WO2014168356A1 - 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물 및 이를이용한 녹조 제거방법 - Google Patents

수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물 및 이를이용한 녹조 제거방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2014168356A1
WO2014168356A1 PCT/KR2014/002600 KR2014002600W WO2014168356A1 WO 2014168356 A1 WO2014168356 A1 WO 2014168356A1 KR 2014002600 W KR2014002600 W KR 2014002600W WO 2014168356 A1 WO2014168356 A1 WO 2014168356A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
algae
water
free amine
soluble free
kda
Prior art date
Application number
PCT/KR2014/002600
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
나재운
장미경
박성철
Original Assignee
순천대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 순천대학교 산학협력단 filed Critical 순천대학교 산학협력단
Priority to CN201480011416.1A priority Critical patent/CN105072904B/zh
Priority to JP2016507880A priority patent/JP6140361B2/ja
Publication of WO2014168356A1 publication Critical patent/WO2014168356A1/ko
Priority to US14/872,032 priority patent/US9808005B2/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/02—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/04—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom
    • A01N43/14—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom six-membered rings
    • A01N43/16—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom six-membered rings with oxygen as the ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
    • C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
    • C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof

Definitions

  • Anti-green algae composition containing water-soluble free amine chitosan as an active ingredient and a method for removing green algae using the same
  • the present invention relates to an anti-algae composition containing a water-soluble free amine chitosan having an anti-algae activity against algae-induced algae as an active ingredient and a method of removing algae using the same.
  • Green algae refers to a phenomenon in which aquatic algae (phytoplankton) multiply and accumulate on the surface of water in eutrophic lakes or slow-flowing streams, thereby changing the color of water significantly to green.
  • Hazardous green algae that occur between May and October are causing hundreds of billions of environmental damage, which is a serious environmental disaster.
  • Green algae easily occur in places with high or slow water flow, such as dams, reservoirs, lakes, golf course hazards, ponds, freshwater farms, and fishing grounds, where water temperatures in the upper layers exceed 23 ° C for more than three days on average. Most of the green algae found in Korea are a kind of southern algae.
  • Korean companies that have entered the global market are also seeing an increase in direct and indirect damages from green algae, for example, in the case of the Argentine Azzurri case. (Closed two Korean companies entering China due to greening of Lake Taihu, China, July 2007).
  • algal blooms that cause green algae produce toxic cyclic peptides called microcystin that can cause disease in people who swim or drink in lakes or reservoirs.
  • microcystin toxic cyclic peptides
  • the killing of algae using existing green algae control techniques may promote the release of microcystine.
  • the microcysteine released in large quantities not only affects the growth of aquatic organisms, but also Also affects.
  • seawater green algae have become a serious environmental problem not only in fresh water but also on the coast.
  • the seawater green algae are caused by a phenomenon in which the seaweed, which is a seaweed, grows abnormally and is deposited on the shoreline.
  • Sea green algae have been reported in many parts of the world, and are famous in the United States, Chesapeake Bay, Bretagne, France, and Centao, China. In Japan, it has been confirmed since 1990 in the Toko Bay, the Seto Inland Sea, and coastal regions of Kyushu.
  • the occurrence of green algae causes various adverse effects such as deterioration of the landscape of coastal areas, odor caused by decay of seaweed, and the death of fish and shellfish such as clams, etc.
  • the first is the spraying of ocher, a widely used method of removing fresh water algae.
  • Ocher has a high specific gravity and is an inorganic material, and the electric double-layers of particles are compressed in the seawater easily and can be easily precipitated.
  • This method is mainly used in Korea for the prevention and removal of green algae, but it is not used in foreign countries because secondary environmental pollution occurs when spraying raw ocher.
  • spraying ocher where the solid, or velocity spun been reported that not only help our company to many organisms in the water and recently deposited harmful algae can be grown through the hyumyeongi again to the fine loess settled secondary damage Can be generated.
  • the physical green algae control method wastes and decomposes all the wastes and pollutants in the land and aquaculture in the sedimentary layer, decomposes and consumes dissolved oxygen, and generates various toxic substances, causing green algae, and dredging or grinding the sedimentary layer.
  • the occurrence can be prevented in advance.
  • this method has a problem that it is difficult to have an effect on a wide lake or a system that actually causes green algae.
  • Non-Patent Document 1 there is an artificial island installation and a light shielding film installation, which is also hard to be applied to a large area (Non-Patent Document 1).
  • the deep aeration method for supplying oxygen is possible when the depth of the water is within 5m, but there is a limit in the area (Non-Patent Document 2).
  • Patent Document 1 a device for destroying harmful algae membranes using ultrasonic waves developed at home and abroad has been developed and marketed (Patent Document 1).
  • this method also has the disadvantage that it can affect the growth of other aquatic organisms according to the intensity of the ultrasound. Such a physical method is very unlikely to be used because of the high cost of controlling the algae.
  • the present inventors have an anti-algae effect on algae causing green algae when chitosan, which is nature-friendly and harmless to humans and natural ecosystems, is treated with algae. It was confirmed that there is no toxicity to complete the present invention.
  • Patent Document 1 Republic of Korea Patent No. 10-1235053.
  • Non-Patent Document 1 Korea Water Resources Corporation, Research on Green Algae Generation and Reduction Technology in River-Reservoir Systems, 2007;
  • Non-Patent Document 2 Korea Water Resources Corporation, Feasibility Study for Multi-purpose Dam Underwater Aerator Installation, 1990. ⁇ Detailed Invention ⁇
  • Another object of the present invention is to provide a composition for anti-algae containing water-soluble free amine chitosan having a molecular weight of 20 KDa to 100 kDa as an active ingredient in the algae-inducing algae.
  • the present invention is a water-soluble free amine having anti-algae activity in algae-induced algae
  • An anti-green algae composition containing chitosan as an active ingredient is provided.
  • the present invention provides a method for removing the green algae by spraying the anti-algae composition containing the water-soluble free amine chitosan as an active ingredient in the green algae generating water.
  • the water-soluble free amine chitosan according to the present invention exhibits excellent anti-algae activity that inhibits green algae by directly inducing the killing of algae-induced algae, and is non-toxic to cells in freshwater organisms, so that it contains an anti-algae composition as an active ingredient.
  • FIG. 2 is a photograph of optical and fluorescence observation of anti-algae activity against Cinderusmouth obiilliqus (5ce /? «Fes / s obliquus) ⁇ of Preparation Example 2;
