KR101746667B1 - 항조류 활성을 가지는 키메라 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 적조 방제용 조성물 - Google Patents
항조류 활성을 가지는 키메라 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 적조 방제용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 항조류 활성을 가지는 키메라 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 적조 방제용 조성물에 관한 것으로, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Hn-Mc 펩타이드, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 Hn-Mc-Del 펩타이드, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 Hn-Mc-DRW 펩타이드, 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 Hn-Mc-DWR 펩타이드는 적조유발 미세조류의 운동성과 생육을 저해하고, 셀룰로오스 세포벽이 없는 적조유발 미세조류의 세포막에 결합하여 세포막, 세포내 소기관의 막을 파괴하거나 광합성을 저해함으로써 적조유발 미세조류의 사멸을 유도할 뿐만 아니라 어패류에 대해 세포독성을 나타내지 않으므로, 해양 생태계에 안전한 적조 방제용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 항조류 활성을 가지는 키메라 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 적조 방제용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 일반적인 아미노산 잔기 15~17개만을 사용하여 경제적인 대량생산이 가능하면서도 적조를 유발하는 미세조류의 운동성과 생육을 저해하고, 어패류에 대해서는 독성이 없는 키메라 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 적조 방제용 조성물에 관한 것이다.
적조(red tide)는 부유생활을 하는 생물(예, 플랑크톤)이 번식하기에 알맞은 환경을 만나 대량 번식하여 해수의 색깔이 붉게 또는 녹·갈색으로 변하는 현상을 말한다.
이러한 적조로 인한 피해는 크게 두 가지로 나눌 수 있는데, 첫째는 어패류의 대량폐사나 인명피해이고, 또 하나는 관광산업의 피해이다. 구체적으로 살펴보면, 어패류들이 먹이를 잡기 위하여 물을 빨아들이는 과정에서 부유생활을 하는 생물을 먹게 되고, 부유생물의 독소에 의해 어패류가 죽게 된다. 그리고 부유생물이 대량으로 번식하는 경우 질소, 인 등의 영양염류가 부족하여 일시적으로 부유생물이 죽어 해저에 가라앉게 되며, 이를 분해하기 위해 세균들이 바닷물에 용존된 산소를 모두 소비함으로써 운동성이 크게 떨어지는 어패류들은 산소 부족으로 질식하여 죽게 된다. 또한, 적조는 주로 수온이 높고 바람이 세지 않은 늦봄과 여름에 자주 발생하는데, 이 시기는 많은 관광객들이 해변을 찾는 시기로 관광객들이 수영할 때 유독성 적조생물이 들어 있는 물을 마시고 죽거나 마비가 될 수 있다. 이에 미국과 스페인, 이탈리아 등 많은 유럽 국가들은 이 시기에 해수욕장을 폐쇄하고 있어 관광수입에 막대한 피해를 겪고 있다. 우리나라의 경우 남해안의 넓은 해역에서 발생하며 남해안에서 일어나던 적조가 동해, 서해안에서도 발생하고 있다. 특히 서해안의 경우 1993년부터 천수만에서, 1995년부터는 전북연안에서 적조가 해마다 반복적으로 발생하고 있는데 1998년부터는 유해성 적조가 대규모로 발생하고 있다.
이러한 적조를 유발하는 생물의 종류는 전 세계적으로 200종이 넘고, 우리나라 연안에서 나타나는 적조유발 생물은 40종 여종으로 알려져 있다. 구체적으로, 코클로디니움 폴리크리코이데스 종(Cochlodinium polykrikoides sp.)은 푸에르토 리코(Puert) 연안에서 처음 발견되었으며, 이후 북미 대서양 연안의 뉴저지주 바메가트(Bamegat)만과 미국 캘리포티아 연안에서 적조를 유발한 코클로디니움 헤테로로바튬(Cochlodinium heterolobatum)과 같은 종으로 간주되고 있다(Margalef, 1961; Silva, 1967). 이 종은 일본의 하리마 나다(Harima Nada)와 구주의 야츠시로(Yatsushiro)만에서 적조를 일으켜 수산피해를 일으킨 이래, 일본 중부와 서부 연안에서도 적조를 일으켰다고 보고되었다(Yuki and Yoshimatsu, 1989; Fukuyo et al., 1990). 또한, 코클로디니움 폴리크리코이데스 종(Cochlodinium polykrikoides sp.)은 최근 캐나다, 멕시코의 캘리포니아만(Gulf of California), 및 중남미의 구아테말라(Guatemala)의 태평양 연안에서도 적조를 일으킨다고 보고되었다(Whyte et al.,2000; Carate Lizarraga et al., 2000). 와편모조류에 속하는 프로로센트럼 미니멈(Prorocentrum minimum) 및 프로로센트롬 미켄스(Prorocentrum micans)와 침편모조강에 속하는 헤테로시그마 아카쉬우(Heterosigma akashowi), 샤또넬라 종(Chattonella sp.) 및 샤또넬라 마니라(Chattonella marina) 역시 적조를 유발한다고 알려져 있다. 샤또넬라 종(Chattonella sp.)의 경우 적조생물밀도가 50 이상일 때, 반경 2~5Km 수역에 걸쳐 발생하고 어업피해가 우려되어 적조주의보가 발령되며, 부유생물의 밀도가 100 이상일 때에는 반경 5Km 이상 수역에 발생하여 상당한 어업피해가 예상되어 적조경보가 발령된다.
