CN1289533C

CN1289533C - 用于制备水溶性游离胺脱乙酰壳多糖的方法

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Publication number: CN1289533C
Application number: CN02823379.4A
Authority: CN
Inventors: 罗在云; 郑特来; 张美卿; 崔昌镛; 金元锡; 孔炳起; 丁映日; 梁铉弼; 张智泰
Original assignee: Individual
Current assignee: ZHENG TELAI
Priority date: 2001-09-25
Filing date: 2002-04-16
Publication date: 2006-12-13
Anticipated expiration: 2022-04-16
Also published as: GB0411665D0; GB2397304B; GB2397304A8; GB2397304B8; GB2397304A; US7345165B2; CN1592757A; WO2003035700A1; US20040260077A1

Abstract

一种制备具有高纯度和生物活性的水溶性脱乙酰壳多糖的方法，包括以下步骤：在磷酸盐缓冲的盐水中，将与有机或无机酸共价键接的脱乙酰壳多糖寡糖酸盐与三烷基胺反应，随后加入有机溶剂以除去C-2位的酸盐；将由此得到的反应混合物加到无机酸中以除去C-6位的三烷基胺盐；和将由此得到的带有游离胺的脱乙酰壳多糖通过活性炭/离子交换树脂。该游离胺脱乙酰壳多糖是水溶性的并具有高的生物利用度以应用到医药和食品工业。

Description

用于制备水溶性游离胺脱乙酰壳多糖的方法

发明领域

本发明涉及一种制备高纯度水溶性游离胺脱乙酰壳多糖的方法。

发明背景

脱乙酰壳多糖是具有吡喃糖单元的β-(1，4)-D-葡糖胺的高度不溶N-乙酰化聚合物和具有超过100万道尔顿的高分子量生物聚合物，该生物聚合物键接到超过5,000个葡糖胺单元的官能团。脱乙酰壳多糖是存在于真菌壁和节肢动物包括昆虫、螃蟹、小虾和龙虾的外骨骼中的纤维素状聚合物。具有与纤维素相似的结构单元的脱乙酰壳多糖，由于其高的生物利用度和对免疫反应的负效应，可以应用于许多医药工业领域。自从FDA(美国)将脱乙酰壳多糖认作食物添加剂以来，脱乙酰壳多糖已经作为重要的生物医学材料应用于生物工程。

例如，脱乙酰壳多糖可以用于各种工业应用，包括废水处理(作为促凝剂、重金属吸收剂和废染料澄清剂)和应用于农业(作为土壤调节杀虫剂、植物抗病毒剂和农用化学试剂)。

近来，由于已知脱乙酰壳多糖具有20,000～100,000的分子量与高物理活性，脱乙酰壳多糖的应用延伸到包括食品和饮料、保健和卫生、化妆品、纺织品以及药品的实用领域。由于脱乙酰壳多糖是与水不混溶的并且即使当溶于水时会增加粘性，在这些应用中，脱乙酰壳多糖的溶解度和粘度被认为是主要的问题因素。因此，迫切需要提供没有上述问题的水溶性脱乙酰壳多糖。

在本文中，水溶性脱乙酰壳多糖由于其能应用到上述实用领域而已经受到相当大的注意。

在食品工业中，尤其是健康食品，水溶性脱乙酰壳多糖展现出多种不同的物理特性，包括降低胆固醇、增强免疫反应、改善肝功能、消化道的吸收，以及控制血糖水平和血压。另外，脱乙酰壳多糖的独特能力，例如除去皮肤废物、优良的热量保存性、增湿性、抗菌活性和活化皮肤细胞，已经导致其在化妆品工业中在如下产品中作为主要成分使用：例如香波、护发素、发胶、发凝胶、膏、浴液、面霜和洗脸液。而且，对于以喷雾剂形式给药的产品的应用，脱乙酰壳多糖的水溶性是必需的，以使得脱乙酰壳多糖能够容易地渗透内表皮细胞壁来阻止粘度的增加。

