CN106995502B - 双功能基团改性壳聚糖衍生物及其制备方法 - Google Patents

双功能基团改性壳聚糖衍生物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种双功能基团改性壳聚糖衍生物及其制备方法。所述壳聚糖衍生物的分子结构式如式(1)所示
Figure DDA0000913470180000011
式(1)。该产品的制备方法为将壳聚糖在一定条件下分别与三氧化硫脲和精氨酸反应，得到双功能基团改性的壳聚糖衍生物。再采用去离子水透析的方法处理，去除小分子副产物或杂质，纯化样品。透析后的水溶液通过冷冻干燥的方法干燥得到最终的产品。本发明对壳聚糖双功能化改性，在壳聚糖的分子链上同时修饰上胍基和精氨酸，赋予壳聚糖良好的抗菌性能和更高的生物安全性。本制备方法反应条件温和，适合工业化生产，改性后水溶性好，抗菌效果大幅度提高，且具有良好的生物安全性，是一种高品质的天然多糖改性绿色抗菌材料，极具市场开发前景。

Description

双功能基团改性壳聚糖衍生物及其制备方法
技术领域
本发明涉及壳聚糖制备领域。更具体地，涉及一种双功能基团改性的壳聚糖衍生物及其制备方法。
背景技术
甲壳素是地球上储量仅次于纤维素的天然可再生资源，而由甲壳素脱乙酰后得到的壳聚糖是一种聚阳离子碱性多糖，除了具有无毒、无免疫原性、良好的生物可降解性和生物相容性外,它还具有许多高分子材料所不具备的消炎作用以及促进药物对生物膜表面的渗透和吸收的作用,因此壳聚糖被应用于医药、食品、化工及环保等行业。然而由于壳聚糖的化学性质相对稳定，难溶于水，极大地限制了在以上诸多领域的广泛应用。
壳聚糖分子上含有可反应的羟基和氨基，可通过控制与羟基或氨基的反应条件，进行如酰基化、羧基化、醚化、NH2烷基化、酯化、水解等反应(J.Adv.Drug.Deliv.Rev.2001,50,591.)，引入其他基团制成系列水溶性壳聚糖衍生物，从而改变其物理化学性能，赋予壳聚糖更多的特定功能，以适应更多领域的需要，进一步拓宽壳聚糖的适用范围。
胍基是目前自然界发现的正电性最强的生物活性有机碱，其在生理pH介质下能够质子化，在中性、酸性和碱性条件下均能形成带正电的基团。胍基化合物广泛存在于天然产物中，溶解性强，有很强的碱性和正电性。胍基基团具有抗炎症、降压降血脂、抗病毒、抗肿瘤等生物活性，同时具有强碱性、强稳定性、较好的生物活性，且易于形成氢链，从而具有很好的抗菌性能，被广泛医药、农业、建筑、服装、化工等领域。而壳聚糖上的氨基具有较高的反应活性，因此通过氨基对壳聚糖进行胍基化改性赋予其与胍类化合物类似的性能，进而提高壳聚糖的抑菌抗菌性能，在这方面的研究国内外已有诸多报道(Hu Y.,et.al.,Carbohyd.Polym.2007,67,66；Bioresour Technol，2010，101，5693；Zhai X.,et.al.,J.Appl.Polym.Sci.2011,121,3569.)。另外，精氨酸是一种α-氨基酸，分子量为174.2，分子式见式2，亦是20种普遍的自然氨基酸之一，所含羧基具有一定的化学活性。精氨酸可有效提高免疫力、促进免疫系统分泌自然杀手细胞、白血球内烯素、吞噬细胞等内生性物质，有利于对抗癌细胞及预防病毒感染。精氨酸是人体的一种必需氨基酸。Xiao等人以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作为催化剂，让精氨酸与壳聚糖在2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)缓冲液中常温下反应，同样得到了精氨酸改性的壳聚糖(Xiao B.,et.al.,Carbonyd.Polym.2011,83,144.)。但是，这些工作都是对壳聚糖进行单一功能基团改性，要么提高了壳聚糖的抗菌性，降低了其生物安全性，要么提高了生物安全性而抗菌性却没有明显改善，这在很大程度上影响了其进一步应用。