  • Figure 3 is a graph showing the hemolysis rate for red blood cells of crucian carp, a freshwater organism of water-soluble free amine chitosan prepared in Preparation Examples 1, 2 and Comparative Examples 1 to 4 of the present invention
  • Figure 4 is a photograph of the anti-algae activity after 4 hours and 36 hours after treatment with the water-soluble free amine chitosan prepared in Preparation Example 2 to the microcistis aeruginosa (/ c / cysi / s aeruginosa) culture medium
  • Manufacture example 2-1 is a culture solution after 4 hours of water-soluble free amine chitosan treatment
  • manufacture example 2-2 is a culture solution after 36 hours of water-soluble free amine chitosan treatment
  • FIG. 5 is treated with a water-soluble free amine chitosan prepared in Preparation Example 2 in a culture solution of Cinderusmouth obiliques (5cCTectesffws obliquus) ⁇ , and 36 hours later: Pictures of anti-algae activity;
  • FIG. 6 is a photograph of the water-soluble free amine chitosan prepared in Preparation Example 2 treated with water in a pond in which green algae were generated, and the change after 1 hour was observed;
  • FIG. 7 is a photograph of the water-soluble free amine chitosan prepared in Preparation Example 2 treated with water in a pond where green algae were generated and observed for change after 12 hours.
  • the present invention has a molecular weight of 20 kDa having anti-algae activity in algae-induced algae
  • the composition for anti-green algae containing 100 kDa of water-soluble free amine chitosanol as an active ingredient is provided.
  • the anti-green algae composition according to the present invention includes microcistis aeruginosa (/ oro / s aeruginosa), Cinderusmouth obilique (5ca1 ⁇ 2 (fes / »i / s obliquus), Chlorella vulgaris / ore // a It has anti-algae activity against algae-induced algae such as vulgaris).
  • the water-soluble free amine chitosan contained as an active ingredient in the anti-green composition according to the present invention may be prepared by the following method, but is not limited thereto.
  • step 1 Forming a salt using an organic acid and an inorganic acid to insoluble chitosan, and then enzymatically preparing the chitosan polysaccharide (step 1);
  • step 2 Treating the solution of the organic acid or inorganic acid salt of chitosan polysaccharide prepared in step 1 with trialkylamine which is a base (step 2);
  • step 3 Adding an organic solvent to the mixed solution of step 2 to prepare a chitosan polysaccharide in which an organic or inorganic acid bound to chitosan polysaccharide is removed in the form of a trialkylamine salt (step 3); And The acid-free chitosan polysaccharide solution prepared in step 3 was treated with inorganic acid, followed by purification with an activated carbon / ion exchange resin column to prepare pure water-soluble free amine chitosan (step 4).
  • the water-soluble free amine chitosan prepared by the above production method according to the present invention has a high solubility in water and a water-soluble free amine chitosan having a molecular weight of 1 kDa to 100 kDa exhibiting physiological activity.
  • the composition for anti-algae according to the present invention is preferably used that the molecular weight of the water-soluble free amine chitosan is 20 kDa to 100 kDa having anti-algae activity against algae causing the algae.
  • the molecular weight of the water-soluble free amine chitosan according to the present invention is less than 20 kDa, but there is an anti-algae activity against algae-induced algae, there is a problem that is difficult to prevent and remove green algae because the activity is low, the molecular weight exceeds 100 kDa , Anti-green algae activity is excellent, but there is a problem appearing toxicity to other aquatic life.
  • the water-soluble free amine chitosan according to the present invention 50% growth inhibitory concentrations for KMicrocystis aeruginosa, Cinderusmouth obilicus (5ce2 «fes i / s obliquus) and Chlorella vulgaris / ore / As w / ⁇ r / s It can be seen that the anti-algae activity against the algae-induced freshwater algae is exhibited even at a low concentration of 0.024 g / L or less (see Experimental Example 1).
  • the water-soluble free amine chitosan according to the present invention does not cause red blood cell hemolysis to red blood cells of crucian carp even when treated with water containing crucian carp, which is a freshwater organism (see Experimental Example 3).
  • the experiments that increased the population of algae-induced algae showed a remarkably excellent green algae removal and suppression effect, even when the water-soluble free amine chitosan of the present invention was treated in the water of an algae-induced pond. It was shown to have excellent activity (see Experimental Example 4 and Experimental Example 5).
  • the water-soluble free amine chitosan having a molecular weight of 20 kDa to 100 kDa according to the present invention not only has excellent anti-algae activity against algae-induced algae, but also does not have cytotoxicity against freshwater organisms and thus does not adversely affect the ecosystem.
  • the composition for anti-green algae as a component may be usefully used as an anti-green algae composition that is safe for freshwater ecosystems such as solidified dams, reservoir lakes, golf course hazards, ponds, freshwater farms, and fishing grounds.
  • the present invention provides a method for removing the green algae by spraying an anti-algae composition containing a water-soluble free amine chitosan having an active algae activity of algae-induced algae having a water-soluble free amine chitosan of 20 KDa to 100 kDa as an active ingredient. do.
  • the present invention provides a use of the composition for anti-algae containing water-soluble free amine chitosan having a molecular weight of 20 KDa to 100 kDa as an active ingredient in the algae-inducing algae.
  • the present invention will be described in more detail by production examples and experimental examples.
  • a 5% chitosan solution was prepared using lactic acid as a solvent. 5 units of Bacillus pumilus in 100 mL of the 5% chitosan solution (pH 5.0-5.5)
  • a molecular weight of 3 kDa was obtained in the same manner as in Preparation Example 1, except that 3 kDa cells were used in the same manner as in Preparation Example 1, except that 3 kDa cells were used in the acetate membrane instead of using a 20 kDa cell in the preparation example 1. Phosphorus-soluble free amine chitosan was obtained.
  • a water-soluble solution having a molecular weight of 5 kDa was carried out in the same manner as in Preparation Example 1, except that 5 kDa cells were used in the acetate membrane instead of the 20 kDa cells in the step 3 of Preparation Example 1. Free amine chitosan was obtained.
  • a water-soluble solution having a molecular weight of 10 kDa was prepared in the same manner as in Preparation Example 1, except that 10 kDa cells were used in the acetate membrane instead of the 20 kDa cells in the step 3 of Preparation Example 1. Free amine chitosan was obtained.
  • a molecular weight of 150 kDa was obtained in the same manner as in Preparation Example 1, except that the reaction reaction of the chitosan solution in Step 1 of Preparation Example 1 and 20 kDa cells of Step 3 were not performed by ose acetate membrane filtration. Water soluble free amine chitosan was obtained.
  • Experimental Example 1 Evaluation of Anti-Green Algae Activity of Water-Soluble Free Amine Chitosan 1 The following experiment was conducted to evaluate the anti-green algae activity of water-soluble free amine chitosan according to the present invention.
  • Microcistis aeruginosa (/ crocys / s aeruginosa) and Cinderusmouth obiilliqus (e / 7 «/ es7» s obliquus) ), Chlorella ⁇ 7 ⁇ Chlorel la vulgaris) ⁇ .
  • the respective bird the NaN0 3 (15 mg), 40 mg K 2 HP0 4 (40 mg), MgS0 4 - 7H 2 0 (75 mg), CaCl 2 ⁇ 2H 2 0 (36 mg), citric acid (6 mg), citric acid iron ammonium (6 mg), EDTA 1 mg ), NaC0 3 (20 mg), H 3 B0 3 (2.86 mg), MnCl 2 - 4H 2 0 (1.81 mg), ZnS0 4 - 7H 2 0 (0.222 mg) , CuS0 4 - in 5H 2 0 (0.079 mg), Co (N0 3) 2 ⁇ 6H 2 0 (0.0494 mg / lL) BG-11 22 ° C in a culture medium, Lux illumination 3,000 (lux) containing the 14 hour / Incubated at a constant 10 hour contrast cycle.
