CN108559763A - 一种提高壳寡糖聚合度3-6糖含量的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高壳寡糖聚合度3～6糖含量的制备方法。其包括，分散：将原料壳聚糖放入水中分散均匀；预溶解：加入酸预溶解；分段酶解：调控体系pH为4.7～5.0，40～44℃条件下反应2～3h，43～47℃条件下反应3～5h，48～52℃反应4～6h；中和：分段酶解后，高温灭酶，中和；过滤：先微滤，再纳滤，得到聚合度3～6的壳寡糖。本发明采用分段酶解法，由于壳聚糖的成盐pH较低，而壳聚糖水解酶不耐酸和高温，因此将pH和反应温度优化组合，提高了酶的利用率。本发明制备出的壳寡糖聚合度集中，壳三糖‑壳六糖的含量在95％以上。且水解效率提高，产率得率高。

Description

一种提高壳寡糖聚合度3-6糖含量的制备方法

技术领域

本发明属于壳寡糖制备技术领域，具体涉及一种提高壳寡糖聚合度3～6糖含量的制备方法。

背景技术

壳寡糖是由2～10个氨基(或部分乙酰氨基)葡萄糖单元以β-1,4糖苷键连接而成的低聚糖，壳寡糖在自然界的动植物与微生物中含量少，但具有优越的生理功能和生物活性，据研究报道，壳寡糖具有免疫调节功能，能防癌、抗癌、抑制癌细胞转移，可以调节血糖、血压、血脂，强化肝脏功能，增强胃肠功能，具有抗衰老和抗疲劳、清除自由基、，排除重金属离子等功能与活性，其中尤以壳五糖和壳六糖的抗肿瘤效果最优；壳六糖是免疫系统的天然佐剂，是Ⅰ型糖尿病的天然克星，壳四糖是Ⅱ型糖尿病的天然克星。同时壳寡糖为小分子，水溶性好、易于吸收，已开始在医药、食品、农业、化工、生物等领域被应用于发挥独特作用。因此，获得高含量聚合度3～6糖的壳寡糖是科技与产业界备受重视和关注的研究课题。

目前壳寡糖的最重要的来源都是由壳聚糖经过特定的方法降解获得，已报道的壳寡糖的制备方法包括化学法、酶解法、物理法等，其中化学法降解快、成本较低、操作简便，易于实现产业化，但得到的壳寡糖产物其分子量分布难以控制、分子结构容易被破坏，产品安全性受质疑。物理法包括超声波法，微波法，辐射法，光波法，物理法的优点是污染小，操作较为简单，但是降解受限，通常产物聚合度较大，分子量分布也较宽，单独使用效果不佳，而且设备投资较大。酶法降解是用壳聚糖水解酶对壳聚糖进行降解而得到壳寡糖的方法，具有反应条件温和、水解可控、产物安全性高等优点，是目前公认的比较理想的绿色制备方法。已经发现对壳聚糖具有水解作用的酶有专一性酶和非专一性酶，如壳聚糖酶，纤维素酶、木瓜蛋白酶、脂肪酶等，这些酶都具有不同程度和不同方式对壳聚糖的糖苷键发生催化水解作用而制备得到壳寡糖。如专利CN102492664A，利用复合酶结合膜分离制备出壳寡糖，得到了产品分子量为500～5000D；专利CN101280330A，利用里氏木霉纤维素酶制备壳寡糖，采用丙酮-水分级沉淀法，得到不同分布范围的壳寡糖，但酶解产物中高活性范围的含量低的问题仍没有解决，且该方法可能存在试剂残留，环境污染等问题；CN101240305A，用壳聚糖酶水解得到平均分子量为1500D的壳寡糖，没有关注聚合度分布；CN1746193A，采用固定化酶的方式酶解壳聚糖，得到低分子量的壳寡糖，并未提及分子量分布情况；专利CN1544479A酶法得到聚合度为8～200的水溶性低聚糖，分布范围广，高活性成分含量低。专利CN106755207A，一种壳聚糖高固含量酶解生成壳寡糖，聚合度主要为5～10，收率仅为30％～80％，存在质量不稳定，有效成分含量低的问题。