Figure GDA0000942848540000021
因此，需要提供一种既能提高壳聚糖抗菌功能又能提高壳聚糖生物安全性的改性壳聚糖衍生物及其制备方法。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种双功能基团改性壳聚糖衍生物。该双改性壳聚糖衍生物为本申请首次制备成功。该衍生物上的两种功能基团在壳聚糖分子上是无规分布的。该壳聚糖衍生物既具有良好抗菌性能的胍基基团，又有天然氨基酸-精氨酸的修饰，在提高了抗菌性能的同时又具有较高的生物安全性。
本发明的另一个目的在于提供一种双功能基团改性壳聚糖衍生物的制备方法。成功的将胍基化试剂和精氨酸接枝到壳聚糖分子上，得到了一种双功能基团改性的壳聚糖衍生物，在提高壳聚糖抗菌功能的同时提高了壳聚糖的生物安全性。
为达到上述第一个目的，本发明采用下述技术方案：
一种双功能基团改性壳聚糖衍生物，所述壳聚糖衍生物的分子结构式如式(1)所示
Figure GDA0000942848540000031
其中，x、y、n为自然数，0＜x≦107，0＜y≦107，102≦n≦107。
本发明首次制备成功的双功能基团改性壳聚糖衍生物，不但改善了壳聚糖的水溶性，而且兼具胍基化合物和精氨酸的双重特点，在提高壳聚糖的抑菌抗菌性能的同时生物安全性没有降低。另外，该双功能基团改性壳聚糖衍生物作为生物可降解材料，抗菌效果好、毒性小、生物安全性高，是一种绿色产品。
为达到上述第二个目的，本发明所述双功能基团改性壳聚糖的制备方法为将壳聚糖在一定条件下分别与三氧化硫脲和精氨酸反应，得到双功能基团改性的壳聚糖衍生物。其中壳聚糖可选用各种市售产品，分子量在1000-1,500,000之间。作为优选方案，应采用脱乙酰度85％以上的壳聚糖，更优选脱乙酰度90％以上分子量在2-20万之间的壳聚糖。反应所得双功能基团改性壳聚糖衍生物，采用去离子水透析的方法处理，去除小分子副产物或杂质，纯化样品。透析后的水溶液通过冷冻干燥的方法干燥得到最后的产品。
具体地，所述制备方法包括如下步骤：
1)将壳聚糖溶解到水或稀酸溶液中，经水浴加热并搅拌，充分溶解形成壳聚糖稀酸溶液；
2)用碱溶液调节溶液PH至5～7之间；
3)向壳聚糖水或稀酸溶液中缓慢添加胍基化试剂三氧化硫脲，添加完毕后恒温保持搅拌10分钟～60分钟；
4)将精氨酸活化溶液加入上述反应液，在适当的温度下反应6～48小时；
5)向反应液中加入与精氨酸等摩尔当量的盐酸羟胺终止反应；
6)反应液过滤后用去离子水透析，随后进行冷冻干燥处理，即得到产品双功能基团改性壳聚糖衍生物。
本发明所涉及的化学反应式如下：
Figure GDA0000942848540000041
壳聚糖经双功能基团改性后进行透析处理，避免了壳聚糖工业生产中常用的醇析法纯化产品所造成的杂质去除不尽的缺点。另外，采用冷冻干燥的方法来处理样品，既避免了传统样品烘干过程改性功能基团因变温分解而导致的抑菌功能或生物安全性下降,同时冷冻干燥使样品具有三维大孔网络结构，有利于溶解过程中溶剂的快速渗入提高了样品的溶解速度。
优选地，步骤1)中，所述壳聚糖数均分子量在102～107之间，脱乙酰度在50～100％。此优选分子量范围可以保证壳聚糖的高分子属性，分子量太大水溶性变差，抗菌性能也会下降；此优选脱乙酰度范围可以保证壳聚糖分子上有足够多的氨基提供接枝位点。
优选地，步骤1)中，所述稀酸为稀盐酸或稀醋酸，稀酸的浓度为0～0.5mol/L，所述壳聚糖稀酸溶液中壳聚糖的浓度为0.1％～20％，按质量体积百分比计。此优选稀酸浓度范围是为了保证壳聚糖的充分溶解，而此优选壳聚糖溶液浓度范围则是为了保证接枝反应的顺利进行，浓度太大则会因溶液粘度过大无法进行反应。