另外，水溶性脱乙酰壳多糖可以用作药物载体例如骨质疏松药剂、抗风湿治疗剂和重金属去除剂，其实质上依靠高的生物活性和水溶性在体内起作用。作为药物载体，水溶性脱乙酰壳多糖被制备成各种形式包括药片、胶囊、药丸、混悬液、溶液以及口服和注射乳剂。

然而，由于在脱乙酰壳多糖的相邻原子间存在强的氢键，需要强酸包括有机酸(例如乳酸、乙酸、丙酸和酒石酸)和无机酸(例如盐酸、硝酸和硫酸)以溶解脱乙酰壳多糖。同时，这些强酸的毒性使得应用到医药领域出现了另一个问题。

有两种不同的方法制备水溶性脱乙酰壳多糖：化学方法和酶方法。

在化学方法中，建议使用盐酸通过水解制备水溶性脱乙酰壳多糖。然而，该方法需要过多量的HCl和过长的时间以水解脱乙酰壳多糖。作为另一种已知的化学方法，同样建议通过用其他部分取代脱乙酰壳多糖C-2位的胺部分或者通过形成胺盐例如-NH₃ ⁺·CH₃CHOHCOO^-、-NH₃ ⁺·CH₃COO^-、-NH₃ ⁺·Cl^-、-NH₃ ⁺CH₃CH₂COO^-、-NH₃ ⁺·HCOO^-或-NH₃ ⁺·HOOC(CHOH₂)COO^-来得到水溶性脱乙酰壳多糖。该方法的优点在于制备的水溶性脱乙酰壳多糖不会进一步降低分子量以使得能够在本领域中广泛使用。然而，通过该方法得到的水溶性脱乙酰壳多糖的缺点在于难以溶于pH1.2～1.5的胃和肠管，因为含脱乙酰壳多糖盐的水溶液显示出pH为3.0，基于1.0％溶液。

相反，在酶方法中通过包括以下步骤的酶处理制备水溶性脱乙酰壳多糖：将脱乙酰壳多糖溶于弱酸溶液；通过酶处理水解约24小时；冷冻干燥接着包装。由于进行干燥过程不经过额外的纯化，含酸的最终产品由于酸的毒性在给药时会产生问题。

因此，需要解决上述问题的制备水溶性脱乙酰壳多糖的方法，即，有效的除去剩余杂质和酸盐。作为实现这种方法的一种尝试，韩国专利No.2000-15959公开了除去剩余盐和不舒适气味的方法，包括酶解随后形成含水的脱乙酰壳多糖寡糖溶液，并将得到的溶液通过阴离子交换树脂。然而，上述公开的内容既没有描述也没有暗示具有高纯度的脱乙酰壳多糖的特性。

因此，本发明设法实现一种适于生物医学工程应用的具有高生物活性和高纯度的水溶性脱乙酰壳多糖。

发明概述

本发明的一个目的是提供一种制备水溶性游离胺脱乙酰壳多糖的方法。

本发明的另一目的是提供具有高产量和纯度的水溶性游离胺脱乙酰壳多糖。

本发明的更进一步的目的是提供具有高生理活性的水溶性游离胺脱乙酰壳多糖。

因此，本发明提供一种制备水溶性游离胺脱乙酰壳多糖的方法，包括下列步骤：

(a)在磷酸盐缓冲的盐水中，将与有机或无机酸共价键接的脱乙酰壳多糖寡糖酸盐与三烷基胺反应，随后加入有机溶剂以除去C-2位的酸盐；

(b)将由此得到的反应混合物加到无机酸中以除去C-6位的三烷基胺盐；和

(c)将由此得到的带有游离胺的脱乙酰壳多糖通过活性炭/离子交换树脂。

根据本发明的水溶性游离胺脱乙酰壳多糖在各种定性和定量分析中分子量为1,000-100,000道尔顿。

发明详述

参照图1，水溶性游离胺脱乙酰壳多糖(500)通过以下方式制备：作为初始原料的脱乙酰壳多糖寡糖酸盐(100)与三烷基胺反应，随后加入有机溶剂以除去C-2位的酸盐(200)；加入无机酸以除去C-6位的三烷基胺(300)；和纯化(400)。