이에 당업계에서는 적조를 예방하거나 적조로 인한 피해를 줄이기 위한 여러 가지 방법들이 연구되었다. 구체적으로, 화학약품을 뿌리거나 초음파 분쇄기, 오존 발생기, 원심분리기를 사용하여 적조생물을 없애거나 점토를 이용하여 적조유발 생물을 흡착시켜 바닥으로 침전시키는 화학적·물리적인 방법이 개발되어 사용되고 있다. 그러나 상기 방법들은 생태계에 또 다른 악영향을 미칠 수 있으며, 광범위한 적조 발생해역에서 이용되기에는 많은 문제점이 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해 생태계 내에서 피식자-포식자 관계를 이용해 원하지 않는 생물을 제거하는 생물학적 방법이 연구 및 개발되었으나, 이 방법은 생태계의 먹이 사슬을 변화시켜 또 다른 문제점을 야기 할 수 있다. 또한, 해양 박테리아가 분비하는 물질을 사용하여 적조를 유발하는 생물을 죽이는 방법도 활발히 연구되고 있으며, 최근에는 단백질 합성 저해제, 세포벽 저해제 및 세포막에 작용을 하는 항생제들을 사용하거나, 상기 항생제들을 모델로 하여 인위적으로 저분자 물질들을 유기 합성하여 적조유발 생물을 방제하려는 시도가 이루어지고 있다. 그러나, 상기 항생제들은 바다에서 분해가 되지 않고 축적되어 결국 농업부분에서 사용되는 농약에 의해 야기되는 문제점들처럼 해양생태계나 바다에서 생산되는 먹거리들을 통해 인체에까지 축적될 수 있다.
이러한 문제점들을 고려해 볼 때 자연분해가 가능하며 인체나 자연 생태계에 무해한 적조 방지제로써 사용되어질 수 있는 것이 펩타이드나 단백질제제이다. 이들은 유전자 조작을 통하여 대량 발현하여 생산단가를 줄일 수 있을 뿐만 아니라 적조생물에 특이하게 부착하는 박테리아나 바이러스의 표면에 펩타이드를 발현하여 항적조 활성을 나타나게 할 수 있다.
이와 관련하여, 벌독으로부터 정제된 양친매성 알파 나선구조를 가지는 항균 펩타이드인 메스토파란 비(Mastoparan B)가 적조생물인 알렉산드리움 타마렌스(Alexandrium tamarense)와 샤토넬라 카테나튬(Chattonella catenatum)에 대해 살조효과를 확인된 바 있다. 그러나 이 펩타이드는 낮은 농도에서 세포독성이 높게 나타나는 것으로 보고되어 있다.
이에 본 발명자들은 세포독성이 낮고, 우수한 항조류 활성을 나타내는 키메라 펩타이드에 대한 연구를 계속 진행하던 중, 일반적인 아미노산 잔기 15~17개만을 사용하여 경제적인 대량생산이 가능하면서도 적조유발 미세조류의 운동성과 생육을 저해하고, 어패류에 대해서는 독성이 없는 키메라 펩타이드(Hn-Mc, Hn-Mc-Del, Hn-Mc-DRW, 또는 Hn-Mc-DWR)를 개발하였으며, 상기 키메라 펩타이드는 세포독성에 대해 안정성을 가지고 있으면서, 적조를 유발하는 미세조류의 생장을 억제하거나 사멸시킴으로 우수한 적조 방제용 조성물로 사용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 하나의 목적은 세포독성이 없고, 적조유발 미세조류에 대해 우수한 항조류 활성을 나타내는 키메라 펩타이드를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 키메라 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 적조 방제용 조성물을 제공하는데 있다.
하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진, 항조류 활성을 나타내는 키메라 펩타이드를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "항조류"는 적조 현상을 일으키는 미세조류의 생육 또는 운동성을 저해하거나, 미세조류를 사멸시키는 등 미세조류의 증식을 저해하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 키메라 펩타이드는 본 발명자들에 의해 고안되어 특허출원(출원번호 10-2015-0032977)된 것으로, HPA3NT3 펩타이드의 아미노 말단 부위(1-7)와 멜리틴(melittin)의 카르복실 말단 부위(17-26)가 접합되어 이루어진 양친화성 펩타이드이다.
본 발명에서는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 키메라 펩타이드를 "Hn-Mc 펩타이드"로 명명한다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 키메라 펩타이드는 상기 Hn-Mc 펩타이드의 16번째와 17번째의 글루타민(Glutamine, Q)을 결실시켜 이루어진 것이다.