优选地，步骤1)中，水浴加热的温度为20～80℃。温度太低不利于壳聚糖的溶解，温度太高给后续反应控温带来不便。
优选地，步骤2)中，所述碱溶液为碳酸钠或氢氧化钠的水溶液，质量体积百分比浓度为0.1～1％。此优选碱液浓度范围可以更为有效地调节反应液的PH，保证反应的顺利进行。
优选地，步骤3)中，所述三氧化硫脲用量为：三氧化硫脲/壳聚糖摩尔比为0.01～10:1，投料所用时间30分钟～90分钟；恒温保持搅拌过程中的温度控制在20～80℃。此优选条件是为了保证壳聚糖与三氧化硫脲的反应顺利进行。
优选地，步骤4)中，所述精氨酸活化溶液为精氨酸、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)在2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)缓冲液中的混合溶液，缓冲液的浓度为30mmol/L，PH值为5.0±0.5，所述混合溶液在0-35℃之间恒温搅拌活化0.5-3小时，其中，壳聚糖与精氨酸的摩尔比为1～50:1，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与精氨酸的摩尔比为0.5～5:1，N-羟基琥珀酰亚胺与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:1。
优选地，步骤4)中，反应温度控制在0-35℃。此优选条件是为了保证精氨酸在反应液中具有足够的活性，低于零度一方面水可能会结冰，另一方面精氨酸活性下降，温度过高精氨酸也会失活。
选地，步骤6)中，去离子水透析过程中，每5～10小时换水一次，换水6～8次。此优选条件是为了保证在合适的时间内去除反应液中的小分子反应物或副产物。
本发明所述的双功能基团改性壳聚糖衍生物的制备方法，操作简单、可在同一反应釜连续进行，所用主要原料壳聚糖为来源极为丰富的天然高分子甲壳素脱乙酰后所得，所需设备简单，适合工业化生产，是一种高品质的天然多糖改性抗菌材料，极具市场开发前景。
本发明的有益效果如下：
1.由于双功能基团改性壳聚糖衍生物的分子上既具有良好抗菌性能的胍基基团，又有天然氨基酸-精氨酸的修饰，在提高了抗菌性能的同时又具有较高的生物安全性；
2.反应主要原料壳聚糖来源广泛，价格相对便宜；
3.壳聚糖具有生物可降解性，本身无毒，生产过程中不会产生污染；
4.相较于未改性的壳聚糖(一般需要PH小于6.0才能使用)本身，本发明产品使用PH范围变宽，在酸性条件至弱碱性(小于9.0)条件下均可使用；
5.由于采用了冻干技术，产品具有三维大孔结构，有利于溶解过程中水分子的快速渗入，水溶性好。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出原料壳聚糖的NMR C13谱图。
图2示出本发明实施例1制备的双功能基团改性壳聚糖衍生物NMR C13谱图。
图3示出本发明实施例1制备的双功能基团改性壳聚糖衍生物采用涂板法对金色葡萄球菌进行抗菌性能测试的结果照片。
图4a示出本发明实施例1制备的双功能基团改性壳聚糖衍生物对ME3T3-E1细胞的毒性测试结果。
图4b示出本发明实施例1制备的双功能基团改性壳聚糖衍生物对Hela细胞的毒性测试结果。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1
一种双功能基团改性壳聚糖衍生物，其分子结构式如下所示
Figure GDA0000942848540000061
其中，x、y、n为自然数，0＜x≦107，0＜y≦107，102≦n≦107。
上述壳聚糖衍生物的具体制备方法如下：
