CN104497170A - 一种均相制备甲壳素低聚糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于天然高分子领域中甲壳素的深度加工技术，具体涉及甲壳素低聚糖的均相制备方法。本方案中将甲壳素和氢氧化钠/尿素溶液混合，经冷冻后搅拌制备出均相甲壳素溶液，然后加入氧化剂，搅拌反应制备得到甲壳素低聚糖溶液，后经中和、过滤、脱盐、减压蒸馏浓缩和干燥处理制得甲壳素低聚糖粉末。本发明实现了直接采用甲壳素为原料制备甲壳素低聚糖，甲壳素低聚糖纯度高，分子量可控，其分子量分布为1×10³～4×10⁴且多分散度小，乙酰度≥0.6，产率最高可达95.0％。此外本发明方法还有工艺简单，成本低，污染小等优点。

Description

一种均相制备甲壳素低聚糖的方法

技术领域

本发明属于天然高分子领域中甲壳素的深度加工领域，尤其是一种均相制备甲壳素低聚糖的方法。

背景技术

甲壳素(Chitin)，又名甲壳质、几丁质，是一种天然生物高分子聚合物，它广泛存在于许多低等动物，特别是节肢动物，如虾、蟹、虾蛄的甲壳中，蟋蟀、蛆、蛹等昆虫的甲皮中，以及菌、藻等细胞壁中，是产量仅次于纤维素的第二大再生天然高分子。甲壳素具有良好的生物相容性及生物降解性，具有极大的研究和应用价值。但是甲壳素分子由于大量的氢键作用结晶度高，既不溶于水和低浓度的酸碱也不溶于绝大多数有机溶剂，严重制约了甲壳素的应用。

甲壳素低聚糖是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)或D-氨基葡萄糖(GlcN)通过β-1,4-糖苷键连接起来的低聚合度的多糖，其分子中N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)的含量一般大于60％，即分子中氨基的乙酰化度应大于0.6。甲壳素低聚糖可以溶于水，具有许多优异的性质如无毒、抗菌、促进伤口愈合等，可以在化妆品、食品、医药等众多领域应用。然而由于甲壳素分子不溶于水及绝大多数有机溶剂，因此甲壳素低聚糖难以由甲壳素直接制得，一般多是由甲壳素先脱乙酰基制得壳聚糖，再由壳聚糖降解后得到低分子量的壳低聚糖(一种脱乙酰度通常大于0.6的壳聚糖的低聚糖)，再经乙酰化反应制得。该过程步骤多，成本高，污染大。

文献中所报道的甲壳低聚糖绝大部分是指由壳聚糖降解后得到的壳低聚糖，这主要是因为壳聚糖可以溶于稀酸，从而可以在均相条件下来降解。夏文水等人公开了一种甲壳低聚糖的制备方法及应用[CN1425696A]，该方法采用壳聚糖为原料用酶解法制备低聚糖，在其工艺中使用了三种酶复合酶酶解，可以在常温下进行降解，而且是一种环境友好型工艺，但酶价格昂贵、容易失活，且在分离提纯除去酶的同时会造成大分子量的低聚糖的损失。张勇公开了一种低聚壳聚糖的制备方法[CN102180993A]，壳聚糖在中性条件下采用过氧化氢降解得到低聚壳聚糖。李邦良，王爱勤等人公开了一种甲壳低聚糖水解液的制备方法[CN102101894A]，他们采用脱乙酰度80％以上的壳聚糖为原料加入过氧化氢和催化剂，降解得到棕色甲壳低聚糖水解液。该方法反应迅速以至于分子量大小较难控制。殷国铭公开了一种将壳聚糖制备成水溶性壳寡糖的方法[CN101643516A]，以壳聚糖为原料，以净水和双氧水配制而成的料液浸泡，并作微波辐射降解处理来获得水溶性壳寡糖。该方法工序先进，简单，污染少，产品质量好。郑婵颖和郑海龙公开了一种制备壳低聚糖的方法[CN101338332A]，该方法壳聚糖先用EDTA钠盐处理，再酶解得到壳低聚糖，所得产品灰分低于0.6％。覃彩芹和鲁黎公开了一种制备水溶性壳聚糖的方法[CN1554267A]，该方法将壳聚糖溶于稀醋酸溶液中，再用酶或氧化剂降解壳聚糖达到聚合度1000以下。此外还可采用物理降解法如光降解、超声波降解和辐射降解等方法来降解壳聚糖。它们大大减少了化学药剂的使用且环境友好，但是产率低，产物质量差，影响了其产业化应用。