본 발명에서는 상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 키메라 펩타이드를 "Hn-Mc-Del 펩타이드"로 명명한다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 키메라 펩타이드는 상기 Hn-Mc-Del 펩타이드의 9번째 아미노산인 세린(serine, S)을 아르기닌(arginine, R)으로, 15번째 아미노산인 아르기닌(arginine, R)을 트립토판(tryptophan, W)으로 치환하여 이루어진 것이다.
본 발명에서는 상기 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 키메라 펩타이드를 "Hn-Mc-DRW 펩타이드"로 명명한다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 키메라 펩타이드는 상기 Hn-Mc-Del 펩타이드의 1번째 아미노산인 페닐알라닌(Phenylalanine, F)을 트립토판(tryptophan, W)으로, 9번째 아미노산인 세린(serine, S)을 아르기닌(arginine, R)으로 치환하여 이루어진 것이다.
본 발명에서는 상기 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 키메라 펩타이드를 "Hn-Mc-DWR 펩타이드"로 명명한다.
하나의 구체적 실시양태에 따르면, 본 발명의 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 키메라 펩타이드는 어패류에 대해 세포독성을 나타내지 않으면서 적조유발 미세조류의 생육과 운동성을 저해함이 확인되었다.
특히, 본 발명의 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 키메라 펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 2, 또는 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열을 갖는 키메라 펩타이드에 비해 4 내지 16배 낮은 농도를 사용하더라도 적조유발 미세조류의 운동성과 생육을 저해하고, 셀룰로오스 세포벽이 없는 적조유발 미세조류의 세포막에 결합하여 세포막, 세포내 소기관의 막을 파괴하거나 적조유발 미세조류의 광합성을 저해함으로써 미세조류의 사멸을 유도함이 확인되었다.
이때, 상기 적조유발 미세조류는 알렉산드리움 카타넬라(Alexandrium catanella), 알렉산드리움 타마렌스(Alexandrium tamarense), 샤토넬라 마리나(Chattonella marina), 샤토넬라 에스피(Chattonellar sp.), 코클로디니움 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides), 지로디니움 임퓨디컴(Gyrodinium impudicum), 헤테로시그마 아카시우(Hetrosigma akashiwo), 헤테로시그마 에스피(Heterosigma sp.) 프로로센트롬 미칸스(Prorosentrum micans) 및 프로로센트롬 미니멈(Prorocentrum minimum)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미세조류일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
따라서, 본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 키메라 펩타이드는 적조를 방제하기 위한 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 키메라 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 적조 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 적조 방제용 조성물은 유효성분으로써 항조류 활성을 갖는 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 키메라 펩타이드와 함께 항조류 활성을 나타내는 임의의 성분을 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 적조 방제용 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 키메라 펩타이드를 물이나 유기용매와 혼합하여 사용할 수 있고, 효과의 안정성 및 약물의 표적 생물과의 부착 증진을 위해 비-이온성 또는 이온성 계면활성제를 함께 사용할 수 있다. 또한, 흡착제, 협력제, 분산제, 결합제, 유동조제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 적조 방제용 조성물은 적조유발 미세조류를 방제하기 위하여 통상의 방법으로 해수에 처리될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 적조 방제용 조성물을 적절한 농도로 해양에 1회 내지 수회 살포할 수 있다. 투여 횟수, 투여 간격, 투여 농도 등은 적조유발 미세조류의 증식 정도 및 기후 등의 환경적 조건에 따라 조절될 수 있다.
본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Hn-Mc 펩타이드, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 Hn-Mc-Del 펩타이드, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 Hn-Mc-DRW 펩타이드, 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 Hn-Mc-DWR 펩타이드는 적조유발 미세조류의 운동성과 생육을 저해하고, 셀룰로오스 세포벽이 없는 적조유발 미세조류의 세포막에 결합하여 세포막, 세포내 소기관의 막을 파괴하거나 광합성을 저해함으로써 적조유발 미세조류의 사멸을 유도할 뿐만 아니라 어패류에 대해 세포독성을 나타내지 않으므로, 해양 생태계에 안전한 적조 방제용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 Hn-Mc-DWR 펩타이드의 와편모 조류인 코클로디니움 폴리크리코이데스(C. polykrikoides)에 대한 항조류 활성을 보여주는 현미경사진이다;
도 2의 A는 본 발명의 Hn-Mc 펩타이드, Hn-Mc-Del 펩타이드, Hn-Mc-DRW 펩타이드, 또는 Hn-Mc-DWR 펩타이드의 돌돔 혈액에서의 적혈구 용혈활성을 보여주는 그래프이다.
도 2의 B는 본 발명의 Hn-Mc 펩타이드, Hn-Mc-Del 펩타이드, Hn-Mc-DRW 펩타이드, 또는 Hn-Mc-DWR 펩타이드의 어류세포(CHSE-214)에 대한 세포독성을 보여주는 그래프이다.
도 3의 A는 본 발명의 Hn-Mc-DWR 펩타이드의 헤테로시그마 아카시우(H. akashiwo)와 프로로센트럼 미니멈(P. minimum)에 대한 세포막 파괴능을 보여주는 그래프이다.