在步骤(a)中，反应通过脱乙酰壳多糖寡糖酸盐与三烷基胺在磷酸盐缓冲的盐水中反应而进行。然后，得到的反应混合物溶于合适的有机溶剂，随后进行后处理以除去酸盐。

在优选的实施方案中，通过将脱乙酰壳多糖溶于合适的酸而制备作为初始原料的脱乙酰壳多糖寡糖酸盐。随后是已知的酶解方法，由此通过已知的酶处理得到的脱乙酰壳多糖溶液。酶来源于微生物以转化脱乙酰壳多糖寡糖，可以包括取自Bacillus pumilus、Bacillus subtilis或Bacillus sp的脱乙酰壳多糖酶(chitosanase)。在上述方法中，脱乙酰壳多糖寡糖酸盐作为在C-2位的胺和在C-6位的-CH₂OH与酸盐的络合物存在。

合适的酸的例子包括有机酸(例如乳酸、乙酸、丙酸、甲酸、抗坏血酸和酒石酸)和无机酸(例如盐酸、硝酸和硫酸)。当使用乳酸时，在脱乙酰壳多糖寡糖酸C-2位的胺基表示为-NH₃ ⁺·CH₃CHOHCOO^-，其他的如下。

有机酸	胺酸盐
有机酸	胺酸盐	乙酸丙酸甲酸抗坏血酸酒石酸	-NH₃ ⁺·CH₃COO^--NH₃ ⁺·CH₃CH₂COO^--NH₃ ⁺·HCOO^--NH₃ ⁺·CO(COH)₃CHOHCH₂O^--NH₃ ⁺·HOOC(CHOH₂)COO^-
无机酸	胺酸盐	乙酸丙酸甲酸抗坏血酸酒石酸
无机酸	胺酸盐	盐酸硝酸硫酸	-NH₃ ⁺Cl^--NH₃ ⁺·NO₃ ^--NH₃ ⁺·HSO₄ ^-

在步骤(a)中，使用三烷基胺以除去键接到C-2位的胺基上的有机/无机酸，并保护在脱乙酰壳多糖寡糖酸盐C-6位的-CH₂OH基团。

从而，三烷基胺与表现出强酸性的脱乙酰壳多糖低聚酸盐反应，三烷基胺中的胺基与脱乙酰壳多糖寡糖酸盐胺基上的H⁺相互作用，被有机/无机酸的碱性基团如CH₃CHOHCOO^-、CH₃COO^-和Cl^-取代。因此，在脱乙酰壳多糖寡糖的C-2位存在游离胺，并在C-6位上保留了由三烷基胺保护的-CH₂OH基团。

在脱乙酰壳多糖寡糖的C-2和C-6位使用相对于1份胺基为2-3份(优选2份)的三烷基胺，以有效地除去键接到脱乙酰壳多糖寡糖上的有机/无机酸盐。合适的三烷基胺包括C₁～C₄三烷基胺，并优选三甲基胺、三乙基胺、三丙基胺、三异丙基乙基胺或三丁基胺，最优选三乙基胺。

在优选实施方案中，在室温下，在pH为6.8-7.4，优选6.8、7.0、7.2或7.4的磷酸盐缓冲的盐水中将步骤(a)中的反应进行约1-3小时，优选2小时。

然后，在步骤(b)中将反应混合物溶于合适的有机溶剂以除去C-6位的酸盐和未反应的化合物。合适的有机溶剂的例子包括丙酮；醇类例如甲醇、乙醇和丙醇；碳氯化物例如氯仿和二氯甲烷。随后进行已知的后处理方法例如空气干燥或冷冻干燥。这里，空气干燥或冷冻干燥过程分别是在1-30℃或低于-54℃的温度进行。