  • Precultured green algae cells were diluted to a concentration of 2 ⁇ 10 5 cells / mL or 5 ⁇ 10 5 cells / mL of the cells and inoculated into 24 well micro titrate plates.
  • Each of the water-soluble free amine chitosans prepared in Preparation Examples 1, 2 and Comparative Examples 1 to 5 was diluted 1/2 fold starting from 6.25 (mg / mL) / well concentration to inoculate the strain.
  • the BG-11 medium containing no water-soluble free amine chitosan was added instead of the water-soluble free amine chitosan and used as an untreated group.
  • the green algae biomass was measured every 6 hours using a hemoytometer to determine the 50% growth inhibitory concentration (hereinafter abbreviated as IC 50 ). And the results are shown in Table 1 below.
  • the water-soluble free amine chitosan having a molecular weight of 20 kDa to 100 kDa according to the present invention has excellent anti-algae activity against algae-induced algae. More specifically, the water-soluble free amine chitosan of 20 kDa to 100 kDa of the present invention is the algae-induced algae microcistis ⁇ 1 ⁇ erugino human K / c / Ocys / s aeruginosa), Cinderusmus, 2-3 ⁇ 43 ⁇ 4 ⁇ (Scenedesmus obliquus), Chlorella vulgaris 3 ⁇ 4 / 0 // 3 ra / r / s), molecular weight dependent, when the molecular weight is 100 kDa, the IC 50 value is less than 0.024 g / L causing green algae It has been shown that the anti-algae activity against algae is excellent.
  • the anti-algae activity against the algae-induced algae was excellent even when the molecular weight was 20 kDa.
  • the remarkably good algae of 0.049 g / L in Comparative Example 5 having a molecular weight of more than 100 kDa, it was confirmed that the anti-algae activity was excellent, but the water-soluble free amine chitosan having a molecular weight of less than 20 kDa prepared in Comparative Examples 1 to 4 was obtained.
  • the water-soluble free amine chitosan of 20 kDa to 100 kDa according to the present invention has excellent anti-algae activity against green algae-induced algae, and has an excellent effect of reducing green algae and inhibiting proliferation.
  • the composition may be usefully used as an anti-green algae composition that is safe for freshwater ecosystems such as solidified dams, reservoirs, lakes, golf course hazards, ponds, freshwater farms, and fishers.
  • the experiment NaN0 3 the algae causing birds used in Example 1 (15mg), 40 mg 2 HP0 4 (40 mg), MgS0 4 - 7H 2 0 (75 mg), CaCl 2 ⁇ 2H 2 0 (36 mg), citric acid ( 6 mg), Ferrous ammonium citrate (6 mg), EDTA l mg), NaC0 3 (20 mg), H 3 B0 3 (2.86 mg), MnCl 2 ⁇ 4H 2 0 (1.81 mg), ZnS0 4 ⁇ 7H 2 O (0.222 mg), CuS0 4 ⁇ 5H 2 0 (0.079 mg) and Co (N0 3 ) 2 ⁇ 6H 2 0 (0.0494 mg / lL) were incubated in BG ⁇ 11 medium.
  • the cultured green algae were inoculated into a 24-well micro titrate plate at a concentration of 10 5 cells / mL, followed by inoculation of the green algae at a concentration of 12 mg / mL per well of the water-soluble free amine chitosan prepared in Preparation Example 2. Incubated for 2 hours at 22 ° C. In addition, BG-11 medium containing no water-soluble free amine chitosan was added to replace the water-soluble free amine chitosan and used as an untreated group. After incubation, observation was carried out under an optical and fluorescence microscope to visualize the results, and the results are shown in FIGS. 1 and 2. As shown in Figs.
  • the water-soluble free amines of chitosan according to the invention it can be seen that the anti-algae activity against rust, caused crude algae. More specifically, the results of fluorescence microscopy using the nature of the green algae fluorescence itself in the living state, and does not fluoresce in the dead state, the number of organisms in the untreated group is maintained and apparently unchanged, When the water-soluble free amine chitosan prepared in Example 2 was treated, In addition to a significant decrease in comparison with the untreated group, no increase in population was observed. From this, it can be seen that the water-soluble free amine chitosan according to the present invention causes the killing of algae-induced algae.
  • the water-soluble free amine chitosan of 20 kDa to 100 kDa according to the present invention has excellent anti-algae activity against algae-induced algae, and has an excellent effect of reducing green algae and inhibiting proliferation.
  • the composition can be usefully used as an anti-green algae composition that is safe for freshwater ecosystems such as solidified dams, reservoirs, lakes, golf course hazard ponds, freshwater farms, and fishers.
  • the water-soluble free amine chitosan of 20 kDa to 100 kDa according to the present invention is not cytotoxic to freshwater organisms. More specifically, the water-soluble free amine chitosan prepared in Preparation Examples 1 and 2 according to the present invention was shown to exhibit a low hemolysis rate of less than 5% regardless of the concentration.
  • the water-soluble free amine chitosan having a molecular weight of 100 kDa prepared in Comparative Example 5 was found to exhibit high hemolysis rate even at low concentration. From this, the water-soluble free amine chitosan according to the present invention is cytotoxic It can be seen that it is safe for freshwater creatures. Therefore, the water-soluble free amine chitosan of 20 kDa to 100 kDa according to the present invention not only has excellent anti-algae activity against algae-induced algae, but also has high cytotoxicity and safety for freshwater organisms.
  • composition for anti-green algae containing it as an active ingredient may be usefully used as an anti-green algae composition that is safe for freshwater ecosystems such as solidified dams, reservoirs, lakes, golf course hazards, ponds, freshwater farms, and fishing grounds.
  • the water-soluble free amine chitosan according to the present invention is microcistis aeruzinosa, algae-induced algae
  • the untreated group not treated with the water-soluble free amine chitosan according to the present invention not only suspends the turbidity of water but also microcistis which is algae-induced algae.
  • the water-soluble free amine chitosan according to the present invention has high anti-algae activity against algae-induced algae. Accordingly, the water-soluble free amine chitosan of 20 kDa to 100 kDa according to the present invention has excellent anti-algae activity against algae-induced algae, and has an excellent effect of reducing green algae and inhibiting proliferation.
  • the anti-algae composition containing it as an active ingredient can be usefully used as a safe anti-algae composition for freshwater ecosystems such as solidified dams, reservoirs, lakes, golf course hazards, ponds, and freshwater farms. Can be.
  • the algae-induced algae present in the pond water is killed and begins to precipitate Appeared.
  • the turbidity of the pond is quite clear. From this, it can be seen that the water-soluble free amine chitosan according to the present invention has an excellent effect of removing green algae against fresh water in which actual green algae are generated.
  • the water-soluble free amine chitosan of 20 kDa to 100 kDa according to the present invention has excellent anti-algae activity against algae-induced algae, and has an excellent effect of reducing green algae and suppressing proliferation. Since the green algae removal effect is excellent, the anti-green algae composition containing it as an active ingredient can be usefully used as a safe green algae composition for freshwater ecosystems such as solidified dams, reservoirs, lakes, golf course hazards, ponds, freshwater farms, and fishers. Can be.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Separation Of Suspended Particles By Flocculating Agents (AREA)
  • Cultivation Of Seaweed (AREA)