도 3의 B는 본 발명의 Hn-Mc-DWR 펩타이드에 의한 헤테로시그마 아카시우(H. akashiwo)와 프로로센트럼 미니멈(P. minimum) 내 클로로필 에이(chlorophyll a)의 함량이 시간당 변화하는 것을 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 Hn-Mc-DWR 펩타이드의 헤테로시그마 아카시우(H. akashiwo), 프로로센트럼 미니멈(P. minimum)와 샤또넬라 마니라(C. marina)를 처리한 가리비 조개에 대한 항조류 활성을 나타내는 사진이다.
도 2의 A는 본 발명의 Hn-Mc 펩타이드, Hn-Mc-Del 펩타이드, Hn-Mc-DRW 펩타이드, 또는 Hn-Mc-DWR 펩타이드의 돌돔 혈액에서의 적혈구 용혈활성을 보여주는 그래프이다.
도 2의 B는 본 발명의 Hn-Mc 펩타이드, Hn-Mc-Del 펩타이드, Hn-Mc-DRW 펩타이드, 또는 Hn-Mc-DWR 펩타이드의 어류세포(CHSE-214)에 대한 세포독성을 보여주는 그래프이다.
도 3의 A는 본 발명의 Hn-Mc-DWR 펩타이드의 헤테로시그마 아카시우(H. akashiwo)와 프로로센트럼 미니멈(P. minimum)에 대한 세포막 파괴능을 보여주는 그래프이다.
도 3의 B는 본 발명의 Hn-Mc-DWR 펩타이드에 의한 헤테로시그마 아카시우(H. akashiwo)와 프로로센트럼 미니멈(P. minimum) 내 클로로필 에이(chlorophyll a)의 함량이 시간당 변화하는 것을 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 Hn-Mc-DWR 펩타이드의 헤테로시그마 아카시우(H. akashiwo), 프로로센트럼 미니멈(P. minimum)와 샤또넬라 마니라(C. marina)를 처리한 가리비 조개에 대한 항조류 활성을 나타내는 사진이다.
이하, 실시예 등을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예 등은 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예 등에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> 항조류 활성을 갖는 펩타이드의 제조 및 분리정제
헬리코박터 파일로리 분비 펩타이드인 HP(2-20)의 유도체인 HPA3NT3의 아미노 말단 부위 중 양친화성과 양이온성을 가지는 HPA3NT3(1-7) 부분과 멜리틴(melittin)의 카르복실 말단 부위 중 양친화성과 양이온성을 가지는 멜리틴(17-26) 부분을 접합하여 친수성과 양이온성이 증가된 양친화성 알파 헬릭스(α-helix) 구조를 나타내며, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Hn-Mc 펩타이드를 제조하였다.
또한, 상기 Hn-Mc 펩타이드의 16번째와 17번째의 글루타민(Glutamine)을 결실시켜 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 Hn-Mc-Del 펩타이드를 제조하였다.
또한, 상기 Hn-Mc-Del의 9번째 세린(serine)을 아르기닌(arginine)으로 15번째 아르기닌(arginine)을 트립토판(tryptophan)으로 치환하여 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 Hn-Mc-DRW 펩타이드를 제조하였다.
또한, 상기 Hn-Mc-Del의 1번째 페닐알라닌(phenylalanine)을 트립토판(tryptophan)으로 9번째 세린(serine)을 아르기닌(arginine)으로 치환하여 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 Hn-Mc-DWR 펩타이드를 제조하였다.
상기 펩타이드들은 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)를 아미노기 보호 용기로 이용하는 메리필드(Merrifield)의 액상 고상법을 사용하여 합성하였다. 상기 펩타이드에서 카르복실말단이 -NH2 형태인 펩타이드는 링크 아미드 MBHA-레진(Rink Amide MBHA-Resin)을 출발물질로 사용하였으며, Fmoc-아미노산의 커플링(coupling)에 의한 펩타이드 체인(chain)의 연장은 N-하이드록시벤조-트리아졸-디사이클로-헥시카르보이미드법(N-hydroxybenzo triazole-dicyclo-hexycarbodiimide; HOBt-DCC)에 의하여 수행하였다.