称取0.1克壳聚糖加入到100毫升去离子水中，室温下机械搅拌半小时，以便壳聚糖溶解完全，从而得到质量体积百分比浓度为0.1％的均匀溶液；室温下，向壳聚糖水溶液体系中缓慢加入三氧化硫脲，三氧化硫脲与壳聚糖的摩尔比为10:1，投料用时30分钟，室温下反应保持60分钟；然后将在冰水混合浴中活化3小时的精氨酸、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)的混合溶液(溶剂为30mmol/L的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)的缓冲溶液)20ml加入上述反应液中，于室温下持续搅拌反应48小时，其中壳聚糖、精氨酸、NHS、EDC的摩尔比为50:1:5:5；然后将反应液装入透析袋，将透析袋两端扎紧放入去离子水中透析处理，每隔五小时换水一次，换水八次后将透析液放入-86℃冰箱冷冻一小时后，放入冻干机直至冻干为止即可得所述双功能基团改性的壳聚糖衍生物。
图1示出原料壳聚糖的NMR C13谱图。图2示出本发明实施例1制备的双功能基团改性壳聚糖衍生物NMR C13谱图。通过对比双功能基团改性壳聚糖衍生物和原料壳聚糖的核磁共振C13谱图可以发现，双功能基团改性壳聚糖衍生物NMR C13谱图在160ppm出现胍基碳峰和183ppm出现精氨酸结构上的碳峰(如图2中圈出的部分)，充分表明双功能基团成功的通过氨基接枝到了壳聚糖的分子链上。
图3示出本发明实施例1制备的双功能基团改性壳聚糖衍生物采用涂板法对金色葡萄球菌进行抗菌性能测试的结果照片，从左到右依次是采用浓度为0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml本实施例制备的双功能基团改性壳聚糖衍生物(溶解在中性的去离子水中)以及空白对照组(不添加任何抗菌剂)的培养基涂菌后，在37℃的恒温恒湿培养箱中培养36小时后的抗菌测试结果。该结果表明：本实施例制备的双功能基团改性壳聚糖衍生物对金色葡萄球菌具有良好抑制性能。
对本实施例制备的产品采用涂板法对金色葡萄球菌抑菌率的数据统计结果如下表：
表1双改性壳聚糖抑菌性能测试结果
Figure GDA0000942848540000071
图4a示出本发明实施例1制备的双功能基团改性壳聚糖衍生物对ME3T3-E1细胞的毒性测试结果。图4b示出本发明实施例1制备的双功能基团改性壳聚糖衍生物对Hela细胞的毒性测试结果。该数据测试结果说明：双功能基团改性的壳聚糖衍生物细胞毒性较小。
以上各数据结果说明：双功能基团改性的壳聚糖衍生物不但具有良好的抗菌性能，而且在有效抑菌浓度下细胞正常生长，具有良好的生物安全性。
实施例2
一种双功能基团改性壳聚糖衍生物，其分子结构式如下所示
Figure GDA0000942848540000081
其中，x、y、n为自然数，0＜x≦107，0＜y≦107，102≦n≦107。
上述壳聚糖衍生物的具体制备方法如下：
称取0.5克壳聚糖加入到100毫升浓度为0.1mol/L的稀盐酸中，室温下机械搅拌半小时，以便壳聚糖溶解完全，从而得到质量体积百分比浓度为0.5％的均匀溶液；室温下，向壳聚糖稀酸溶液体系中缓慢加入三氧化硫脲，三氧化硫脲与壳聚糖的摩尔比为5:1，投料用时30分钟，室温下反应保持60分钟；然后将在冰水混合浴中活化3小时的精氨酸、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)的混合溶液(溶剂为浓度30mmol/L的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)的缓冲溶液，PH值为5.0左右)20ml加入上述反应液中，于室温下持续搅拌反应48小时，其中壳聚糖、精氨酸、NHS、EDC的摩尔比为20:1:4:4；然后将反应液装入透析袋，将透析袋两端扎紧放入去离子水中透析处理，每隔五小时换水一次，换水八次后将透析液放入-86℃冰箱冷冻一小时后，放入冻干机直至冻干为止即可得所述双功能基团改性的壳聚糖衍生物。对该实施例制备的双功能基团改性的壳聚糖衍生物参照实施例1进行抗菌性能与安全性能测试，其结果与实施例1类似。
