하였고, 광학 현미경 이미지를 도 1에 나타내었다. 보다 상세하게는 적조유발 조류인 헤테로시그마 아카시오의 광학 현미경 이미지를 도 1의 (a)에 나타내었고, 샤토넬라 에스피의 광학 현미경 이미지를 도 1의 (b)에 나타내었고, 코클리디움 폴리크리코이더스의 광학 현미경 이미지를 도 1의 (c)에 나타내었고, 프로로센트럼 미니멈의 광학 현미경 이미지를 도 1의 (d)에 나타내었고, 무해한 해조류인 스케렉토네마 코스타툼에 대한 광학 현미경 이미지를 도 1의 (e)에 나타내었다.
도 1의 (a), (b), (c) 및 (d)에서 알 수 있는 바와 같이, 적조유발 조류에 아무런 처리를 하지 않은 대조군의 경우에는 생물의 수가 유지되고 외형적인 변화가 없으나, 본 발명에 따른 제조예 1, 제조예 2를 처리한 경우에는 생물체 내의 물질이나 소기관들이 세포내로 유출되고 세포벽과 막이 파괴되는 것을 알 수 있다. 또한, 도 1의 (e)에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 제조예 1 및 제조예 는 무해한 해조류인 스케렉토네마 코스타툼의 생장에는 아무런 영향을 주지 않는 것을 알 수 있다.
이를 통해 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 적조유발 조류의 생육을 효과적으로 저해함으로써, 우수한 항적조 활성을 나타내는 것을 알 수 있다.
< 실시예 2> 수용성 유리 아민 키토산의 적조유발 조류의 선택적 사멸 정도 측정
본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산의 적조유발 조류의 선택적 사멸 정도를 측정하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.
적조유발 조류인 샤토넬라 에스피, 프로로센트럼 미니멈, 헤테로시그마 아카시오와 무해 해조류인 스케렉토네마 코스타툼의 공동 배양에서 적조유발 조류의 선택적 생장 저해 정도를 알아보기 위해, 샤토넬라 에스피와 스케렉토네마 코스타툼, 프로로센트럼 미니멈과 스케렉토네마 코스타툼, 헤테로시그마 아카시오와 스케렉토네마 코스타툼의 실험군으로 나누었다. 1 ㎎/㎖의 상기 제조예 1과 제조예 2를 24 웰(well) 마이크로 타이트레이트 플레이트에 첨가한 후 각각의 실험군의 적조유발 조류의 세포를 세포수 2×104/㎖의 농도로 희석하여 24 웰(well) 마이크로 타이트레이트 플레이트에 접종하였으며, 대조군으로는 상기 제조예 1과 제조예 2를 모두 처리하지 않았다. 상기 실시예 1과 동일한 배양조건에서 2일 동안 배양하면서 6시간마다 적조유발 조류의 세포 수를 헤모사이토메터(hemocytometer)를 이용하여 측정하였고, 결과를 도 2에 나타내었다. 또한, 광학 현미경 이미지를 도 3에 나타내었다. 보다 상세하게는 헤테로시그마 아카시오와 스케렉토네마 코스타툼의 세포 밀도를 도 2의 (a)에 나타내었고, 프로로센트럼 미니멈과 스케렉토네마 코스타툼의 세포 밀도를 도 2의 (b)에 나타내었고, 샤토넬라 에스피와 스케렉토네마 코스타툼의 광학 현미경 이미지를 도 3에 나타내었다.
도 2의 (a)에서 알 수 있는 바와 같이, 아무런 처리를 하지 않은 스케렉토네마 코스타툼과 헤테로시그마 아카시오는 서로 공존하여 잘 생육하나, 제조예 1 또는 제조예 2를 처리한 경우에는 무해 해조류인 스케렉토네마 코스타툼의 세포 밀도는 약간 감소하며, 적조유발 조류인 헤테로시그마 아카시오는 30분 후에 완전히 사멸하는 것을 알 수 있다. 또한, 도 2의 (b)에서 알 수 있는 바와 같이, 아무런 처리를 하지 않은 스케렉토네마 코스타툼과 프로로센트럼 미니멈은 서로 공존하여 잘 생육하나, 제조예 1 또는 제조예 2를 처리한 경우에는 무해 해조류인 스케렉토네마 코스타툼의 세포 밀도는 약간 감소하며, 적조유발 조류인 프로로센트럼 미니멈은 6시간 후에 거의 사멸하는 것을 알 수 있다.
또한, 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 아무런 처리를 하지 않은 스케렉토네마 코스타툼과 샤토넬라 에스피는 서로 공존하여 잘 생육하나, 제조예 1 또는 제조예 2를 처리한 경우에는 무해 해조류인 스케렉토네마 코스타툼의 세포는 약간 감소하며, 적조유발 조류인 프로로센트럼 미니멈의 세포는 거의 사멸하는 것을 알 수 있다.
이를 통해 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 적조유발 해조류에만 선택적으로 작용하여 사멸시키는 것을 알 수 있다.