구체적으로, 각 펩타이드 아미노 말단의 Fmoc-아미노산을 커플링시킨 후, 20% 피페리딘/디메틸 포마마이드(piperidine/Dimethyl formamide, 이하 'DMF'라 약칭함) 용액으로 Fmoc기를 제거하고 DMP 및 디클로로메탄(dichoromethane, DCM)으로 여러번 씻어준 다음 질소 가스로 건조시켰다. 건조된 레진에 트리플루오로아세틱산:페놀:티오아니졸:물:트리이소프로필실란[trifluoroacetic acid(TFA) : phenol : thioanisole : H2O : triisopropylsilane = 85: 5: 5: 2.5: 2.5(vol./vol.)] 용액을 가하고 4시간 동안 반응시켜 보호기를 제거한 다음, 레진으로부터 펩타이드를 분리시킨 다음, 차가운 디에틸 에테르(diethyl ether)로 30분 동안 반응시켰다. 그 후 상기 반응물을 원심분리기로 펩타이드를 침전시킨 다음 디에틸 에테르로 침전된 펩타이드를 한번 더 씻어준 뒤 침전시키고 공기 중에 건조하였다. 이렇게 하여 얻은 크루드(crude)한 형태의 펩타이드는 pH 8인 암모늄 바이카보네이트(ammonium bicarbonate)에 녹여 아세토니트릴을 그레디언트(gradient)로 하여 정제형 역상 HPLC 컬럼(reverse phase-HPLC column)(Delta Pak, C18 300Å, 19.0 mm × 30 cm, Waters)으로 정제하였다. 정제된 합성 펩타이드를 에드만 디그래데이션(Edman degradation)방법으로 아미노산 분석기(Hitachi 8500 A)로 아미노산의 조성을 측정하고, MALDI(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization) 질량 분석법을 이용하여 펩타이드의 분자량을 측정하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.
| 펩타이드(명명) | 서열 | 분자량 |
| 서열번호 1(Hn-Mc) | FKRLKKLISWIKRKRQQ-NH2 | 2068.67 |
| 서열번호 2(Hn-Mc-Del) | FKRLKKLISWIKRKR-NH2 | 1999.56 |
| 서열번호 3(Hn-Mc-DRW) | FKRLKKLIRWIKRKW-NH2 | 2098.69 |
| 서열번호 4(Hn-Mc-DWR) | WKRLKKLIRWIKRKR-NH2 | 2107.71 |
상기 표 1에서 보듯이, 본 발명에 따라 합성한 모든 펩타이드는 95% 이상의 순도를 나타내었고, 측정된 분자량이 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 분자량과 일치하였으며, 정확한 아미노산 서열로 이루어진 Hn-Mc 펩타이드(서열번호 1), Hn-Mc-Del 펩타이드(서열번호 2), Hn-Mc-DRW 펩타이드(서열번호 3), 및 Hn-Mc-DWR 펩타이드(서열번호 4)가 합성되었음을 확인할 수 있었다.
<실험예 1> 펩타이드의 항조류 활성 측정
<1-1> 본 발명에 따른 펩타이드의 적조유발 미세조류에 대한 90% 운동성 및 사멸농도 측정
상기 실시예 1에서 합성한 Hn-Mc 펩타이드, Hn-Mc-Del 펩타이드, Hn-Mc-DRW 펩타이드, 또는 Hn-Mc-DWR 펩타이드의 항조류 활성을 측정하였다. 구체적으로, 항조류 활성을 측정하기 위한 적조유발 미세조류로 알렉산드리움 카타넬라(Alexandrium catanella), 알렉산드리움 타마렌스(Alexandrium tamarense), 샤토넬라 마리나(Chattonella marina), 샤토넬라 에스피(Chattonellar sp.), 코클로디니움 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides), 지로디니움 임퓨디컴(Gyrodinium impudicum), 헤테로시그마 아카시우(Hetrosigma akashiwo), 헤테로시그마 에스피(Heterosigma sp.) 프로로센트롬 미칸스(Prorosentrum micans) 및 프로로센트롬 미니멈(Prorocentrum minimum)을 한국 해양 미세조류 은행으로부터 분양 받았다. 그 다음, 상기 분양받은 각 미세조류를 F2 배지(150 mg NaNO3, 8.69 mg NaH2PO4·9H2O, 10 mg ferric EDTA, 0.22 mg MnCl2, 0.11 mg CoCl2, 0.0196 mg CuSO4·5H2O, ZnSO4·7H2O, 50 mg Na2SiO3·9H2O, 0.012 mg Na2MoO4·2H2O, 1 ㎍ Vitamine B12, 1 ㎍ Biotin, 0.2 ㎍ Thiamine·HCl / 1L 필터된 해수)에서 온도 22℃, 염분 34‰, 그리고 조도 3,000 럭스(lux)를 배양 조건으로 하고, 16시간/8시간 명암 주기로 일정하게 두고 배양하였다. 그 후 상기 배양된 미세조류의 세포 수가 104/ml가 되도록 희석하여 24 웰(well) 마이크로 타이트레이트 플레이트에 접종한 다음, 상기 실시예 1에서 합성한 Hn-Mc 펩타이드, Hn-Mc-Del 펩타이드, Hn-Mc-DRW 펩타이드, 또는 Hn-Mc-DWR 펩타이드를 64 mg/L 농도로부터 시작하여 1/2배씩 희석하여 상기 균주가 접종된 플레이트에 첨가하였다. 그 후 상기에서 언급한 배양조건에서 36시간 동안 배양하면서 2시간 마다 적조생물의 수를 헤모사이토메터(hemocytometer)를 이용하여 측정하였다. 유해조류의 90% 이상 운동성 저해농도(90% of Immotile concentration, 이하 'IC90'라 약칭함)와 90% 이상 사멸되는 농도 (90% of algicidal concentration, 이하 'AC90'라 약칭)값을 결정하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.