实施例3
一种双功能基团改性壳聚糖衍生物，其分子结构式如下所示
Figure GDA0000942848540000091
其中，x、y、n为自然数，0＜x≦107，0＜y≦107，102≦n≦107。
上述壳聚糖衍生物的具体制备方法如下：
称取1.0克壳聚糖加入到100毫升浓度为0.1mol/L的稀盐酸中，35℃的水浴条件下机械搅拌一小时，以便壳聚糖溶解完全，从而得到质量体积百分比浓度为1％的均匀溶液；35℃的水浴中，向壳聚糖稀酸溶液体系中缓慢加入三氧化硫脲，三氧化硫脲与壳聚糖的摩尔比4：1，投料用时40分钟，室温下反应保持50分钟；然后将在室温下活化2小时的精氨酸、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)的混合溶液(溶剂为浓度30mmol/L的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)的缓冲溶液，PH值为5.0左右)20ml加入上述反应液中，于室温下持续搅拌反应24小时，其中壳聚糖、精氨酸、NHS、EDC的摩尔比为10:1:2:2；然后将反应液装入透析袋，将透析袋两端扎紧放入去离子水中透析处理，每隔五小时换水一次，换水八次后将透析液放入-86℃冰箱冷冻一小时后，放入冻干机直至冻干为止即可得所述双功能基团改性的壳聚糖衍生物。对该实施例制备的双功能基团改性的壳聚糖衍生物参照实施例1进行抗菌性能与安全性能测试，其结果与实施例1类似。
实施例4
一种双功能基团改性壳聚糖衍生物，其分子结构式如下所示
Figure GDA0000942848540000101
其中，x、y、n为自然数，0＜x≦107，0＜y≦107，102≦n≦107。
上述壳聚糖衍生物的具体制备方法如下：
称取2.0克壳聚糖加入到100m浓度为0.1mol/L的稀盐酸中，45℃的水浴条件下机械搅拌一小时，以便壳聚糖溶解完全，从而得到质量体积百分比浓度为2％的均匀溶液；45℃的水浴中，向壳聚糖稀酸溶液体系中缓慢加入三氧化硫脲，三氧化硫脲与壳聚糖的摩尔比3：1，投料用时50分钟，室温下反应保持40分钟；然后将在室温下活化2小时的精氨酸、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)的混合溶液(溶剂为浓度30mmol/L的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)的缓冲溶液，PH值为5.0左右)20ml加入上述反应液中，于室温下持续搅拌反应24小时，其中壳聚糖、精氨酸、NHS、EDC的摩尔比为5:1:2:2；然后将反应液装入透析袋，将透析袋两端扎紧放入去离子水中透析处理，每隔8小时换水一次，换水八次后将透析液放入-86℃冰箱冷冻一小时后，放入冻干机直至冻干为止即可得所述双功能基团改性的壳聚糖衍生物。对该实施例制备的双功能基团改性的壳聚糖衍生物参照实施例1进行抗菌性能与安全性能测试，其结果与实施例1类似。
实施例5
一种双功能基团改性壳聚糖衍生物，其分子结构式如下所示
Figure GDA0000942848540000111
其中，x、y、n为自然数，0＜x≦107，0＜y≦107，102≦n≦107。
上述壳聚糖衍生物的具体制备方法如下：