总之，现有上述壳寡糖的酶解制备方法存在生产成本较高、产物质量不稳定、分子量分布指数宽的缺点。这主要是因为原料壳聚糖是甲壳素脱乙酰化的产物，是大分子聚集体，其分子量较大，通常在几十万到上百万左右，而且脱乙酰基反应是在非均相下进行的，致使壳聚糖的脱乙酰化程度会产生不均匀，造成壳聚糖的酸溶解不充分或不均匀，从而会对以壳聚糖作为酶解底物的酶水解带来困难。一般的酶解反应中，反应底物大多为溶胀或呈胶体与混浊液，如果溶解不彻底或呈紧密的分子形态就会大大影响水解效果，这样就会最终导致酶水解的效率不高，存在有大量未被降解的大分子，产品品质差，生产成本高。致使壳寡糖的应用受到限制。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。

因此，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种提高壳寡糖聚合度3～6糖含量的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种提高壳寡糖聚合度3～6糖含量的制备方法，其包括，分散：将原料壳聚糖放入水中分散均匀；预溶解：加入酸预溶解；分段酶解：调控体系pH为4.7～5.0，40～44℃条件下反应2～3h，43～47℃条件下反应3～5h，48～52℃反应4～6h；中和：分段酶解后，高温灭酶，中和；过滤：先微滤，再纳滤，得到聚合度3～6的壳寡糖。

作为本发明所述提高壳寡糖聚合度3～6糖含量的制备方法的一种优选方案，其中：所述分散，为将原料壳聚糖与水按质量体积比为1：20的比例混合，搅拌下使壳聚糖被水分散润湿，直至混匀无结块。

作为本发明所述提高壳寡糖聚合度3～6糖含量的制备方法的一种优选方案，其中：所述预溶解，为每100g壳聚糖加入0.5mol冰醋酸，在100rpm～300rpm条件下搅拌1～2h，控制温度在45℃，使溶解后溶液pH≤5。

作为本发明所述提高壳寡糖聚合度3～6糖含量的制备方法的一种优选方案，其中：所述分段酶解，为按照酶底比9U/g，加入壳聚糖水解酶，第一阶段调控体系pH在4.7～5.0，反应温度在40～44℃条件下反应2～3h；第二阶段pH在5.0～5.2，在43～47℃条件下反应3～5h；第三阶段pH＞5.2，在48～52℃条件下反应4～6h。

作为本发明所述提高壳寡糖聚合度3～6糖含量的制备方法的一种优选方案，其中：所述中和，为酶解结束后，升高温度灭酶，随后降温至室温，在搅拌下用NaOH溶液喷洒中和，调节pH至6.2～7。

作为本发明所述提高壳寡糖聚合度3～6糖含量的制备方法的一种优选方案，其中：所述微滤，为将中和后的反应液经离心分离，取上清液，用0.45μm微滤膜过滤。

作为本发明所述提高壳寡糖聚合度3～6糖含量的制备方法的一种优选方案，其中：所述纳滤，为用500Da膜进行纳滤纯化，除去盐和部分单糖,用水洗滤至透过液电导率不再随加水量变化剧烈波动，收集纯化后的纳滤截留液，最终纳滤浓缩至10％，得到聚合度为3～6壳寡糖产物溶液。

作为本发明所述提高壳寡糖聚合度3～6糖含量的制备方法的一种优选方案，其还包括，浓缩：将纯化后的反应液进行减压真空浓缩至粘稠状。

作为本发明所述提高壳寡糖聚合度3～6糖含量的制备方法的一种优选方案，其还包括，干燥：经过所述浓缩后，进行真空干燥，得到聚合度3～6的壳寡糖。

本发明的有益效果：本发明对壳聚糖醋酸溶液进行预处理，使壳聚糖溶液充分溶胀分散，扩大了酶与底物的接触范围，得到分布较为集中的壳寡糖产品，大大降低了单糖的生成。本发明采用分段酶解法，由于壳聚糖的成盐pH较低，而壳聚糖水解酶不耐酸和高温，因此将pH和反应温度优化组合，提高了酶的利用率。本发明通过调整醋酸的添加量，使反应体系一直维持在最适pH范围内。本发明控制低温低pH反应，pH提高后提高温度提高反应速率。本发明制备出的壳寡糖聚合度集中，壳三糖-壳六糖的含量在95％以上。且水解效率提高，产率得率高。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