| 적조유발 미세조류 | Immotile concentration(IC) and algicidal concentration(AC) (mg/L) | |||||||
| Hn-Mc | Hn-Mc-Del | Hn-Mc-DRW | Hn-Mc-DWR | |||||
| IC90 | AC90 | IC90 | AC90 | IC90 | AC90 | IC90 | AC90 | |
| Alexandrium catanella | 8 | 16 | 8 | 16 | 2-4 | 4 | 1-2 | 2 |
| Alexandrium tamarense | 8 | 16 | 8 | 16 | 2-4 | 4 | 1-2 | 2 |
| Chattonella marina | 4-8 | 8 | 8 | 8 | 2 | 2 | 1 | 1 |
| Chattonella sp. | 4-8 | 8 | 8 | 8 | 2 | 2 | 1 | 1 |
| Cochlodinium polykrikoides | 8 | 32 | 8 | 32 | 4 | 8 | 2 | 2 |
| Gyrodinium impudicum | 8 | 32 | 8 | 32 | 2-4 | 4 | 2 | 2-4 |
| Heterosigma akashiwo | 4 | 8 | 4 | 8 | 2 | 4 | 1 | 1-2 |
| Heterosigma sp . | 4 | 8 | 4 | 8 | 2 | 4 | 1 | 1-2 |
| Prorocentrum micans | 8 | 32 | 8 | 32 | 2-4 | 4 | 1-2 | 2 |
| Prorocentrum minimum | 8 | 32 | 8 | 32 | 2-4 | 4 | 1-2 | 2 |
상기 표 2에서 보듯이, Hn-Mc 펩타이드, Hn-Mc-Del 펩타이드, Hn-Mc-DRW 펩타이드 또는 Hn-Mc-DWR 펩타이드는 모든 적조유발 미세조류의 90% 운동성을 저해하는 농도가 8 mg/mL 이하이고, 90% 사멸농도가 32 mg/mL 이하를 나타내었으며, 특히 Hn-Mc-DWR 펩타이드가 적조유발 미세조류의 운동성과 생육을 저해시키는 농도가 가장 낮음을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 실시예 1에서 제조한 Hn-Mc 펩타이드, Hn-Mc-Del 펩타이드, Hn-Mc-DRW 펩타이드, 및 Hn-Mc-DWR 펩타이드는 모두 항조류 활성을 가짐을 알 수 있었다.
<1-2> Hn-Mc-DWR 펩타이드의 셀룰로오스 세포벽이 없는 적조유발 미세조류에서의 항조류 활성 관찰
상기 실시예 1에서 합성한 Hn-Mc-DWR 펩타이드가 항조류 활성을 보이는 것을 광학 현미경 상에서 가시화하기 위하여, 와편모조류인 코클로디니움 폴리크리코이데스(C. polykrikoides)을 F2 배지에 접종한 뒤 상기 1-1과 동일한 배양조건으로 배양하였다. 배양된 코클로디니움 폴리크리코이데스(C. polykrikoides)를 104/㎖의 농도로 24웰 마이크로 타이트레이트 플레이트에 접종한 뒤 Hn-Mc-DWR 펩타이드를 2 mg/L의 농도로 추가 첨가하여 22℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 배양 시간별로 가시화하기 위하여 광학현미경 상에서 관찰하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 보듯이, 적조유발 미세조류인 코클로디니움 폴리크리코이데스(C. polykrikoides)에 아무것도 처리하지 않은 경우(도 1a)는 생물의 수가 유지되고 외형적 변화가 없음이 확인되었다. 반면, Hn-Mc-DWR 펩타이드를 2 mg/L의 농도로 처리하고 1분 후 코클로디니움 폴리크리코이데스(C. polykrikoides)의 생물군체는 이루는 사슬이 끊어지고 10분 후부터 세포막이 터지는 것이 관찰되었으며, 30분 후에는 세포막뿐만 아니라 세포내 소기관의 막도 터져 사멸되었음이 확인되었다.
이로써 본 발명의 Hn-Mc-DWR 펩타이드의 항조류 활성을 확인할 수 있었다.
<시험예 2> 본 발명에 따른 펩타이드의 세포독성실험
본 발명의 항조류 펩타이드가 세포독성을 나타내는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 항조류 펩타이드의 적혈구 파괴능과 세포 사멸능을 조사하였다.
구체적으로, 돌돔의 혈액에서 적혈구를 8%의 농도가 되도록 인산염 완충용액(PBS, pH 7.0)으로 3번 씻은 다음 희석한 다음, 상기 적혈구에 128 mg/L 농도로부터 1/2배로 연속적으로 희석된 상기 실시예 1에서 합성한 Hn-Mc 펩타이드, Hn-Mc-Del 펩타이드, Hn-Mc-DRW 펩타이드, 또는 Hn-Mc-DWR 펩타이드를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 상기 반응액을 1,000 x g로 원심분리하여 상등액 속에 포함된 헤모글로빈 양을 414 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로는 적혈구 파괴능을 가진 멜리틴(melittin)을 사용하였다.