直接由甲壳素来制备甲壳素低聚糖的文献很少。赵宗宝等人公开了壳低聚糖的制备方法[CN 101723989 A]，该方法以甲壳素或者壳聚糖为原料，用离子液体为介质加入比原料质量大的高浓度酸作为催化剂，水解制备甲壳低聚糖。尽管该方法中阐述离子液体可以重复使用，并且产率相对较高，但采用该方法生产过程中反应温度高及加入浓酸，使生产成本依然很高，后处理也麻烦，且其产品相对分子量难控制，单糖等小分子成分得率高。此外，由于采用高温浓酸方法的剧烈降解方法，采用甲壳素作原料也难以得到甲壳素低聚糖。尤越等人公开了一种用微生物发酵生产甲壳低聚糖的方法[CN103695315 A]，该方法以虾壳、蟹壳为原料采用微生物淡紫拟青霉菌发酵制备甲壳低聚糖，其工艺需要控制变量较多、操作繁琐、反应条件较苛刻且制备出的分子量分布仅在3000～4000之间分布十分窄，且该专利没有明确所得产品为甲壳素低聚糖还是壳低聚糖。

综上所诉，直接采用甲壳素而不是壳聚糖来制备甲壳素低聚糖，这种方法少见有报道。而且甲壳素价格低廉，不经过壳聚糖来制备甲壳素低聚糖还可以大大降低成本，减少环境污染，因此发展直接由甲壳素制备甲壳素低聚糖的方法，将具有更高的应用价值。

发明内容

针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种工艺简单、反应过程稳定、安全、低成本、环境友好、产率高且分子量可控的均相制备甲壳素低聚糖的方法。

本发明是通过以下技术手段实现上述技术目的的。

一种均相制备甲壳素低聚糖的方法，包括如下步骤：

将脱乙酰度小于30％的甲壳素粉末悬浮在氢氧化钠和尿素的混合水溶液中，在-30～-12℃条件下冷冻24～96小时，搅拌制得0.5wt％～10wt％的均相甲壳素水溶液，再向甲壳素溶液中加入氧化剂，并在0～90℃下搅拌均相反应1～24小时制得甲壳素低聚糖溶液，然后经酸中和、过滤、脱盐、减压蒸馏浓缩和干燥处理制得甲壳素低聚糖粉末。

所述的氢氧化钠和尿素的混合水溶液组成优选范围是氢氧化钠质量百分含量为2～18％，尿素质量百分含量为2％～10％。

所述的氧化剂为双氧水和次氯酸钠的一种或两种，其加入量为甲壳素结构单元物质的量的0.5～20倍。

所述的中和的酸为盐酸、硫酸、硝酸、甲酸、乙酸或柠檬酸中的一种或几种。

所述的脱盐是采用渗析或者超滤方法将甲壳素低聚糖水溶液的盐分脱去；

所述减压蒸馏浓缩的温度为30-65℃；

所述干燥处理是将减压蒸馏浓缩得到的浓甲壳素低聚糖溶液，采用冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥的方法来得到甲壳低聚糖粉末。

上述的制备方法得到甲壳素低聚糖，纯度高，其分子量为1000～40000Da，分子量分布窄，多分散度为1.1～1.9，乙酰度≥0.6。该方法产物得率最高可达95.0％。

本发明制备的甲壳低聚糖具有较强的生物活性以及生物相容性，可以在食品、医药等领域广泛的应用。

本发明的有益效果：

1.本发明采用甲壳素为原料，在均相甲壳素水溶液中制备甲壳低聚糖，制备工艺简单，反应条件温和，反应过程易控，得率最高可达97.0％，可用于大规模工业化生产。

2.本发明使用较低浓度的碱/尿素溶液作为反应介质，且反应过程无有机溶剂参与，无毒无污染，安全且成本较低。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。