称取5.0克壳聚糖加入到100毫升浓度为0.2mol/L的稀盐酸中，50℃的水浴条件下机械搅拌一小时，以便壳聚糖溶解完全，从而得到质量体积百分比浓度为5％的均匀溶液；50℃的水浴中，向壳聚糖稀酸溶液体系中缓慢加入三氧化硫脲，三氧化硫脲与壳聚糖的摩尔比2：1，投料用时60分钟，室温下反应保持30分钟；然后将在室温下2小时的精氨酸、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)的混合溶液(溶剂为浓度30mmol/L的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)的缓冲溶液，PH值为5.0左右)20ml加入上述反应液中，于室温下持续搅拌反应24小时，其中壳聚糖、精氨酸、NHS、EDC的摩尔比为5:1:4:4；然后将反应液装入透析袋，将透析袋两端扎紧放入去离子水中透析处理，每隔八小时换水一次，换水八次后将透析液放入-86℃冰箱冷冻一小时后，放入冻干机直至冻干为止即可得所述双功能基团改性的壳聚糖衍生物。对该实施例制备的双功能基团改性的壳聚糖衍生物参照实施例1进行抗菌性能与安全性能测试，其结果与实施例1类似。
实施例6
一种双功能基团改性壳聚糖衍生物，其分子结构式如下所示
Figure GDA0000942848540000112
其中，x、y、n为自然数，0＜x≦107，0＜y≦107，102≦n≦107。
上述壳聚糖衍生物的具体制备方法如下：
称取7.0克壳聚糖加入到100毫升浓度为0.2mol/L的稀乙酸中，60℃的水浴条件下机械搅拌二小时，以便壳聚糖溶解完全，从而得到质量体积百分比浓度为7％的均匀溶液；60℃的水浴中，向壳聚糖稀酸溶液体系中缓慢加入三氧化硫脲，三氧化硫脲与壳聚糖的摩尔比1：1，投料用时80分钟，室温下反应保持20分钟；然后将在室温下2小时的精氨酸、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)的混合溶液(溶剂为浓度30mmol/L的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)的缓冲溶液，PH值为5.0左右)30ml加入上述反应液中，于35℃水浴中持续搅拌反应24小时，其中壳聚糖、精氨酸、NHS、EDC的摩尔比为4:1:3:3；然后将反应液装入透析袋，将透析袋两端扎紧放入去离子水中透析处理，每隔十小时换水一次，换水六次后将透析液放入-86℃冰箱冷冻一小时后，放入冻干机直至冻干为止即可得所述双功能基团改性的壳聚糖衍生物。对该实施例制备的双功能基团改性的壳聚糖衍生物参照实施例1进行抗菌性能与安全性能测试，其结果与实施例1类似。
实施例7
一种双功能基团改性壳聚糖衍生物，其分子结构式如下所示
Figure GDA0000942848540000121
其中，x、y、n为自然数，0＜x≦107，0＜y≦107，102≦n≦107。
上述壳聚糖衍生物的具体制备方法如下：
称取10.0克壳聚糖加入到100毫升浓度为0.1mol/L的稀乙酸中，60℃的水浴条件下机械搅拌两小时，以便壳聚糖溶解完全，从而得到质量体积百分比浓度为10％的均匀溶液；60℃的水浴中，向壳聚糖稀酸溶液体系中缓慢加入三氧化硫脲，三氧化硫脲与壳聚糖的摩尔比0.5：1，投料用时90分钟，室温下反应保持10分钟；然后将在35℃水浴中活化半小时的精氨酸、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)的混合溶液(溶剂为浓度30mmol/L的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)的缓冲溶液，PH值为5.0左右)40ml加入上述反应液中，于室温下持续搅拌反应6小时，其中壳聚糖、精氨酸、NHS、EDC的摩尔比为2:1:2:2；然后将反应液装入透析袋，将透析袋两端扎紧放入去离子水中透析处理，每隔五小时换水一次，换水八次后将透析液放入-86℃冰箱冷冻一小时后，放入冻干机直至冻干为止即可得所述双功能基团改性的壳聚糖衍生物。对该实施例制备的双功能基团改性的壳聚糖衍生物参照实施例1进行抗菌性能与安全性能测试，其结果与实施例1类似。
实施例8
一种双功能基团改性壳聚糖衍生物，其分子结构式如下所示