在步骤(b)中，将无机酸加到步骤(a)得到的反应混合物中，以除去在C-6位的三烷基胺盐和未反应的三乙基胺。

在除去脱乙酰壳多糖寡糖C-6位的三烷基胺后，可以获得在C-2位的游离胺和在C-6位具有-CH₂OH基团的结构的脱乙酰壳多糖。

经采用的无机酸是0.0005～0.6N的盐酸、硝酸或硫酸。优选使用0.0010N的盐酸。

在优选实施方案中，步骤(b)中的反应在室温下进行约1-2小时。

在步骤(c)中，将得到的脱乙酰壳多糖通过活性炭/离子交换树脂而纯化。然后，在生成物上进行上述常规干燥过程。这里，离子交换树脂可以是阴离子交换树脂、阳离子交换树脂、两性交换树脂或非离子交换树脂。

随后，接着进行已知的后处理方法例如空气干燥或冷冻干燥，优选冷冻干燥。这里，空气干燥或冷冻干燥过程分别在1-30℃或低于-54℃的温度进行。

在另一个优选实施方案中，使用FT-IR、¹H-NMR和¹³C-NMR技术检验得到的游离胺脱乙酰壳多糖，发现是水溶性的。

如图2B中所示，相对于图2A而言，来源于有机酸例如乳酸、乙酸、丙酸或酒石酸的C＝O峰(1730cm^-1)消失。同时，清楚表明水溶性脱乙酰壳多糖的酰胺I(C(＝O)NH)和胺(-NH₂)峰分别在1635cm^-1和1539cm^-1出现。另外，在2100cm^-1的杂质峰显著降低。

在¹H-NMR光谱中，发现来源于有机酸的约d 1.125-1.360ppm的峰和杂质峰消失(参见图3A和3B)，这与上述FT-IR分析的趋势相同。¹H-NMR光谱分析也定量地证实了乙酰胺中存在的氢的量。

在¹³C-NMR光谱中，发现来源于有机酸的峰(C＝O)和杂质的峰明显地消失(参见图4A和4B)。¹³C-NMR光谱分析也定量地证实了分别在乙酰胺和酰胺中存在的氢的量。从该光谱测定结果中，可以发现根据本发明的水溶性游离胺脱乙酰壳多糖不含任何有机/无机酸并且是高纯度的。

图5表明在质量分析中，相邻峰对的差值与脱乙酰壳多糖的葡糖胺重复单元相等。

如图6～8所示，证实本发明的水溶性脱乙酰壳多糖分子量为1,000-100,000，并显示出生理活性。

如上所述，根据本发明方法的脱乙酰壳多糖的水溶性能够有效地提高，这是由于与通过现有技术例如盐形成而制备的相比，其在脱乙酰壳多糖中含有带高度正电荷的游离胺。另外，由于本发明的脱乙酰壳多糖具有达到生理活性的分子量，其可以优选应用于医药应用。例如，本发明的脱乙酰壳多糖共价键接到带负电荷的基因或DNA上，以使得其可以容易地作为能够治疗基于基因缺陷的疾病或不能治愈的疾病的基因载体使用。另外，也期待作为下一代生物医学材料用于生物工程的应用。