实施例1

取3g乙酰度为0.85的甲壳素粉末，将甲壳素、尿素、氢氧化钠和纯水按质量比3：10：16：171混合。搅拌混匀后，在-30℃下冷冻24小时，搅拌制得1.5wt％的甲壳素粘稠溶液，然后加入1g 30wt％的双氧水溶液，在5℃下搅拌反应1.5小时，制得甲壳素低聚糖溶液，用1M的乙酸调节其pH值至中性，溶液经过滤后用10kD超滤膜超滤脱盐，30℃减压蒸馏浓缩，冷冻干燥得到甲壳素低聚糖粉末，其得率为70.9％。该产品分子量为3.96×10⁴Da，多分散度为1.87，乙酰度0.89。

实施例2

取8g乙酰度为0.96甲壳素粉末，将甲壳素、尿素、氢氧化钠和纯水按质量比8：8：34.5：149.5混合。搅拌混匀后，在-15℃下冷冻72小时，搅拌制得4.0wt％的甲壳素粘稠溶液。然后加入42.48g 12wt％的次氯酸钠溶液，在50℃下搅拌反应6小时，制得甲壳素低聚糖溶液，用2M的硫酸与甲酸的混合溶液调节pH值至中性，溶液经过滤后用截留分子量3500的膜渗析脱盐，40℃减压蒸馏浓缩，冷冻干燥得到甲壳素低聚糖粉末，其得率为85.7％。该产品分子量为1.85×10⁴Da，多分散度为1.48，乙酰度0.88。

实施例3

取18g乙酰度为0.78甲壳素粉末，将甲壳素、尿素、氢氧化钠和纯水按质量比18：8：16：158混合。搅拌混匀后，在-18℃下冷冻96小时，搅拌制得9wt％的甲壳素粘稠溶液。然后加入22.22g 30wt％的双氧水和7.08g 12wt％的次氯酸钠溶液的混合溶液，在85℃下搅拌反应22小时，制得甲壳素低聚糖溶液，用1M的盐酸调节pH值至中性，溶液经过滤后用1kD超滤膜超滤脱盐，36℃减压蒸馏浓缩，喷雾干燥得到甲壳低聚糖粉末，其得率为72.6％。该产品分子量为0.18×10⁴Da，多分散度为1.15，乙酰度0.65。

实施例4

取12g乙酰度为0.85甲壳素粉末，将甲壳素、尿素、氢氧化钠和纯水按质量比12：8：16：164混合。搅拌混匀后，在-20℃下冷冻48h，搅拌制得6wt％的均相甲壳素水溶液。然后加入22.22g 30wt％的双氧水溶液，在60℃下搅拌反应10小时，制得甲壳素低聚糖溶液，用1M的盐酸调节pH值至中性，溶液经过滤后用截留分子量3500的膜渗析脱盐，60℃减压蒸馏浓缩，真空干燥得到甲壳低聚糖，得率为75.5％。该产品分子量为1.43×10⁴Da，分散度为1.76，乙酰度0.86。

实施例5

取6g乙酰度为0.85甲壳素粉末，将甲壳素、尿素、氢氧化钠和纯水按质量比6：4：24：166混合。搅拌混匀后，在-25℃下冷冻80小时，搅拌制得3wt％的甲壳素粘稠溶液，然后加入56.64g 12wt％的次氯酸钠溶液，在55℃下搅拌反应18小时，制得甲壳素低聚糖溶液，用1M的柠檬酸与甲酸与盐酸的混合酸调节pH至中性，溶液经过滤后用截留分子量3500的膜渗析脱盐，38℃减压蒸馏浓缩，冷冻干燥得到甲壳低聚糖粉末，其得率为94.8％。该产品分子量为0.91×10⁴Da，多分散度为1.23，乙酰度0.80。