Abstract

본 발명은 녹조유발 조류에 대한 항조류 활성을 갖는 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 녹조유발 조류를 직접적으로 사멸을 유도함으로써 녹조를 억제하는 우수한 항녹조 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 담수 생물 내의 세포에 대하여 무독성이므로 이를 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물은 고형화된 댐, 저수지, 호수, 골프장 헤저드, 연못, 민물 양식장, 낚시터 등과 같은 담수 생태계에 안전한 항녹조용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물 및 이를 이용한 녹조 제거방법
【기술분야】
본 발명은 녹조유발 조류에 대한 항조류 활성을 갖는 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물 및 이를 이용한 녹조 제거방법에 관한 것이다.
【배경기술】
녹조현상이란 부영양화된 호수나 유속이 느린 하천에서 부유성의 조류 (식물 플랑크톤)가 대량 증식하여 수면에 집적함으로써 물의 색을 현저하게 녹색으로 변화시키는 현상을 말한다. 매년 5월에서 10월 사이에 발생되는 유해성 녹조로 인해서 수 천억원의 환경 피해가 발생되고 있으며， 이는 심각한 환경재앙이라 할 수 있다. 녹조는 상층부 수온이 평균 3일 이상 23°C를 넘고 고형화된 댐， 저수지， 호수， 골프장 헤저드， 연못， 민물 양식장， 낚시터— 등과 같이 물이 고여 있거나 유속이 느린 곳에서 쉽게 발생되고 있다. 국내에서 발견된 녹조류는 대부분 남조류의 일종으로 확인된 종류만 해도 약 167종으로 그 종이 다양하다. 일반적으로 녹조가 발생되기 시작하면 조류 미생물의 번식속도가 기하급수적으로 늘어나고 물에 산소량을 대부분 조류들이 흡수해 버려 물이 빠르게 부영양화 (산소 결핍)되면서 심할 경우에는 악취가 난다. 물속에 어류들은 산소량 부족과 아가미 측에 조류 부착으로 호흡이 어려워 물 상층부로 뜨면서 수온 변화가 심해 적웅을 못하고 괴사하는 경우가 있다. 최근 낙동강， 대청호 등지에서 여름철 남조류가 대량 증식하여 물의 색을 변화시키는 경우가자주 관찰되고 있다. 일단， 녹조가 발생하면 그 수역의 물은 음용수로나 산업용으로의 이용이 제한되어 막대한 비용이 소모되고 생태계도 파괴되며， 이 밖에도 사회， 경제， 환경적인 측면에서 많은 문제가 유발된다. 전 세계적에 해외 진출한 한국기업은 예를 들면， 아르헨티나 아주리 사건의 경우 물 정수 공장의 녹조 유입으로 인한 5억 5천만 달러 규모의 피해보상액 소송사건과 같은 녹조로 인한 직접적， 간접적 피해 또한 증가하는 추세이다 (중국 타이후 호수 녹조발생으로 중국진출 한국기업 2곳 폐업， 2007. 7).
또한， 녹조를 일으키는 조류 증식의 또 다른 피해로 호수나 저수지에서 수영을 하거나 물을 마신 사람에게 질병올 일으킬 수 있는 마이크로시스틴 (microcystin)이라는 독성의 고리형 펩타이드가 생성된다. 이는 녹조가 고농도로 발생하였을 경우， 기존의 녹조 방제기술들을 이용한 조류의 사멸은 마이크로시스틴의 분비를 오히려 촉진시킬 수 있는데， 대량으로 방출된 마이크로시스틴은 수중 생물의 생장에도 영향을 미칠 뿐 아니라， 사람에게도 영향을 미친다.
나아가， 녹조의 발생은 담수뿐만 아니라， 해안가에서도 심각한 환경문제로 대두되고 있다. 상기 해수 녹조는 해조인 파래속 (屬)이 이상 증식하여 해안선에 퇴적되는 현상에 의해 발생된다. 해수 녹조는 세계 각지에서 발생이 보고되고 있으며， 미국 체사피크만 (Chesapeake Bay)및 프랑스 브루타뉴 (Bretagne) 지방， 중국 첸타오 등에서의 발생사례가 유명하다. 일본 국내에서는 1990년 이후 도코만 및 세토 내해， 규슈 각 지역의 해안지역 등에서 발생이 확인되고 있다. 녹조의 발생에 의해 해안지역의 경관 악화， 해조의 부패에 의한 악취， 바지락 등 어패류의 사멸 등 다양한 악영향이 초래하고 있으며， 이로 인하여 일본의 각 지자체는 연간 수 천만 엔의 비용을 투입하여 녹조의 제거 및 폐기를 실시하고 있지만， 매년 발생하는 연안 녹조에 대한 효과적인 대책이 없는 것이 현재 상태이다. 현재, 녹조로 인해 발생되는 피해를 최소화할 수 있는 방안 및 대책 o 요구되고 있으나， 상기 문제를 해결하기 위하여 현재 사용할 수 있는 기존의 기술은 2차， 3차 생태계에 문제점을 야기할 수 있고 시간이 많이 소요된다는 단점이 있다. 그 예로는 다음의 녹조제거 방법을 들 수 있다.
먼저, 담수 녹조의 제거 방법으로 널리 쓰이는 방법인 황토의 살포이다. 황토는 비중이 크고 무기물로 되어 있으며 해수 중에서 입자의 전기 이중층 (electricl double-layers)이 크게 압축되어 용이하게 웅결 침전할 수 있으므로 녹조 생물을 웅집시켜 담수나 해수 바닥으로 침전시킨다. 이 방법은 녹조 예방 및 제거를 위하여 우리나라에서 주로 사용하고 있는 방법이나， 생황토 살포 시， 2차적인 환경오염이 발생됨으로써 외국에서는 사용하지 않는 방법이다. 즉， 고형 · 혹은 유속이 늘인 곳에 황토를 살포하면 미세황토가 침전하여 물속의 여러 생물까지 폐사시킬 수 있을 뿐만 아니라， 최근에는 침전된 유해 조류가 휴면기를 지나 다시 생장할 수 있다는 보고되어 2차 피해를 발생시킬 수 있다.
다음으로， 물리적인 녹조 방제방법은 육상 및 양식장의 모든 폐기물과 오염 물질 등이 퇴적층에 침전되어 부패 분해되면서 용존 산소를 소비하고， 각종 유독성 물질을 생성하여 녹조를 일으키는데， 퇴적층을 준설하거나 갈아줌으로써 녹조 발생을 사전에 방지할 수 있다. 그러나 이 방법은 실제로 녹조를 일으키는 넓은 호수나 템 등에는 효과를 거두기가 어렵다는 문제가 있다.
다음으로 인공섬 설치와 차광막 설치 등이 있는데 이 또한, 넓은 면적에는 적용되어지기 힘들다 (비특허문헌 1). 그 외에 산소를 공급해주는 심층폭기법은 수심이 5m이내인 경우 가능하나 면적에 한계가 있다 (비특허문헌 2). 최근에 국내외에서 개발된 초음파를 이용하여 유해 조류의 막을 파괴하는 장치를 개발하여 시판하고 있다 (특허문헌 1). 그러나， 이 방법 역시, 초음파의 세기에 따라 다른 수생 생물의 생장에 영향을 줄 수 있는 단점이 있다. 이처럼 물리적인 방법은 녹조 방제에 있어 비용이 엄청나기 때문에 이용 가능성이 매우 낮다고 볼 수 있다. 이에， 본 발명자들은 상기의 문제점들을 고려하여, 자연친화적이며 인체 및 자연 생태계에 무해한 키토산을 녹조유발 조류에 처리하였을 경우， 녹조를 유발시키는 조류에 대하여 항조류 효과가 있을 뿐만 아니라， 수중 생물에 대하여 독성이 없는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
【선행기술문헌】
【특허문헌】
(특허문헌 1) 대한민국 등록특허 제 10-1235053호.
【비특허문헌】
(비특허문헌 1)한국수자원공사， 하천 -저수지시스템에서 녹조발생기작 및 저감기술연구 연구보고서， 2007;
(비특허문헌 2)한국수자원공사， 다목적댐 수중폭기장치 설치 타당성조사 연구보고서, 1990. 【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명의 목적은 녹조유발 조류에 항조류 활성을 갖는 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물을 제공하는 데 있다. 발명의 다른 목적은 상기 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물을 녹조 발생 담수 수역에 살포하여 녹조를 제거하는 방법을 제공하는 데 있다.
아울러， 본 발명의 다른 목적은 녹조유발 조류에 항조류 활성을 갖는 분자량이 20 KDa 내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물의 용도를 제공하는 데 있다.
【기술적 해결방법】
상기 목적을 달성하기 위하여，
본 발명은 녹조유발 조류에 항조류 활성을 갖는 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물을 제공한다 . ■ 또한， 본 발명은 상기 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물을 녹조 발생 수역에 살포하여 녹조를 제거하는 방법을 제공한다.
【유리한 효과】
본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 녹조유발 조류를 직접적으로 사멸을 유도함으로써 녹조를 억제하는 우수한 항녹조 활성을 나타낼 뿐만 아니라， 담수 생물 내의 세포에 대하여 무독성이므로 이를 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물은 고형화된 댐, 저수지， 호수， 골프장 헤저드, 연못， 민물 양식장， 낚시터 등과 같은 담수 생태계에 안전한 항녹조용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
[도면의 간단한 설명】
도 1은 제조예 2의 마이크로시스티스 아에루지노사 ( /c cys /s aenigj'nosa)^ 대한 항조류 활성을 광학 및 형광 관찰한사진이다;
도 2는 제조예 2의 시네더스머스 오빌리쿼스 (5ce/?«fes /s obliquus)^ 대한 항조류 활성을 광학 및 형광 관찰한사진이다;
도 3은 본 발명의 제조예 1， 제조예 2 및 비교예 1 내지 비교예 4에서 제조된 수용성 유리 아민 키토산의 담수 생물인 붕어의 적혈구에 대해 용혈률을 도시한 그래프이다;
도 4은 제조예 2에서 제조된 수용성 유리 아민 키토산을 마이크로시스티스 아에루지노사 ( /c/ cysi/s aeruginosa)^ 배양액에 처리하고 4시간 및 36시간 경과 후의 항조류 활성을 관찰한 사진이다 (제조예 2—1은 수용성 유리 아민 키토산 처리 4시간 경과한 후의 배양액이고; 및 제조예 2-2는 수용성 유리 아민 키토산 처리 36시간 경과한 후의 배양액이다);