Figure GDA0000942848540000131
其中，x、y、n为自然数，0＜x≦107，0＜y≦107，102≦n≦107。
上述壳聚糖衍生物的具体制备方法如下：
称取15.0克壳聚糖加入到100毫升浓度为0.4mol/L的稀乙酸中，80℃的水浴条件下机械搅拌两小时，以便壳聚糖溶解完全，从而得到质量体积百分比浓度为15％的均匀溶液；80℃的水浴中，向壳聚糖稀酸溶液体系中缓慢加入三氧化硫脲，三氧化硫脲与壳聚糖的摩尔比0.02：1，投料用时60分钟，室温下反应保持10分钟；然后将在35℃水浴中活化半小时的精氨酸、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)的混合溶液(溶剂为浓度30mmol/L的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)的缓冲溶液，PH值为5.0左右)50ml加入上述反应液中，于35℃水浴中持续搅拌反应24小时，其中壳聚糖、精氨酸、NHS、EDC的摩尔比为2:2:1:1；然后将反应液装入透析袋，将透析袋两端扎紧放入去离子水中透析处理，每隔十小时换水一次，换水六次后将透析液放入-86℃冰箱冷冻一小时后，放入冻干机直至冻干为止即可得所述双功能基团改性的壳聚糖衍生物。对该实施例制备的双功能基团改性的壳聚糖衍生物参照实施例1进行抗菌性能与安全性能测试，其结果与实施例1类似。
实施例9
一种双功能基团改性壳聚糖衍生物，其分子结构式如下所示
Figure GDA0000942848540000141
其中，x、y、n为自然数，0＜x≦107，0＜y≦107，102≦n≦107。
上述壳聚糖衍生物的具体制备方法如下：
称取20.0克壳聚糖加入到100毫升浓度为0.5mol/L的稀乙酸中，80℃的水浴条件下机械搅拌两小时，以便壳聚糖溶解完全，从而得到质量体积百分比浓度为20％的均匀溶液；80℃的水浴中，向壳聚糖稀酸溶液体系中缓慢加入三氧化硫脲，三氧化硫脲与壳聚糖的摩尔比0.01：1，投料用时30分钟，室温下反应保持20分钟；然后将在35℃水浴中活化半小时的精氨酸、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)的混合溶液(溶剂为浓度30mmol/L的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)的缓冲溶液，PH值为5.0左右)50ml加入上述反应液中，于35℃水浴中持续搅拌反应48小时，其中壳聚糖、精氨酸、NHS、EDC的摩尔比为1:1:1:1；然后将反应液装入透析袋，将透析袋两端扎紧放入去离子水中透析处理，每隔十小时换水一次，换水六次后将透析液放入-86℃冰箱冷冻一小时后，放入冻干机直至冻干为止即可得所述双功能基团改性的壳聚糖衍生物。对该实施例制备的双功能基团改性的壳聚糖衍生物参照实施例1进行抗菌性能与安全性能测试，其结果与实施例1类似。
对比例1
一种精氨酸单功能基团改性壳聚糖衍生物，其制备方法参考CarbonhydratePolymers,2011,83,144-150，具体如下：
Figure GDA0000942848540000151
所述精氨酸单功能基团改性壳聚糖衍生物的生物安全性较好，具体请参阅已公开文献Carbonyd.Polym.2013,92,57-62，但是由于其只进行单一的精氨酸基团改性，因此提高了生物安全性而抗菌性却没有明显改善，其抗菌性能与未改性的壳聚糖相似，具体数据请参阅Carbonyd.Polym.2011,83,144-150。
对比例2
一种胍基单功能基团改性壳聚糖衍生物，其制备方法参考应用化学,2003,20,376-378，具体如下：
Figure GDA0000942848540000152