附图简述

附图帮助进一步理解本发明，并且构成本申请的一部分，阐明本发明的实施方案，并与说明书一起用来解释本发明的原理。在附图中：

图1是表示制备根据本发明的水溶性游离胺脱乙酰壳多糖的方法的流程图；

图2A表示脱乙酰壳多糖寡糖酸盐的FT-IR光谱分析图；

图2B表示除去酸盐的游离胺脱乙酰壳多糖的FT-IR光谱分析图；

图3A表示带有酸盐的脱乙酰壳多糖寡糖的¹H-NMR光谱分析图；

图3B表示除去酸盐的脱乙酰壳多糖寡糖的¹H-NMR光谱分析图；

图4A表示带有酸盐的脱乙酰壳多糖寡糖的¹³C-NMR光谱分析图；

图4B表示本发明的游离胺脱乙酰壳多糖的¹³C-NMR光谱分析图；

图5表示本发明的游离胺脱乙酰壳多糖的质谱分析图；和

图6-8是本发明的游离胺脱乙酰壳多糖的根据Huggins方程和Kraemer方程的分子量示意图。

通过下列实施例将更完全地理解本发明，而不认为这些实施例限定了本发明的范围。

<实施例1>水溶性游离胺脱乙酰壳多糖的制备

预步骤：脱乙酰壳多糖寡糖的制备

将5单位的来自Bacillus pumilus BN-262的脱乙酰壳多糖酶加到溶于乳酸的100ml 5％脱乙酰壳多糖溶液(pH5.0～5.5)中，并在40℃反应36小时。在反应完成之后，反应混合物通过1μm滤纸预过滤并随后使用中空过滤器过滤(MW 20,000)[“MW”是分子量的缩写]。这样得到的滤液通过毫微过滤体系浓缩，灭菌，然后空气干燥，得到在C-2和C-6位乳酸保护的粉末脱乙酰壳多糖寡糖。

步骤(a)：在C-2位乳酸保护的脱乙酰壳多糖寡糖酸盐的制备

将含有脱乙酰壳多糖寡糖的1升磷酸盐缓冲盐水(pH7.0)缓慢滴入到0.52升三乙基胺中。反应在室温进行2小时，使用两份三乙基胺与1份脱乙酰壳多糖寡糖的胺。在搅拌的同时将丙酮加到这样得到的反应混合物中，然后在4℃将生成物在15,000rpm离心分离(使用Supra 30K)20分钟。在该过程重复三次后，在室温进行空气干燥，随后在低于-54℃的温度冷冻干燥，从而制备出在C-2位含有乳酸和在C-6位含有-CH₂OH基团的脱乙酰壳多糖寡糖酸盐。

步骤b)：在C-2位的游离胺脱乙酰壳多糖的制备

将50ml 0.0010N的盐酸加入到步骤(a)得到的脱乙酰壳多糖寡糖盐中，生成物反应2小时。在搅拌的同时将丙酮加到这样得到的反应混合物中，然后进行上述离心分离。该过程重复三次后，在室温进行空气干燥，接着在低于-54℃的温度冷冻干燥。

步骤c)：纯化

将步骤b)中制备的干燥产品溶于二次蒸馏水中，将该蒸馏水通过含有活性炭的离子交换柱，然后干燥，得到白色游离胺脱乙酰壳多糖。

FT-IR光谱分析

为了将根据本发明的方法制备的脱乙酰壳多糖与含有有机/无机酸的脱乙酰壳多糖寡糖比较，进行如下FT-IR分析。

将3毫克如实施例1中制备的游离胺脱乙酰壳多糖和脱乙酰壳多糖寡糖与300mg溴化钾混合，置于玛瑙研钵上面并捣碎10分钟，模制成小球。在60℃下减压通过FT-IR分析(使用由Shimadzu制造的8700)测定每一个小球。

图2A和2B分别表示按照实施例1的步骤1制备的在C-2和C-6位乳酸保护的脱乙酰壳多糖寡糖酸盐，和按照实施例1的步骤3制备的游离胺脱乙酰壳多糖的FT-IR光谱。

如图2A所示，可以看出乳酸的羧基和酶解中产生的杂质峰分别在约1730cm^-1和2100cm^-1(A＝0.038)。

相反，如图2B所示，与图2A相比乳酸的C＝O峰(1730cm^-1)几乎消失，杂质峰(2100cm^-1，A＝0.024)明显降低。另外，由于氢键减弱，酰胺I(-C＝O)和胺(-NH₂)的尖峰分别在约1635cm^-1和1539cm^-1出现。这些结果表明：根据本发明的方法，由于完全除去了键接到-CH₂OH上的酸盐和在C-6位上的胺，游离胺脱乙酰壳多糖不含有任何属于有机酸的乳酸。

¹H-NMR光谱分析

为了将根据本发明的方法制备的游离胺脱乙酰壳多糖与脱乙酰壳多糖寡糖相比较，进行如下¹H-NMR分析。

将10毫克按照实施例1的步骤1制备的脱乙酰壳多糖寡糖(0.54mmol)溶于D₂O中，然后通过¹H-NMR光谱分析仪(使用由Bruker制造的DRX-500)测定。以同样的方式测定按照实施例1的步骤3制备的游离胺脱乙酰壳多糖。