세포 파괴 정도를 조사하기 위하여 1% 트리톤 X-100(Triton X-100)을 첨가하여 흡광도를 측정하였고, 1% 트리톤 X-100의 세포 파괴능을 100%로 하여 이를 각 펩타이드의 적혈구 파괴능과 비교하여 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.
세포독성은 어류 세포인 치눅 살먼 엠브리오 세포(Chinook salmon embryo cells, 이하'CHSE-214로 약칭)를 에아글스 최소배지(Eagle's minimum essential medium, MEM)에 10% 소태아혈청(Fetal bovine serum)과 항생제가 처리하여 21℃에서 배양하여 상기 적혈구 파괴능 실험과 같은 농도의 상기 실시예 1에서 합성한 Hn-Mc 펩타이드, Hn-Mc-Del 펩타이드, Hn-Mc-DRW 펩타이드 또는 Hn-Mc-DWR 펩타이드와 양성대조군인 멜리틴을 처리하고 24시간 후, XTT[(2,3-Bis-(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl)-2H-Tetrazolium-5-Carboxanilide)] 시약을 처리하여 생육정도를 확인하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
(상기 식에서, 흡광도 A는 414 nm 파장에서 펩타이드 용액을 처리했을 때 흡광도, 흡광도 B는 414 nm 파장에서 파괴능 0%인 PBS만 처리했을 때 흡광도 및 흡광도 C는 414 nm 파장에서 1% 트리톤 X-100의 흡광도를 나타낸다.)
도 2A에서 보듯이, 본 발명의 Hn-Mc 펩타이드, Hn-Mc-Del 펩타이드, 및 Hn-Mc-DWR 펩타이드는 세포독성을 거의 나타내지 않았으나, Hn-Mc-DRW 펩타이드는 128 mg/L에서 20%의 용혈현상을 보였다. 반면, 양성 대조군으로 사용한 멜리틴은 적혈구 용혈이 매우 높게 나타났다.
또한, 도 2B에서 보듯이, 본 발명의 Hn-Mc 펩타이드, Hn-Mc-Del 펩타이드, 및 Hn-Mc-DWR 펩타이드는 세포독성을 거의 나타내지 않았으나, Hn-Mc-DRW 펩타이드는 128 mg/L에서 29%의 세포사멸을 보였다. 반면, 양성 대조군으로 사용한 멜리틴은 세포 독성이 매우 높게 나타났다.
<실험예 3> Hn-Mc-DWR 펩타이드의 적조유발 미세조류의 세포막 파괴능과 광합성 저해실험
상기 실시예 1에서 합성한 Hn-Mc-DWR 펩타이드의 적조유발 미세조류의 세포막 파괴능을 학인하기 위해서 상기 실험예 1-1의 조류 배양조건에서 헤테로시그마 아카시우(H. akashowo)와 프로로센트럼 미니멈(P. minimum)을 배양한 후, 상기 배양된 미세조류에 Hn-Mc-DWR 펩타이드를 처리하고 세포내 핵산과 반응하는 사이톡스-그린(Sytox-Green)의 형광염색약을 처리하여 세포막 파괴능을 수치화 하였다.
또한, Hn-Mc-DWR 펩타이드의 항조류 활성을 적조 생물의 클로로필 에이 (Chlorophyll a)의 함량을 측정하기 위해, 헤테로시그마 아카시우(H. akashowo)와 프로로센트럼 미니멈(P. minimum)을 F2 배지에 접종한 뒤 배양하였다. 배양된 적조유발 미세조류를 105/ml의 농도로 12웰 마이크로플레이트에 접종한 뒤 22℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 샘플들을 원심분리 한 다음 추출용매인 90% 아세톤을 넣어 호모게나이즈(homogenizer)로 파쇄하였다. 파쇄된 샘플에서 클로로필 에이를 유리시키기 위해 -20℃에서 빛을 차단한 후 4시간 동안 방치한 다음, 샘플을 원심분리하고 상등액을 조심히 취하였다. 이어서 그 상등액에서 클로로필 에이양은 전체 세포의 흡광도와 하기 수학식 2를 이용하여 간략히 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3A에서 보듯이, Hn-Mc-DWR 펩타이드를 처리한 미세조류는 시간에 따라 그린 형광이 현저히 증가함을 관찰할 수 있었다.
또한, 또 3B에서 보듯이, Hn-Mc-DWR 펩타이드를 처리한 조류는 배양시간이 지남에 따라 크로로필 에이의 양이 현저히 감소하는 것을 관찰할 수 있었다.
따라서, 본 발명에 따른 Hn-Mc-DWR 펩타이드는 세포막을 파괴하여 유해조류를 사멸시키며, 적조유발 미세조류의 생장을 저해함을 알 수 있었다.