< 실시예 3> 수용성 유리 아민 키토산의 적조유발 조류에서의 작용부위 분석
본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산의 적조유발 조류에서의 작용부위를 알아보기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.
10 ㎎의 제조예 1과 제조예 2의 분말을 각각 50 mM 붕산나트륨 버퍼(pH 8.5)에 녹인 후에 형광물질인 테트라메틸로다민(Trtramethylrhodamine, TAMRA)을 섞고 실온에서 12시간 동안 반응시켰다. 이후, 세파덱스 G-25를 가지고 표식되어진 제조예 1 및 제조예 2를 분리하였고, 분리된 제조예 1 및 제조예 2를 동결 건조하여 함량을 계산하였다. 상기 실시예 1에서 언급한 방법에 의하여 테트라메틸로다민이 표시된 제조예 1 및 제조예 2의 수용성 유리 아민 키토산 0.12 ㎎/㎖을 처리한 뒤 2분 후에 각 샘플을 F2 배지를 가지고 3번 씻어 주었다. 그리고 바로 공초점 레이저 주사현미경(Confocal Laser Scanning Microscope)하에서 형광을 관찰하였고, 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.
보다 상세하게는 제조예 1을 처리한 헤테로시그마 아카시오의 공초점 레이저 주사현미경 이미지를 도 4의 (a)에 나타내었고, 프로로센트럼 미니멈의 공초점 레이저 주사현미경 이미지를 도 4의 (b)에 나타내었다. 또한, 제조예 2를 처리한 헤테로시그마 아카시오의 공초점 레이저 주사현미경을 이용한 다초점 연속 이미지를 도 5의 (a)에 나타내었고, 프로로센트럼 미니멈의 공초점 레이저 주사현미경을 이용한 다초점 연속 이미지를 도 5의 (b)에 나타내었다.
도 4 및 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 세포막 주위에 붉은 형광이 군집되어 있는 것을 알 수 있다.
이를 통해 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 적조유발 조류의 세포막에 작용하여 세포막의 파괴를 유도함으로써 항적조 활성을 나타내는 것을 알 수 있다.
그러므로 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 적조유발 조류의 세포막에 작용하여 세포막의 파괴를 유도함으로써 우수한 항적조 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 적조유발 조류적조유발 조류로 작용하므로 해양생태계에 안전한 항적조제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산의 항적조 활성을 알아보기 위한 수용성 유리 아민 키토산을 처리한 조류의 광학 현미경 이미지이고((a)적조유발 조류인 헤테로시그마 아카시오, (b)적조유발 조류인 샤토넬라 에스피, (c)적조유발 조류인 코클리디움 폴리크리코이더스, (d)적조유발 조류인 프로로센트럼 미니멈, (e)무해한 해조류인 스케렉토네마 코스타툼);
도 2는 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산의 적조유발 조류의 선택적 사멸 정도를 측정하기 위한 수용성 유리 아민 키토산을 처리한 조류의 세포 밀도 변화를 나타낸 그래프이고((a)스케렉토네마 코스타툼과 헤테로시그마 아카시오, (b)스케렉토네마 코스타툼과 프로로센트럼 미니멈);
도 3은 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산의 적조유발 조류의 선택적 사멸 정도를 측정하기 위한 수용성 유리 아민 키토산을 처리한 스케렉토네마 코스타툼과 샤토넬라 에스피의 광학 현미경 이미지이고;
도 4는 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산의 적조유발 조류에서의 작용부위를 분석하기 위한 테트라메틸로다민으로 표식된 수용성 유리 아민 키토산을 처리한 적조유발 조류의 공초점 레이저 주사현미경 이미지이고((a)헤테로시그마 아카시오, (b)프로로센트럼 미니멈);
도 5는 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산의 적조유발 조류에서의 작용부위를 분석하기 위한 테트라메틸로다민으로 표식된 수용성 유리 아민 키토산을 처리한 적조유발 조류의 공초점 레이저 주사현미경을 이용하여 다초점 연속 촬영한 이미지((a)헤테로시그마 아카시오, (b)프로로센트럼 미니멈)이다.

Claims (4)

  1. 적조유발 조류에 항적조 활성을 갖는 분자량이 20,000 내지 100,000 달톤인 수용성 유리 아민 키토산.
  2. 제1항에 있어서, 상기 수용성 유리 아민 키토산은 샤토넬라 에스피(Chattonella sp .), 프로로센트럼 미니멈(Prorocentrum minimum), 프로로센트럼 미칸스(Prorocentrum micans ), 헤테로시그마 아카시오(Hetrosigma akashiwo), 코클리디움 폴리크리코이더스(Cochlodinium polykrikoides ) 및 샤토넬라 마리나(Chatonella marina )로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 적조유발 해조류에 대하여 항적조 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 수용성 유리 아민 키토산.
  3. 적조유발 조류에 항적조 활성을 갖는 분자량이 20,000 내지 100,000 달톤인 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항적조제.
  4. 적조유발 조류에 항적조 활성을 갖는 분자량이 20,000 내지 100,000 달톤인 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항적조제를 적조 발생 수역에 살포하여 적조를 제거하는 방법.
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