图3A和3B分别表示有和没有酸盐的脱乙酰壳多糖寡糖的¹H-NMR光谱。

在图3A中，可以看出乳酸强峰出现在约d 1.125～1.360ppm，然而其他峰由于杂质而不能确定。

然而，图3B显示乳酸峰消失，杂质峰明显降低。这定量地证实了在C-1位的一个质子(H-1)在4.730、4.684和4.623ppm出现三重峰。由于葡糖胺单元中具有高负电性的氧原子，在邻近氧原子的C-1位的质子共振处于低场，因此，所述质子在4.730～4.623ppm处裂分为三重峰，而环烷烃的质子照常出现在0～2ppm。键接到羰基上的甲基基团的三个质子也在约2.020ppm处出现有点尖的单峰。该峰强度表明：来源于原料几丁质单元的乙酰胺基团定量地存在。另外，在C-2、C-3、C-4、C-5和C-6位的六个质子(H-2、H-3、H-4和H-5)也在约3.411～3.909ppm处出现。具体地，由于氢键减弱，在C-2位的H-2峰在d 3.910ppm分开到3.888ppm。同样，定量地发现每一个H-3、H-4、H-5和H-6都裂分成单峰或双重峰。

另外，在图3A和3B中，由于NMR溶剂在2.875ppm处出现的亚甲基基团的质子峰是可以忽略的。

¹³C-NMR光谱分析

为了将根据本发明的游离胺脱乙酰壳多糖与脱乙酰壳多糖寡糖相比较，进行如下¹³C-NMR分析。

将10毫克按照实施例1的步骤1制备的脱乙酰壳多糖寡糖(0.54mmol)溶于D₂O中，然后通过¹³C-NMR光谱分析仪(使用由Bruker制造的DRX-500)测定。以同样的方式测定按照实施例1的步骤3制备的游离胺脱乙酰壳多糖。

图4A和4B分别表示有和没有酸盐的脱乙酰壳多糖寡糖的¹³C-NMR光谱。

如图4A所示，在约20ppm处明显地出现乳酸强峰，然而其他峰由于杂质而不能确定。

然而，图4B定量地显示出由本发明(实施例1的步骤3)的方法制备的游离胺脱乙酰壳多糖的碳原子和作为原料的残留几丁质单元。定量地，游离胺脱乙酰壳多糖的碳原子峰(C-1、C-2、C-3、C-4、C-5和C-6位)在约55.298～100.699ppm出现。由于葡糖胺单元中具有高负电性的氧原子，在邻近氧原子的C-1位的碳共振处于低场，因此，所述碳的峰在99.149ppm出现，而具有sp³的碳照常出现在8～60ppm。与图4A相比，杂质峰显著降低。另外，定性地发现键接到羰基上的酰胺I和酰胺III的峰分别在21.520ppm和173.995ppm出现，其来源于几丁质单元的乙酰胺。

该结果表明：当完全考虑到93％脱乙酰度和18,579道尔顿的游离胺脱乙酰壳多糖时，存在7％的几丁质单元残余物。

从这些结果可以看出根据本发明的水溶性游离胺脱乙酰壳多糖不包括任何有机/无机酸并且是高纯度的。

质量分析

为了测量葡糖胺即根据本发明的游离胺脱乙酰壳多糖的重复单元的质量，使用质谱仪(Shimadzu公司的MALDI-TOF，日本)进行质谱分析。

如图5中所示，发现按照实施例1的步骤3制备的游离胺脱乙酰壳多糖的分子量为18,579道尔顿，邻近峰对的差值平均为161。该值与脱乙酰壳多糖的葡糖胺单元的分子量相等。