实施例6

取4g乙酰度为0.96甲壳素粉末，将甲壳素、尿素、氢氧化钠和纯水按质量比4：15：9：172混合。搅拌混匀后，在-27℃下冷冻60小时，搅拌制得2wt％的甲壳素粘稠溶液，然后加入2.22g 30wt％的双氧水溶液与7.08g 12％的次氯酸钠溶液，在35℃下搅拌反应6小时，制得甲壳素低聚糖溶液，再用1M的盐酸与硫酸混合酸调节pH值至中性，溶液经过滤后用5kD超滤膜超滤脱盐，65℃减压蒸馏浓缩，真空干燥得到甲壳低聚糖粉末，其得率为82.2％。该产品分子量为2.80×10⁴Da，多分散度为1.48，乙酰度0.92。

实施例7

取4g乙酰度为0.78甲壳素粉末，将甲壳素、尿素、氢氧化钠和纯水按质量比4：8：16：172混合。搅拌混匀后，在-24℃下冷冻42小时，搅拌制得2wt％的甲壳素粘稠溶液，然后加入2.22g 30wt％的双氧水溶液，在20℃下搅拌反应4小时，制得甲壳素低聚糖溶液，再用1M的盐酸调节pH值至中性，溶液经过滤后用10kD超滤膜超滤脱盐，50℃减压蒸馏浓缩，喷雾干燥得到甲壳低聚糖粉末，其得率为70.7％。将该产品用凝胶参透色谱测其分子量。其分子量为3.29×10⁴Da，多分散度为1.57，乙酰度0.82。

实施例8

取1g乙酰度为0.85甲壳素粉末，将甲壳素、尿素、氢氧化钠和纯水按质量比1：8：16：175混合。搅拌混匀后，在-28℃下冷冻40小时，搅拌制得0.5wt％的甲壳素粘稠溶液，然后加入11.16g 30wt％的双氧水溶液，在90℃下搅拌反应0.5小时，制得甲壳素低聚糖溶液，再用1M的盐酸调节pH值至中性，溶液经过滤后用1kD超滤膜超滤脱盐，40℃减压蒸馏浓缩，喷雾干燥得到甲壳低聚糖粉末，其得率为75.2％。将该产品用凝胶参透色谱测其分子量。其分子量为0.92×10⁴Da，多分散度为1.62，乙酰度0.81。

实施例9

取20g乙酰度为0.96甲壳素粉末，将甲壳素、尿素、氢氧化钠和纯水按质量比20：8：16：156混合。搅拌混匀后，在-12℃下冷冻45小时，搅拌制得10wt％的甲壳素粘稠溶液，然后加入636g 12wt％次氯酸钠溶液，在0℃下搅拌反应6小时，制得甲壳素低聚糖溶液，再用1M的柠檬酸调节pH值至中性，溶液经过滤后用截留分子量3500的膜渗析脱盐，55℃减压蒸馏浓缩，冷冻干燥得到甲壳低聚糖粉末，其得率为64.8％。将该产品用凝胶参透色谱测其分子量。其分子量为1.32×10⁴Da，多分散度为1.42，乙酰度0.91。

所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种均相制备甲壳素低聚糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将脱乙酰度小于30％的甲壳素粉末悬浮在氢氧化钠和尿素的混合水溶液中，在-30～-12℃条件下冷冻24～96h，搅拌制得0.5wt％～10wt％的均相甲壳素水溶液；

再向甲壳素溶液中加入氧化剂，并在0～90℃下搅拌均相反应1～24h制得甲壳素低聚糖溶液，然后经酸中和、过滤、脱盐、减压蒸馏浓缩和干燥处理制得甲壳素低聚糖粉末。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的氢氧化钠和尿素的混合水溶液中，氢氧化钠质量百分含量为2～18％，尿素质量百分含量为2％～10％。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的氧化剂为双氧水和次氯酸钠的一种或两种，其加入量为甲壳素结构单元物质的量的0.5～20倍。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中和的酸为盐酸、硫酸、硝酸、甲酸、乙酸或柠檬酸中的一种或几种。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱盐采用渗析或者超滤方法将甲壳素低聚糖水溶液的盐分脱去。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述减压蒸馏浓缩的温度为30-65℃。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干燥为冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥。

8.如权利要求1所述方法制备的甲壳素低聚糖，其特征在于，分子量为1000～40000Da，多分散度为1.1～1.9，乙酰度≥0.6。