도 5는 제조예 2에서 제조된 수용성 유리 아민 키토산을 시네더스머스 오빌리쿼스 (5cCTectesffws obliquus)^ 배양액에 처리하고 36시간 경과 후와: 항조류 활성을 관찰한 사진이다;
. 도 6은 제조예 2에서 제조된 수용성 유리 아민 키토산을 녹조가 발생한 연못의 물에 처리하고 1시간 경과 후의 변화를 관찰한사진이다;
도 7은 제조예 2에서 제조된 수용성 유리 아민 키토산을 녹조가 발생한 연못의 물에 처리하고 12시간 후의 변화를 관찰한사진이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하， 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 녹조유발 조류에 항조류 활성을 갖는 분자량이 20 kDa 내지
100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산올 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 상기 항녹조용 조성물은 마이크로시스티스 아에루지노사 ( /oro /s aeruginosa) , 시네더스머스 오빌리쿼스 (5ca½(fes/»i/s obliquus) , 클로렐라 불가리스 /ore//a vulgaris) 등의 녹조유발 조류에 대하여 항조류 활성을 갖는다. 또한， 본 발명에 따른 상기 항녹조용 조성물에 유효성분으로 함유되는 수용성 유리 아민 키토산은 다음과 같은 방법에 의하여 제조될 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다:
불용성 키토산에 유기산 및 무기산을 이용하여 염의 형성한 후， 효소분해하여 키토산 다당류를 제조하는 단계 (단계 1);
상기 단계 1에서 제조된 키토산 다당류의 유기산 또는 무기산 염의 용액을 염기인 트라이알킬아민으로 처리하는 단계 (단계 2);
상기 단계 2의 흔합 용액에 유기용매를 첨가하여 키토산 다당류에 결합되어 있는 유기산 또는 무기산을 트라이알킬아민 염과의 형태로 제거된 키토산 다당류를 제조하는 단계 (단계 3); 및 단계 3에서 제조된 산이 제거된 키토산 다당류 용액을 무기산 처리 후, 활성화된 탄소 /이온교환수지 (activated carbon/ ion exchange resin) 컬럼으로 정제하여 순수한 수용성 유리 아민 키토산을 제조하는 단계 (단계 4). 본 발명에 따른 상기의 제조방법에 의하여 제조되는 수용성 유리 아민 키토산은 물에 대한 용해도가 높고， 생리활성을 띄는 1 kDa 내지 100 kDa의 분자량을 갖는 수용성 유리 아민 키토산이 제조된다.
이때， 본 발명에 따른 항조류용 조성물은 수용성 유리 아민 키토산의 분자량이 녹조를 유발시키는 조류에 대하여 항조류 활성을 갖는 20 kDa 내지 100 kDa인 것을사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산의 분자량이 20 kDa미만인 경우， 녹조유발 조류에 대한 항조류 활성은 있으나， 활성력이 낮으므로 녹조 예방 및 제거하기 어려운 문제가 있고， 분자량이 100 kDa을 초과하는 경우， 항녹조 활성은 우수하나， 타 수중생물에 대한 독성이 나타나는 문제가 있다. 본 발명에 따른 항녹조용 조성물의 유효성분으로 함유되는 수용성 유리 아민 키토산의 녹조를 유발시키는 조류에 대한 항조류 활성을 평가하기 위하여 실험한 결과， 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 녹조유발 담수 조류인 마이크로시스티스 아에루지노入 KMicrocystis aeruginosa)， 시네더스머스 오빌리쿼스 (5ce2«fes i/s obliquus) 및 클로렐라 불가리스 /ore/As w/^r/s)에 대한 50% 생육 저해농도가 0.024 g/L 이하로， 낮은 농도의 사용으로도 녹조유발 담수조류에 대하여 높은 항조류 활성을 나타내는 것을 알 수 있다 (실험예 1 참조). 또한， 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 담수 생물인 붕어가 존재하는 물에 처리하여도 붕어의 적혈구에 대하여 적혈구 용혈현상을 유발하지 않아 세포독성이 없는 것이 확인되었다 (실험예 3 참조). 나아가， 녹조유발 조류생물의 개체수를 증가시킨 실험에서도 현저히 우수한 녹조제거 및 억제 효과가 있는 것으로 나타났으며， 본 발명의 수용성 유리 아민 키토산을 실제 녹조가 유발된 연못의 물에 처리한 경우에도 항녹조 활성이 뛰어난 것으로 나타났다 (실험예 4 및 실험예 5 참조).
따라서， 본 발명에 따른 분자량이 20 kDa 내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산은 녹조유발 조류에 대하여 우수한 항조류 활성이 있을 뿐만 아니라, 담수 생물에 대하여 세포독성이 없어 생태계의 악영향을 미치지 않으므로, 이를 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물은 고형화된 댐， 저수지 호수, 골프장 헤저드， 연못， 민물 양식장， 낚시터 등과 같은 담수 생태계에 안전한 항녹조용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 녹조유발 조류에 항조류 활성을 갖는 분자량이 20 KDa 내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물을 녹조 발생 수역에 살포하여 녹조를 제거하는 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 녹조유발 조류에 항조류 활성을 갖는 분자량이 20 KDa 내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물의 용도를 제공한다. 이하， 본 발명을 제조예 및 실험예에 의해 보다 상세히 설명한다.
단， 하기의 제조예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기의 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다. <제조예 1>수용성 유리 아민 키토산의 제조 1
단계 1: 키토산 다당류의 제조
젖산을 용매로 하여 5% 키토산 용액을 제조하였다. 상기 5 % 키토산 용액 (pH 5.0-5.5) 100 mL에 5 유니트 (unit)의 바실러스 푸밀러스
pumilus) BN— 262에서 유래된 키토사네이즈 (chitosanase) 효소를 흔합하여 40°C에서 36시간 동안 효소반웅을 수행하였다. 반웅이 종료되면， 1 μηι 전처리 필터 (pre-filter)를 사용하여 예비 여과한 후， 분자량이 20 kDa인 중공사 여과지 (hollow filter)로 재여과하였다. 상기 단계에서 얻은 여과액을 나노 여과 시스템 (nanofilter system)을 이용하여 농축하고， 살균과정을 거쳐 공기 분무 건조기 (spray dryer)로 건조함으로써 키토산 다당류를 제조하였다. 단계 2: 산이 제거된 키토산 다당류의 제조
상기에서 얻어진 키토산 다당류를 1 L의 PBS 7.0에 용해시키고， 0.52 L의 트리에틸 아민을 천천히 떨어뜨렸다. 이때, 키토산 을리고당의 아민기 1당량에 대해 트리에틸 아민 2 당량으로 반웅시켰다. 상기의 반웅물을 상온에서 2시간 동안 반웅시킨 후， 아세톤을 첨가하여 교반하고 원심분리하였다. 상기 과정을 2 내지 3회 반복한 후 공기 건조 및 동결 건조하여 산이 제거된 키토산 다당류를 제조하였다. 이때， 원심분리는 Supra 30 K를 이용하여 4°C에서 15,000 rpm으로 20분 동안 실시하였다. 단계 3: 수용성 유리 아민 키토산의 제조
상기 단계 2에서 제조된 키토산 다당류에 30 mL 내지 50 mL의 0.001 N 염산을 첨가한 후 2시간 동안 반응시키고, 상기 반웅물에 아세톤을 첨가하여 교반하고 상기와 동일한 조건으로 원심분리하였다. 이러한 과정을 2 내지 3 회 반복한 후 공기 건조 및 동결 건조하였다. 상기에서 건조된 생성물을 2차 증류수에 녹인 후， 활성화된 탄소 /이온교환 수지 컬럼으로 정제하고 얻어진 수용액을 동결 건조하였고 이를 물에 녹여 투과 분자량이 20 kDa 셀를로오스 아세테이트 막을 통하여 분자량이 20 kDa인 수용성 유리 아민 키토산을 얻었다.
<제조예 2>수용성 유리 아민 키토산의 제조 2
상기 제조예 1의 단계 3에서 20 kDa 셀를로오스 아세테이트 막을 사용하는 대신에 100 kDa 셀를로오스 아세테이트 막의 사용하는 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하여 분자량이 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산을 얻었다.
<비교예 1>수용성 유리 아민 키토산의 제조 3 상기 제조예 1의 단계 3에서 20 kDa 셀롤로오스 아세테 이트 막을 사용하는 대신에 1 kDa 셀를로오스 아세테 이트 막의 사용하는 것을 제외 하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하여 분자량이 1 kDa인 수용성 유리 아민 키토산을 얻었다 .
<비교예 2> 수용성 유리 아민 키토산의 제조 4
상기 제조예 1의 단계 3에서 20 kDa 셀를로오스 아세테 이트 막을 사용하는 대신에 3 kDa 셀를로오스 아세테 이트 막의 사용하는 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하여 분자량이 3 kDa인 수용성 유리 아민 키토산을 얻었다.
<비교예 3> 수용성 유리 아민 키토산의 제조 5
상기 제조예 1의 단계 3에서 20 kDa 셀를로오스 아세테이트 막을 사용하는 대신에 5 kDa 셀를로오스 아세테 이트 막의 사용하는 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하여 분자량이 5 kDa인 수용성 유리 아민 키토산을 얻었다.
<비교예 4> 수용성 유리 아민 키토산의 제조 6
상기 제조예 1의 단계 3에서 20 kDa 셀를로오스 아세테이트 막을 사용하는 대신에 10 kDa 셀를로오스 아세 테 이트 막의 사용하는 것을 제외 하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하여 분자량이 10 kDa인 수용성 유리 아민 키토산을 얻었다.