分子量分析

为了测定根据本发明的方法制备的游离胺脱乙酰壳多糖的分子量，使用相关的粘度计(Vsicotek，Y 501C，美国)依照浓度测定比粘度。

引入本领域已知的Huggins′方程和Kraemer′s方程测量的值，按照实施例1的步骤3制备的游离胺脱乙酰壳多糖的分子量证实为18,579道尔顿。

<实施例2>水溶性无胺脱乙酰壳多糖的制备

以同实施例1描述的相同的方式制备水溶性游离胺脱乙酰壳多糖，不同的是使用低分子量脱乙酰壳多糖寡糖作为初始原料。

为了测定获得的游离胺脱乙酰壳多糖，以如实施例1描述的方式进行分析，包括¹H-NMR、¹³C-NMR、质量分析和分子量分析。

在包括¹H NMR和¹³C NMR的光谱分析中，证实了相似的模式。另外，发现实施例2的游离胺脱乙酰壳多糖具有1,246道尔顿的分子量(参见图7)。

<实施例3>水溶性游离胺脱乙酰壳多糖的制备

为了测定获得的游离胺脱乙酰壳多糖，以如实施例1描述的方式进行分析，包括¹H NMR、¹³C NMR、质量分析和分子量分析。

在包括¹H NMR和¹³C NMR的光谱分析中，证实了相似的模式。另外，发现实施例3的游离胺脱乙酰壳多糖具有87,753道尔顿的分子量(参见图8)。

如上所述，根据本发明的水溶性游离胺脱乙酰壳多糖通过如下方式制备：将脱乙酰壳多糖寡糖酸盐与三烷基胺反应；这样获得的反应混合物加到无机酸中以除去C-2位的酸盐；使这样得到的脱乙酰壳多糖通过活性炭/离子交换树脂。同样，发现根据本发明的水溶性游离胺脱乙酰壳多糖具有分子量为1,000～100,000道尔顿，并显示出生物活性和高纯度。运用游离胺脱乙酰壳多糖的正电荷，根据本发明的游离胺脱乙酰壳多糖因此可以用作带负电荷的DNA的基因载体，在医药工业中用于治疗由于基因缺陷的疾病，和在功能食品工业中作为主要成分使用。

在前的实施方案仅仅是示例性的，不认为限定了本发明的范围。可以容易地将本教导应用到其他种类的方法。本发明的说明书是用来说明的，并不限定权利要求的范围。对于那些本领域技术人员，许多选择、修正和变化将是显然的。

Claims

1.一种制备水溶性游离胺脱乙酰壳多糖的方法，包括以下步骤：

(a)在pH 6.8-7.4的磷酸盐缓冲的盐水中，将与有机或无机酸共价键接的脱乙酰壳多糖寡糖酸盐与C₁～C₄三烷基胺反应，随后加入有机溶剂以除去C-2位的酸盐；

(c)将由此得到的带有游离胺的脱乙酰壳多糖通过含有活性炭的离子交换树脂，

所述步骤(a)的有机酸选自乳酸、乙酸、丙酸、甲酸、抗坏血酸和酒石酸；

所述步骤(a)和(b)的无机酸分别选自盐酸、硝酸和硫酸；

所述有机溶剂选自丙酮；选自甲醇、乙醇和丙醇的醇类；和选自氯仿和二氯甲烷的碳氯化物；和

三烷基胺以相对于1摩尔份脱乙酰壳多糖寡糖酸盐的胺基为2-3摩尔份的量使用。

2.根据权利要求1的方法，其中水溶性脱乙酰壳多糖的分子量为1,000-100,000。

3.根据权利要求1的方法，其中三烷基胺选自三甲基胺、三乙基胺、三丙基胺、三异丙基乙基胺和三丁基胺。

4.根据权利要求1的方法，其中三烷基胺是三乙基胺。

5.根据权利要求1的方法，其中所述步骤(b)的无机酸为盐酸。

6.根据权利要求1的方法，其中所述步骤(b)的无机酸的浓度为0.0005-0.600摩尔/升。

7.根据权利要求1的方法，其中通过将脱乙酰壳多糖溶于有机酸或无机酸，随后通过将得到的脱乙酰壳多糖溶液酶解而制备脱乙酰壳多糖寡糖酸盐。