本发明的工艺流程：壳聚糖水中分散→加酸控温溶解→酶解第一阶段(42℃、pH4.7～5.0)→酶解第二阶段(45℃、pH5～5.2)→酶解第三阶段(50℃、pH＞5.2)→中和→微滤除杂→纳滤→浓缩→干燥。

具体操作方法：

壳聚糖水中分散：将原料壳聚糖放入盛有水的反应罐中，搅拌下使壳聚糖被水分散润湿，直至混匀无结块。

加酸控温溶解：向在水中分散均匀的壳聚糖固液体系中加入一定量醋酸，在100rpm～300rpm条件下搅拌1～2h，控制温度在45℃，使溶解后溶液pH≤5。每100g壳聚糖加冰醋酸0.5mol左右；最终壳聚糖溶液pH为5左右。

三段式酶解：按照酶底比9U/g，加入壳聚糖水解酶，该步骤分三阶段进行：(1)调控体系pH在4.7～5.0，反应温度在42(±2)℃条件下反应2～3h；(2)随着反应进行，pH渐渐上升，当体系pH在5.0～5.2，在45(±2)℃条件下反应3～5h；(3)当体系pH＞5.2，在50(±2)℃条件下再反应4～6h。

酶活力的定义为在最适条件下，1小时内产生1μmol还原糖所需要的酶量为1U。

中和：酶解结束后，升高温度灭酶，随后降温至室温，在搅拌下用一定浓度NaOH溶液喷洒酶解反应液，调节pH至6.2～7。

微滤除杂：将中和后的反应液经离心分离，取上清液，用0.45μm微滤膜过滤。

纳滤：将微滤滤过液用500Da膜进行纳滤纯化，除去盐和部分单糖,用3倍体积水进行反复洗滤至透过液电导率不再随加水量变化剧烈波动，收集纯化后的纳滤截留液，最终纳滤浓缩至10％左右，为壳寡糖产物溶液。

浓缩：将纯化后的反应液进行减压真空浓缩至粘稠状；

干燥：在一定的条件下真空干燥后得到符合制备要求的壳寡糖产品。

对照例：

将50g原料壳聚糖放入盛有1L水的反应罐中，搅拌下使壳聚糖被水分散润湿，直至混匀无结块；边搅拌边向其中加入2.5mol冰醋酸，100rpm～300rpm条件下常温搅拌溶解15min。50℃恒温水浴锅保温并加入450U壳聚糖水解酶，开始水解，搅拌速度为300rpm，反应12h。反应结束后，升高温度灭酶，将温度恢复至室温后用10％(质量体积比)NaOH溶液喷洒酶解液并不断搅拌，中和至pH6.2～7。将中和后的溶液高速离心后，将上清液依次通过普通滤纸和0.45μm微滤膜除杂。将上述透过液进行减压浓缩至粘稠状。真空干燥后得到壳寡糖产品。经HPLC检测，其中壳三糖-壳六糖的含量为37.24％。

实施例1：

将50g原料壳聚糖放入盛有1L水的反应罐中，搅拌下使壳聚糖被水分散润湿，直至混匀无结块；边搅拌边向其中加入2.5mol冰醋酸，100rpm～300rpm条件下常温搅拌溶解12h。50℃恒温水浴锅保温并加入450U壳聚糖水解酶，开始水解，搅拌速度为300rpm，反应12h。反应结束后，升高温度灭酶，将温度恢复至室温后用10％(质量体积比)NaOH溶液喷洒酶解液并不断搅拌，中和至pH6.2～7。将中和后的溶液高速离心后，将上清液依次通过普通滤纸和0.45μm微滤膜除杂。将上述透过液进行减压浓缩至粘稠状。真空干燥后得到壳寡糖产品。经HPLC检测，其中壳三糖-壳六糖的含量为98.01％。