该胍基单功能基团改性壳聚糖衍生物的具有较好的抗菌抑菌性能，参考已公开现有技术中给出的数据为对金色葡萄球菌的最小抑菌浓度为0.25mg/ml(改性壳聚糖溶解在PH值为5.4的盐酸溶液中)，但是由于其只进行单一的胍基基团改性，因此其生物安全性还有待进一步的验证。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对。所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (9)

1.一种双功能基团改性壳聚糖衍生物的制备方法，所述壳聚糖衍生物的分子结构式如式(1)所示
Figure FDF0000014378350000011
其中，x、y、n为自然数，0＜x≦107，0＜y≦107，102≦n≦107；
其特征在于：所述双功能基团改性壳聚糖衍生物的制备方法，包括如下步骤：
1)将壳聚糖溶解到水或稀酸溶液中，经水浴加热并搅拌，充分溶解形成壳聚糖的水或稀酸溶液；
2)用碱溶液调节溶液pH至5～7之间；
3)向壳聚糖的水或稀酸溶液中缓慢添加胍基化试剂三氧化硫脲，添加完毕后恒温保持搅拌10分钟～60分钟；
4)将精氨酸活化溶液加入上述反应液，在适当的温度下反应6～48小时；
5)向反应液中加入与精氨酸等摩尔当量的盐酸羟胺终止反应；
6)反应液过滤后用去离子水透析，随后进行冷冻干燥处理，即得到产品双功能基团改性壳聚糖衍生物。
2.根据权利要求1所述的双功能基团改性壳聚糖衍生物的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述壳聚糖数均分子量在102～107之间，脱乙酰度在50～100％。
3.根据权利要求1或2所述的双功能基团改性壳聚糖衍生物的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述稀酸为稀盐酸或稀醋酸，稀酸的浓度为0～0.5mol/L，所述壳聚糖稀酸溶液中壳聚糖的浓度为0.1％～20％，按质量体积百分比计。
4.根据权利要求1所述的双功能基团改性壳聚糖衍生物的制备方法，其特征在于：步骤1)中，水浴加热的温度为20～80℃。
5.根据权利要求1所述的双功能基团改性壳聚糖衍生物的制备方法，其特征在于：步骤2)中，所述碱溶液为碳酸钠或氢氧化钠的水溶液，质量体积百分比浓度为0.1-1％。
6.根据权利要求1所述的双功能基团改性壳聚糖衍生物的制备方法，其特征在于：步骤3)中，所述三氧化硫脲用量为：三氧化硫脲/壳聚糖摩尔比为0.01～10:1，投料所用时间30分钟～90分钟；恒温保持搅拌过程中的温度控制在20-80℃。
7.根据权利要求1或2所述的双功能基团改性壳聚糖衍生物的制备方法，其特征在于：步骤4)中，所述精氨酸活化溶液为精氨酸、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐在2-(N-吗啉代)乙烷磺酸缓冲液中的混合溶液，缓冲液的浓度为30mmol/L，pH值为5.0±0.5，所述混合溶液在0-35℃之间恒温搅拌活化0.5-3小时，其中，壳聚糖与精氨酸的摩尔比为1～50:1，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与精氨酸的摩尔比为0.5～5:1，N-羟基琥珀酰亚胺与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:1。
8.根据权利要求1所述的双功能基团改性壳聚糖衍生物的制备方法，其特征在于：步骤4)中，反应温度控制在0-35℃。
9.根据权利要求1所述的双功能基团改性壳聚糖衍生物的制备方法，其特征在于：步骤6)中，去离子水透析过程中，每5～10小时换水一次，换水6～8次。
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