<비교예 5> 수용성 유리 아민 키토산의 제조 7
상기 제조예 1의 단계 1에서 키토산 용액의 효소 반웅 및 단계 3의 20 kDa 셀를로오스 아세테 이트 막 여과를 수행하지 않는 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하여 분자량이 150 kDa인 수용성 유리 아민 키토산을 얻었다 . <실험예 1>수용성 유리 아민 키토산의 항녹조활성 평가 1 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산의 항녹조 활성을 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
항녹조 활성을 측정하기 위한 녹조유발 조류로서 한국 해양미세조류 은행으로부터 분양받은 마이크로시스티스 아에루지노사 ( /crocys /s aeruginosa) , 시네더스머스 오빌리쿼스 ( e/7«/es7» s obliquus) , 클로렐라 ^7\^ Chlorel la vulgaris)^ 사용하였다. 상기 각 조류를 NaN03(15 mg), 40 mg K2HP04(40 mg) , MgS04 - 7H20(75 mg), CaCl2 · 2H20(36 mg) , 시트르산 (6 mg) , 구연산 철 암모늄 (6 mg), EDTA 1 mg)， NaC03(20 mg)， H3B03(2.86 mg) , MnCl2 - 4H20(1.81 mg), ZnS04 - 7H20( 0.222 mg) , CuS04 - 5H20( 0.079 mg) , Co(N03)2 · 6H20(0.0494 mg/lL)를 포함하는 BG-11 배지에서 22°C, 조도 3,000 럭스 (lux)에서 14시간 /10시간 명암 주기로 일정하게 두고 배양하였다. 전배양된 녹조 생물 세포를 세포 수 2X105 세포 /mL 또는 5X105 세포 /mL의 농도로 희석하여 24 웰 (well) 마이크로 타이트레이트 플레이트에 접종하였다. 상기 제조예 1， 제조예 2 및 비교예 1 내지 비교예 5에서 제조된 각 수용성 유리 아민 키토산을 6.25(mg/mL)/웰 (well) 농도로부터 시작하여 1/2배씩 희석하여 상기 균주가 접종된 플레이트에 주입하였다ᅳ 또한， 수용성 유리 아민 키토산을 함유하지 않는 BG-11배지를 수용성 유리 아민 키토산 대신 첨가하여 무처리군으로사용하였다. 상기 배양조건에서 2일 동안 배양하면서 6시간 마다 녹조 생물수를 헤모사이토메터 (hemocytometer)를 이용하여 측정하여， 50% 생육 저해농도 (50% of inhibitory concentration, 이하 IC50라 약칭함) 값을 결정하였고， 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
【표 1】
Figure imgf000012_0001
Figure imgf000013_0001
상기 표 1에 나타난 바와 같이， 본 발명에 따른 분자량이 20 kDa 내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산은 녹조유발 조류에 대하여 우수한 항조류 활성이 있는 것을 알 수 있다. 보다 구체적으로， 본 발명의 20 kDa 내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산은 녹조유발 조류인 마이크로시스티스 ό1·에루지노人 K /c/Ocys /s aeruginosa) , 시네더스머스 ,2- ¾ ^ ^ ( Scenedesmus obliquus) , 클로렐라 불가리스 ¾/0 //3 ra/ r/s)에 대하여， 분자량 의존적인 것으로 나타났으며， 분자량이 100 kDa인 경우， IC50 값이 0.024 g/L 이하로 녹조를 유발하는 조류에 대한 항조류 활성이 우수한 것으로 나타났다. 또한， 분자량이 20 kDa인 경우에도 녹조유발 조류에 대한 항조류 활성이 우수한 것으로 나타났으며 특히， 클로렐라 불가리스 ¾/o/"e//a vulgaris)^ 경우， 0.049 g/L의 현저히 우수한 항조류 활성이 있는 것으로 확인되었다. 반면， 분자량이 100 kDa를 초과하는 비교예 5의 경우에는 항조류 활성이 우수한 것으로 확인되었으나 비교예 1 내지 비교예 4에서 제조된 분자량이 20 kDa 미만인 수용성 유리 아민 키토산을 처리한 경우， 녹조유발 조류에 대한 항조류 활성이 있는 것으로 나타나지만， 클로렐라 불가리스 /ore//a vu J gar is 제외한 나머지 조류에 대해서는 그 농도가 본 발명에 따른 20 kDa 내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산을 사용한 경우와 대비하여 최소 2배 이상의 농도로 처리를 하여야 항조류 활성이 나타나는 것을 알 수 있다. 이로부터， 본 발명에 따른 20 kDa 내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산은 녹조유발 조류에 대하여 우수한 항조류 활성이 있는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 20 kDa 내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산은 녹조유발 조류에 대하여 항조류 활성이 우수하여， 녹조를 감소 및 증식을 억제하는 효과가 뛰어나므로， 이를 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물은 고형화된 댐，저수지，호수，골프장 헤저드， 연못， 민물 양식장，낚시터 등과 같은 담수 생태계에 안전한 항녹조용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
<실험예 2>수용성 유리 아민 키토산의 항녹조 활성 평가 2
본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산의 항녹조 활성을 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 상기 실험예 1에서 사용한 녹조유발 조류를 NaN03(15mg), 40 mg 2HP04(40 mg), MgS04 - 7H20(75 mg), CaCl2 · 2H20(36 mg) , 시트르산 (6 mg)， 구연산 철 암모늄 (6 mg), EDTA l mg) , NaC03(20 mg) , H3B03(2.86 mg)， MnCl2 · 4H20(1.81 mg) , ZnS04 · 7H2O(0.222mg), CuS04 · 5H20(0.079 mg)및 Co(N03)2 · 6H20(0.0494 mg/lL)를 포함하는 BGᅳ 11 배지에서 배양하였다. 배양된 녹조생물을 105세포 /mL의 농도로 24 웰 마이크로 타이트레이트 플레이트에 접종한 뒤 상기 제조예 2에서 제조된 수용성 유리 아민 키토산을 웰당 12 mg/mL의 농도로 상기 녹조생물이 접종된 플레이트에 주입하여 22°C에서 2시간 동안 배양하였다.또한， 수용성 유리 아민 키토산을 함유하지 않는 BG-11배지를 수용성 유리 아민 키토산 대신 첨가하여 무처리군으로 사용하였다. 배양 후， 가시화하기 위하여 광학과 형광 현미경상에서 관찰하였으며， 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다. 도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이， 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 녹'조유발 조류에 대항 항조류 활성이 있는 것을 알 수 있다. 보다 구체적으로 녹조류 생물의 살아있는 상태에서는 자체적으로 형광을 발하고， 죽은 상태에서는 형광을 발하지 않는 성질을 이용한 형광 현미경 관찰 결과, 무처리군의 경우 생물의 수가 유지되고 외형적으로 변화가 없는 반면, 제조예 2에서 제조된 수용성 유리 아민 키토산을 처리한 경우 형광이 발하는 정도가 무처리군과 대비하여 현저히 감소할 뿐만 아니라， 개체수의 증가가 관찰되지 않았다. 이로부터， 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 녹조유발 조류의 사멸을 초래함을 알 수 있다. 따라서， 본 발명에 따른 20 kDa 내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산은 녹조유발 조류에 대하여 항조류 활성이 우수하여， 녹조를 감소 및 증식을 억제하는 효과가 뛰어나므로， 이를 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물은 고형화된 댐，저수지,호수，골프장 해저드 연못，민물 양식장，낚시터 등과 같은 담수 생태계에 안전한 항녹조용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
<실험예 3>담수 생물에 대한 세포독성 평가
본 발명에 따른 20 kDa 내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산의 담수 생물에 대한 세포독성을 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 먼저， 담수 생물인 붕어로부터 혈액을 채취한 후 헤파린으로 혈액웅고를 방지하고 적혈구 세포를 분리하였다. 분리된 적혈구의 농도를 8%로 조절한 후 제조예 1， 제조예 2 및 비교예 1 내지 비교예 5에서 제조된 각 수용성 유리 아민 키토산을 10 mg/mL에서 2배씩 희석하여 처리하였다. 2시간 후， 상층액을 분리하여 유리된 헤모글로빈의 수치를 마이크로 플레이트 리더기를 통해 측정하여 적혈구 용혈를을 구하였으며， 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이， 본 발명에 따른 20 kDa내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산은 담수 생물에 대한 세포독성이 없는 것을 알 수 있다. 보다 구체적으로， 본 발명에 따른 제조예 1 및 제조예 2에서 제조된 수용성 유리 아민 키토산은 농도에 상관없이 5% 미만의 낮은 용혈률을 나타내는 것으로 나타났다. 반면， 비교예 5에서 제조된 분자량이 100 kDa을 초과하는 수용성 유리 아민 키토산의 경우 낮은 농도에서도 높은 용혈률을 나타내는 것으로 확인되었다. 이로부터， 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 세포독성이 없어 담수 생물에 대하여 안전한 것을 알 수 있다. 따라서， 본 발명에 따른 20 kDa 내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산은 녹조유발 조류에 대하여 항조류 활성이 우수할 뿐만 아니라， 세포독성이 없어 담수 생물에 대한 안전성이 높으며, 이로 인하여 2차 생태계 문제를 발생되지 않으므로， 이를 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물은 고형화된 댐， 저수지， 호수， 골프장 헤저드， 연못, 민물 양식장， 낚시터 등과 같은 담수 생태계에 안전한 항녹조용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. <실험예 수용성 유리 아민 키토산의 녹조제거 효과평가 1