实施例2：

将50g原料壳聚糖放入盛有1L水的反应罐中，搅拌下使壳聚糖被水分散润湿，直至混匀无结块；边搅拌边向其中加入2.5mol冰醋酸，100rpm～300rpm条件下常温搅拌溶解12h。50℃恒温水浴锅保温并加入450U壳聚糖水解酶，开始水解，搅拌速度为300rpm，反应12h。反应结束后，升高温度灭酶，将温度恢复至室温后用10％(质量体积比)NaOH溶液喷洒酶解液并不断搅拌，中和至pH6.2～7。将中和后的溶液高速离心后，将上清液依次通过普通滤纸和0.45μm微滤膜除杂。取透过液采用500D的膜进行纳滤，并用3倍体积水进行反复冲洗，直至纳滤透过液的电导率不再随着加水量的变化而波动，收集纯化后的纳滤截留液，最终纳滤浓缩至10％左右，为壳寡糖产物溶液；将纯化后的壳寡糖溶液进行减压真空浓缩至粘稠状；在一定的条件下真空干燥后得到壳寡糖产品。经HPLC检测，其中壳三糖-壳六糖的含量为98.01％，灰分降至0.3％。

实施例3：

将50g原料壳聚糖放入盛有1L水的反应罐中，搅拌下使壳聚糖被水分散润湿，直至混匀无结块；边搅拌边向其中加入2.5mol冰醋酸，100rpm～300rpm条件下45℃～50℃搅拌溶解2h。50℃恒温水浴锅保温并加入450U壳聚糖水解酶，开始水解，搅拌速度为300rpm，反应12h。反应结束后，升高温度灭酶，将温度恢复至室温后用10％(质量体积比)NaOH溶液喷洒酶解液并不断搅拌，中和至pH6.2～7。将中和后的溶液高速离心后，将上清液依次通过普通滤纸和0.45μm微滤膜除杂。取透过液采用500D的膜进行纳滤，并用3倍体积水进行反复冲洗，直至纳滤透过液的电导率不再随着加水量的变化而波动，收集纯化后的纳滤截留液，最终纳滤浓缩至10％左右，为壳寡糖产物溶液；将纯化后的壳寡糖溶液进行减压真空浓缩至粘稠状；在一定的条件下真空干燥后得到符合制备要求的壳寡糖产品。

实施例4：

将50g原料壳聚糖放入盛有1L水的反应罐中，搅拌下使壳聚糖被水分散润湿，直至混匀无结块；边搅拌边向其中加入2.5mol冰醋酸，45℃水浴条件下，150rpm搅拌1.5h，进行预溶解，使壳聚糖溶液pH＝5，向溶胀处理后的壳聚糖溶液中加入450U壳聚糖水解酶。酶解分三阶段进行：第一阶段，pH4.7～5.0，在42℃条件下反应2.5h；第二阶段，随着反应进行，pH渐渐上升，体系pH在5～5.2，在45℃条件下反应4h；第三阶段，当体系pH＞5.2，在50(±2)℃条件下反应5h。反应结束后，升高温度灭酶，将温度恢复至室温后用10％(质量体积比)NaOH溶液喷洒酶解液并不断搅拌，中和至pH6.2～7。将中和后的溶液高速离心后，将上清液依次通过普通滤纸和0.45μm微滤膜除杂。取透过液采用500D的膜进行纳滤，并用3倍体积水进行反复冲洗，直至纳滤透过液的电导率不再随着加水量的变化而波动，收集纯化后的纳滤截留液，最终纳滤浓缩至10％左右，为壳寡糖产物溶液；将纯化后的壳寡糖溶液进行减压真空浓缩至粘稠状；在一定的条件下真空干燥后得到符合制备要求的壳寡糖产品。

各实施例产品聚合度分布情况如表1所示。

表1不同预处理方式制备的壳寡糖产品不同聚合度壳寡糖比例、灰分变化情况

从表1可知，实施例4方法制备的聚合度3～6的壳寡糖得率最高。

实施例5：

将50g原料壳聚糖放入盛有1L水的反应罐中，搅拌下使壳聚糖被水分散润湿，直至混匀无结块；酶解分两阶段进行，第一阶段在40℃条件下反应3h，pH4.7～5.0，第二阶段45℃反应9h，pH在5～5.2。反应结束后，升高温度灭酶，将温度恢复至室温后用10％(质量体积比)NaOH溶液喷洒酶解液并不断搅拌，中和至pH6.2～7。将中和后的溶液高速离心后，将上清液依次通过普通滤纸和0.45μm微滤膜除杂。取透过液采用500D的膜进行纳滤，并用3倍体积水进行反复冲洗，直至纳滤透过液的电导率不再随着加水量的变化而波动，收集纯化后的纳滤截留液，最终纳滤浓缩至10％左右，为壳寡糖产物溶液；将纯化后的壳寡糖溶液进行减压真空浓缩至粘稠状；在一定的条件下真空干燥后得到符合制备要求的壳寡糖产品。本实施例不经过充分预溶解，且酶解分为两阶段进行，实验结果测得聚合度3～6壳寡糖得率为47％，且分子量分布单糖占66.7％。