<실험예 4> Hn-Mc-DWR 펩타이드의 수족관 생물 실험
상기 실시예 1에서 합성한 Hn-Mc-DWR 펩타이드의 항조류 활성을 확인하기 위해, 가리비 조개를 해수 수족관(가로 35 cm × 세로 35 cm × 높이 50 cm, 산소 공급)에 넣고 샤또넬라 마리나(C. marina), 프로로센트럼 미니멈(P. minimum)과 헤테로시그마 아카시우(H. akashiwo)를 각각 105 cells/mL의 농도로 투여한 다음, 16 mg/L 농도의 Hn-Mc-DWR 펩타이드를 처리한 후 12시간 동안 방치하였다. 그 다음 가리비를 꺼내 내부를 관찰하였다. 대조군으로는 적조유발 미세조류와 Hn-Mc-DWR 펩타이드를 처리하지 않은 가리비를 사용하였으며, 음성 대조군으로는 적조유발 미세조류만 처리한 가리비를 사용하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에서 보듯이, 적조유발 미세조류만 처리한 음성 대조군은 적조유발 미세조류와 Hn-Mc-DWR 펩타이드를 처리하지 않은 대조군에 비해 내부 기관들의 심각한 손상을 보인 반면, 적조유발 미세조류와 Hn-Mc-DWR 펩타이드를 동시에 처리한 실험군은 적조유발 미세조류와 Hn-Mc-DWR 펩타이드를 처리하지 않은 대조군과 비슷하게 내부 기관들이 보존되었음이 관찰되었다.
이로써, 본 발명의 Hn-Mc-DWR 펩타이드가 실제 적조유발 미세조류의 증식을 억제하여 해양 생물체를 생존하게 함을 확인할 수 있었다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 제조한 Hn-Mc 펩타이드, Hn-Mc-Del 펩타이드, Hn-Mc-DRW 펩타이드, 및 Hn-Mc-DWR 펩타이드는 적조유발 미세조류의 운동성과 생육을 저해하고, 어패류에 대해 세포독성을 나타내지 않았으며, 특히 Hn-Mc-DWR 펩타이드는 적조유발 미세조류의 세포막을 파괴하고, 클로로필 에이의 함량을 감소시켜 적조유발 미세조류의 사멸을 유발하였다.
따라서, 본 발명에서 제조한 Hn-Mc 펩타이드, Hn-Mc-Del 펩타이드, Hn-Mc-DRW 펩타이드, 및 Hn-Mc-DWR 펩타이드는 해양 생태계에 안전한 적조 방제 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 1
Phe Lys Arg Leu Lys Lys Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln
1 5 10 15
Gln
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hn-Mc-Del peptide sequences
<400> 2
Phe Lys Arg Leu Lys Lys Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg
1 5 10 15
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hn-Mc-DRW peptide sequences
<400> 3
Phe Lys Arg Leu Lys Lys Leu Ile Arg Trp Ile Lys Arg Lys Trp
1 5 10 15
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hn-Mc-DWR peptide sequences
<400> 4
Trp Lys Arg Leu Lys Lys Leu Ile Arg Trp Ile Lys Arg Lys Arg
1 5 10 15
Claims (3)
- 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진, 항조류 활성을 나타내는 키메라 펩타이드.
- 제1항에 있어서,
상기 키메라 펩타이드가 알렉산드리움 카타넬라(Alexandrium catanella), 알렉산드리움 타마렌스(Alexandrium tamarense), 샤토넬라 마리나(Chattonella marina), 샤토넬라 에스피(Chattonellar sp.), 코클로디니움 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides), 지로디니움 임퓨디컴(Gyrodinium impudicum), 헤테로시그마 아카시우(Hetrosigma akashiwo), 헤테로시그마 에스피(Heterosigma sp.) 프로로센트롬 미칸스(Prorosentrum micans) 및 프로로센트롬 미니멈(Prorocentrum minimum)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 적조유발 미세조류에 대해 항조류 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 키메라 펩타이드.
- 제1항 또는 제2항의 키메라 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 적조 방제용 조성물.
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (1)
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| KR1020150142216A KR101746667B1 (ko) | 2015-10-12 | 2015-10-12 | 항조류 활성을 가지는 키메라 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 적조 방제용 조성물 |
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| KR101746667B1 true KR101746667B1 (ko) | 2017-06-14 |
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| KR1020150142216A KR101746667B1 (ko) | 2015-10-12 | 2015-10-12 | 항조류 활성을 가지는 키메라 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 적조 방제용 조성물 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019235682A1 (ko) * | 2018-06-07 | 2019-12-12 | 부경대학교 산학협력단 | 신규한 테트라펩타이드와 이의 유도체 및 이를 포함하는 항적조 또는 항균용 조성물 |
| KR20210119754A (ko) | 2020-03-25 | 2021-10-06 | 한국생명공학연구원 | 픽티바실러스 속 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 적조 방제용 조성물 |
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| KR102135037B1 (ko) * | 2019-05-28 | 2020-07-20 | 한국생명공학연구원 | 피롤-2-카르복실산을 생산하고 살조 활성을 가지는 에리스로박터 속 3-20a1m 균주 및 이의 용도 |
-
2015
- 2015-10-12 KR KR1020150142216A patent/KR101746667B1/ko active IP Right Grant
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|---|---|---|---|---|
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| Publication number | Publication date |
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