본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산의 녹조 제거 효과를 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 티플라스크에 상기 실험예 1과 동일한 배양조건에서 전배양된 마이크로시스티스 아에루지노사 aeruginosa) 및 시네더스머스 오빌리쿼스 (5ce/7«fes/w/s obliQuus)를 106세포 이상을 주입하고 제조예 2에서 제조된 수용성 유리 아민 키토산을 24 mg/L을 처리한 후， 6시간 마다 녹조유발 조류의 세포수를 헤모사이토메터 (hemocytometer)를 이용하여 측정하고， 24시간 이후 물의 탁도 변화를 관찰하였다. 이때， 수용성 유리 아민 키토산을 함유하지 않는 배지를 무처리군^로 사용하였으며 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다. 도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이， 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 녹조유발 조류인 마이크로시스티스 아에루지노사
aeruginosa) 및 시네더스머스 오빌리쿼스 ( e/7ectes?i/s ob//Qi/i/s)에 대하여 뛰어난 항조류 활성을 나타내는 것을 알 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산을 처리하지 않은 무처리군은 물의 탁도가 높아 현탁할 뿐만 아니라， 녹조유발 조류인 마이크로시스티스 아에루지노사 (Wcrocysi/s aeruginosa) 및 시네더스머스 오빌리쿼스 (5cai«fes s ob//<?w/s)의 개체수가 증가된 반면， 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산이 처뫼된 경우 물의 탁도가 낮아져 맑은 것을 관찰할 수 있었으몌 플라스크 바닥에 죽은 조류들이 침전되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 이로부터，본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 녹조유발 조류에 대하여 높은 항조류 활성이 있는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 20 kDa 내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산은 녹조유발 조류에 대하여 항조류 활성이 우수하여， 녹조를 감소 및 증식을 억제하는 효과가 뛰어나고， 이로 인하여 녹조가 발생된 물에 대한 녹조 제거 효과가 상당히 우수하므로， 이를 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물은 고형화된 댐，저수지，호수，골프장 헤저드， 연못,민물 양식장ᅳ낚시터 등과 같은 담수 생태계에 안전한 항녹조용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. <실험예 5>수용성 유리 아민 키토산의 녹조제거 효과평가 2
본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산의 실제 녹조가 발생된 담수에 대한 녹조 제거 효과를 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 먼저， 녹조가 심한 인근의 연못의 물을 700 L를 채취하여 수조로 옮겼다. 그 후 본 발명에 따른 제조예 2에서 제조된 수용성 유리 아민 키토산을 60 mg/mL처리하고， 1시간 및 12시간이 경과한 후의 수조 내 물 상태를 촬영하였다. 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다. 도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이， 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 실제 녹조가 발생된 연못물 내에 존재하는 녹조유발 조류에 대해서도 항조류 활성이 우수한 것을 알 수 있다. 보다 구체적으로， 도 6으로부터 본 발명에 따른 제조예 2의 수용성 유리 아민 키토산을 처리하고 1시간이 경과한 후에 연못물 내에 존재하는 녹조유발 조류가 사멸하여 침전되기 시작하는 것으로 나타났다. 또한， 도 7로부터 수용성 유리 아민 키토산올 처리하고 12시간이 경과한 후에는 녹조유발 조류가 모두 사멸하여 모두 침전되고， 연못물의 탁도가 상당히 맑아진 것을 확인할 수 있다. 이로부터， 본 발명에 따른 수용성 유리 아민 키토산은 실제 녹조가 발생된 담수에 대하여 녹조를 제거하는 효과가 우수한 것을 알 수 있다. 따라서， 본 발명에 따른 20 kDa 내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산은 녹조유발 조류에 대하여 항조류 활성이 우수하여， 녹조를 감소 및 증식을 억제하는 효과가 뛰어나고， 이로 인하여 실제 녹조가 발생된 담수에 대한 녹조 제거 효과가 탁월하므로， 이를 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물은 고형화된 댐，저수지,호수，골프장 해저드， 연못， 민물 양식장，낚시터 등과 같은 담수 생태계에 안전한 항녹조용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
녹조유발 조류에 항조류 활성을 갖는 분자량이 20 KDa 내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물 .
【청구항 2】
제 1항에 있어서，
상기 항녹조용 조성물은 마이크로시스티스 아에루지노사 ( /crocys /s aeruginosa) , 入 1네더스머스 오빌리춰스 ( Scenedesmus obi iquus)， 클로렐라 불가리스 ¾/0/^//3 vulgaris)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 녹조유발 조류에 대하여 항조류 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 항녹조용 조성물 .
【청구항 3】
녹조유발 조류에 항조류 활성을 갖는 분자량이 20 KDa 내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산올 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물올 녹조 발생 수역에 살포하여 녹조를 제거하는 방법 .
【청구항 4】
제 3항에 있어서 , 상기 녹조를 제거 하는 방법은 마이크로시스티스 ό}에루지노人 ( Mi crocys t is aeruginosa) , 시 네더스머스 오빌리 춰스 ( Scenedesmus obi iquus) , 클로렐라 불가리스 /ore//a vulgar is)로 이루어 진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 녹조유발 조류를 제거하여 수행되는 것을 특¾으로 하는 녹조를 제거하는 방법 . "
【청구항 5】 - 녹조유발 조류에 항조류 활성을 갖는 분자량이 20 KDa 내지 100 kDa인 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물의 용도 .
PCT/KR2014/002600 2013-04-10 2014-03-27 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물 및 이를이용한 녹조 제거방법 WO2014168356A1 (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201480011416.1A CN105072904B (zh) 2013-04-10 2014-03-27 包含水溶性游离胺壳聚糖作为活性成分的抗藻华组合物和使用该组合物消除藻华的方法
JP2016507880A JP6140361B2 (ja) 2013-04-10 2014-03-27 水溶性遊離アミンキトサンを含有する防緑藻組成物及び該組成物を用いて緑藻を除去する方法
US14/872,032 US9808005B2 (en) 2013-04-10 2015-09-30 Anti-algal bloom composition containing water-soluble free amine chitosan as active ingredient, and method for removing algal-bloom using same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130039379A KR101457478B1 (ko) 2013-04-10 2013-04-10 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물 및 이를 이용한 녹조 제거방법
KR10-2013-0039379 2013-04-10