实施例6：

酶解分两阶段进行，第一阶段在40℃条件下反应3h，pH4.7～5.0，第二阶段45℃反应9h，pH在5～5.2。其余条件均与实施例4相同。本实施例酶解分为两段进行，实验结果测得聚合度3～6壳寡糖得率为57.3％。

实施例7：

除冰醋酸加入量为3.3mol外，其余条件均与实施例4相同。实验结果测得聚合度3～6壳寡糖得率低于40％。

实施例8：

除冰醋酸加入量为1.5mol，其余条件均与实施例4相同。实验结果测得体系中有壳聚糖固体沉淀，有大量的不溶性沉淀，测得平均聚合度在2.11。

综上，本发明通过改变壳聚糖溶解过程和调节壳聚糖溶液分子形态，使反应均匀进行，有效提高水解效率。充分的预处理促使壳聚糖溶胀完全，调节壳聚糖水解酶在不同温度与pH下的组合，最大程度保留酶的生物活性，反应过程中通过醋酸添加量的改变控制pH在合适的范围内，得到优质壳寡糖产品，产物中高生物活性的组分含量显著提高。本发明在现有一般酶解制备方法中无需增加新设备，操作简单、成本低，便于工业化生产。

本发明对壳聚糖醋酸溶液进行预处理，使壳聚糖溶液充分溶胀分散，扩大了酶与底物的接触范围，得到分布较为集中的壳寡糖产品，大大降低了单糖的生成。本发明采用分段酶解法，由于壳聚糖的成盐pH较低，而壳聚糖水解酶不耐酸和高温，因此将pH和反应温度优化组合，提高了酶的利用率。本发明通过调整醋酸的添加量，使反应体系一直维持在最适pH范围内。本发明控制低温低pH反应，pH提高后提高温度提高反应速率。本发明制备出的壳寡糖聚合度集中，壳三糖-壳六糖的含量在95％以上。且水解效率提高，产率得率高。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (9)

1.一种提高壳寡糖聚合度3～6糖含量的制备方法，其特征在于：包括，

分散：将原料壳聚糖放入水中分散均匀；

预溶解：加入酸预溶解；

分段酶解：调控体系pH为4.7～5.0，40～44℃条件下反应2～3h，43～47℃条件下反应3～5h，48～52℃反应4～6h；

中和：分段酶解后，高温灭酶，中和；

过滤：先微滤，再纳滤，得到聚合度3～6的壳寡糖。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述分散，为将原料壳聚糖与水按质量体积比为1：20的比例混合，搅拌下使壳聚糖被水分散润湿，直至混匀无结块。

3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述预溶解，为每100g壳聚糖加入0.5mol冰醋酸，在100rpm～300rpm条件下搅拌1～2h，控制温度在45℃，使溶解后溶液pH≤5。

4.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述分段酶解，为按照酶底比9U/g，加入壳聚糖水解酶，第一阶段调控体系pH在4.7～5.0，反应温度在40～44℃条件下反应2～3h；第二阶段pH在5.0～5.2，在43～47℃条件下反应3～5h；第三阶段pH＞5.2，在48～52℃条件下反应4～6h。

5.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述中和，为酶解结束后，升高温度灭酶，随后降温至室温，在搅拌下用NaOH溶液喷洒中和，调节pH至6.2～7。

6.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述微滤，为将中和后的反应液经离心分离，取上清液，用0.45μm微滤膜过滤。

7.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述纳滤，为用500Da膜进行纳滤纯化，除去盐和部分单糖,用水洗滤至透过液电导率不再随加水量变化剧烈波动，收集纯化后的纳滤截留液，最终纳滤浓缩至10％，得到聚合度为3～6壳寡糖产物溶液。

8.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：还包括，

浓缩：将纯化后的反应液进行减压真空浓缩至粘稠状。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于：还包括，

干燥：经过所述浓缩后，进行真空干燥，得到聚合度3～6的壳寡糖。