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US14/872,032 Continuation US9808005B2 (en) 2013-04-10 2015-09-30 Anti-algal bloom composition containing water-soluble free amine chitosan as active ingredient, and method for removing algal-bloom using same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014168356A1 true WO2014168356A1 (ko) 2014-10-16

Family

ID=51689725

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2014/002600 WO2014168356A1 (ko) 2013-04-10 2014-03-27 수용성 유리 아민 키토산을 유효성분으로 함유하는 항녹조용 조성물 및 이를이용한 녹조 제거방법

Country Status (5)

Country Link
US (1) US9808005B2 (ko)
JP (1) JP6140361B2 (ko)
KR (1) KR101457478B1 (ko)
CN (1) CN105072904B (ko)
WO (1) WO2014168356A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018208118A3 (ko) * 2017-05-11 2019-01-10 순천대학교 산학협력단 부유성 녹조 응집 조성물 및 이를 이용한 녹조의 제거 방법

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106044878B (zh) * 2016-06-30 2019-04-16 杭州瑞藻科技有限公司 一种蓝藻处理剂及其使用方法和应用
CN106800623B (zh) * 2017-03-01 2018-11-27 苏州瑞科四通新材料有限公司 一种阴离子型抗藻复合膜
KR102045926B1 (ko) 2017-12-27 2019-11-18 한국기초과학지원연구원 녹조 응집 촉진용 조성물

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030026191A (ko) * 2001-09-25 2003-03-31 나재운 수용성 유리 아민 키토산의 제조방법
JP2007246425A (ja) * 2006-03-15 2007-09-27 Dainichiseika Color & Chem Mfg Co Ltd 防藻剤および防藻方法
KR20110023307A (ko) * 2009-08-31 2011-03-08 다이나믹(주) 적조유발 조류에 항적조 활성을 갖는 수용성 유리 아민 키토산, 이를 유효성분으로 함유하는 항적조제 및 이를 이용한 적조 제거방법

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07116642A (ja) * 1993-10-20 1995-05-09 Seisuke Tanabe 水質浄化液の製造方法
WO2003035700A1 (en) * 2001-09-25 2003-05-01 Jae Woon Nah Method for preparing water-soluble free amine chitosan
GB2436745B8 (en) * 2005-09-09 2019-03-13 Jae Woon Nah Method for enhancing the solubility of paclitaxel
US20090280984A1 (en) * 2008-05-06 2009-11-12 Iteq Corporation Method of Inhibiting the Growth of Algae

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030026191A (ko) * 2001-09-25 2003-03-31 나재운 수용성 유리 아민 키토산의 제조방법
JP2007246425A (ja) * 2006-03-15 2007-09-27 Dainichiseika Color & Chem Mfg Co Ltd 防藻剤および防藻方法
KR20110023307A (ko) * 2009-08-31 2011-03-08 다이나믹(주) 적조유발 조류에 항적조 활성을 갖는 수용성 유리 아민 키토산, 이를 유효성분으로 함유하는 항적조제 및 이를 이용한 적조 제거방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZOU, H. ET AL.: "Removal of cyanobacterial blooms in Taihu lake using local soils. II. Effective removal of Microcystis aemginosa using local soils and sediments modified by chitosan", ENVIRONMENTAL POLLUTION, vol. 141, 2006, pages 201 - 205 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018208118A3 (ko) * 2017-05-11 2019-01-10 순천대학교 산학협력단 부유성 녹조 응집 조성물 및 이를 이용한 녹조의 제거 방법

Also Published As

Publication number Publication date
US20160021880A1 (en) 2016-01-28
KR101457478B1 (ko) 2014-11-06
JP6140361B2 (ja) 2017-05-31
CN105072904B (zh) 2018-02-13
KR20140123130A (ko) 2014-10-22
US9808005B2 (en) 2017-11-07
JP2016518360A (ja) 2016-06-23
CN105072904A (zh) 2015-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Park et al. Economic impact, management and mitigation of red tides in Korea
Nan et al. Allelopathic effects of Ulva lactuca on selected species of harmful bloom-forming microalgae in laboratory cultures
Villacorte Algal blooms and membrane based desalination technology
US9808005B2 (en) Anti-algal bloom composition containing water-soluble free amine chitosan as active ingredient, and method for removing algal-bloom using same
Tang et al. Chemical prevention and control of the green tide and fouling organism ulva: Key chemicals, mechanisms, and applications
CN101462799B (zh) 贝藻复合生态系统对污染海水的修复方法
WO2014005253A1 (zh) 一种蓝藻的防治方法
CN102838221B (zh) 一种海洋水产养殖用水、制备方法和用途
CN104445454A (zh) 一种酸性白土蓝藻处理剂及其制备方法
CN107265653A (zh) 一种利用鱼类与底栖动物协同促进沉水植物生长的方法
CN101289240B (zh) 一种藻华去除处理剂及处理方法
KR101971250B1 (ko) 알렉산드리움 타마렌스 및 코클로디니움 폴리크리코이데스에 대해 살조 활성을 가지는 올레야 속 m5a2m 균주 및 이의 용도
KR101977222B1 (ko) 달걀껍질 분말을 포함하는 녹조 제거제 및 이의 제조방법
Gennaro et al. Reduction of land based fish-farming impact by phytotreatment pond system in a marginal lagoon area
CN101891275A (zh) 一种控制微囊藻水华的方法
Eljaddi et al. Ultrafiltration to secure shellfish industrial activities: Culture of microalgae and oyster fertilization
KR20110023307A (ko) 적조유발 조류에 항적조 활성을 갖는 수용성 유리 아민 키토산, 이를 유효성분으로 함유하는 항적조제 및 이를 이용한 적조 제거방법
KR20130085858A (ko) 조류발생억제용 조성물 및 그 제조 방법
KR20120138484A (ko) 패류 종묘 생산용 배양 기질
Chowdhury et al. Algicidal activity of the brown seaweed, Ecklonia cava against red tide microalgae
RU2541444C1 (ru) Способ мелиорации прибрежных экосистем
CN103782928A (zh) 公共淡水水域移殖放流海水鲻鱼方法
CN108862527B (zh) 浮游性绿藻絮凝组合物及利用其的绿藻去除方法
KR102274556B1 (ko) 유해 조류 제거용 조성물 및 이를 이용하여 제조되는 블록
CN101234807A (zh) 抗菌防臭纤维织物在杀灭藻类中的用途

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201480011416.1

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14782195

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016507880

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 14782195

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1