KR102295829B1 - 개선된 키토올리고당의 제조방법 - Google Patents

개선된 키토올리고당의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명에 따르면, 효소 작용을 통하여 키토산으로부터 키토올리고당을 제조하는 과정에서 산 첨가 전 및 후에 키토산의 가수분해 효소를 분할 첨가함으로써 반응 매질 내 키토산의 투입량을 현저히 증가시킴으로써 생산 효율을 개선할 수 있는 키토올리고당의 제조방법이 제공된다.

Description

개선된 키토올리고당의 제조방법{Improved Method for Preparing Chito-oligosaccharides}
본 발명은 개선된 키토올리고당의 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 효소 작용을 통하여 키토산으로부터 키토올리고당을 제조하는 과정에서 산 첨가 전 및 후에 키토산의 가수분해 효소를 분할 첨가함으로써 반응 매질 내 키토산의 투입량을 현저히 증가시킴으로써 생산 효율을 개선할 수 있는 키토올리고당의 제조방법에 관한 것이다.
키토산(chitosan)은 키틴을 탈아세틸화 반응시켜 수득되는 고분자 형태의 물질로서, 게, 새우 등의 갑각류, 곤충의 외골격, 버섯이나 균류의 세포벽 성분의 고분자 다당류인 키틴을 저분자화 또는 탈아세틸화시킨 물질이며, 글루코사민이 결합된 천연고분자 다당류이다. 키토산은 물 또는 알코올 내에서는 용해되지 않는 반면, 단위 구조에 아미노기를 함유하고 있기 때문에 무기산(예를 들면, 염산 및 질산), 유기산(아세트산, 락트산, 아스코르브산 및 말산) 등의 산성 용액에 용해되는 것으로 알려져 있다. 최근 키토산 및 그 유도체들의 생리활성 기능들이 밝혀지면서 이의 응용에 많은 관심을 받고 있다. 특히, 키토산은 독성이 없고 생분해성을 갖고 있을 뿐만 아니라, 콜레스테롤 저하, 면역력 개선, 혈압 강하, 간 기능 개선, 혈당 저하, 항균성 등과 같은 다양한 생리활성 효과를 나타낼 수 있기 때문에 식품 산업, 의료 산업 등에 광범위하게 이용되고 있다.
한편, 키토올리고당(chitosan oligosaccharide, CSO)은 키토산을 다시 한 번 저분자화한 물질로서 생리학적 pH에서 낮은 용해도를 갖는 키토산에 비하여 용해성이 높기 때문에 보다 다양한 분야에 이용될 수 있다. 즉, 키토산이 생리활성이 높은 천연 다당류임에도 불구하고, 수용액 상태로 용해되지 않고 분자량이 큰 고분자물질이므로 섭취하더라도 인체 내에서는 키토산을 분해할 수 있는 효소가 없기 때문에 흡수되기 곤란하다. 그러나, 키토산이 올리고당으로 분해됨에 따라 분자량이 감소되면, 용해도 및 체내 흡수율이 크게 증가하게 된다.
특히, 키토올리고당은 설사를 유발하는 대장균이나 살모넬라 등 그람 음성균에 대한 항균능을 갖고 있는 바, 이는 키토산의 양이온성 아민기가 미생물 세포벽의 음이온성 카르복실기와 반응함으로써 병원성 미생물의 활동을 억제하는 작용을 하기 때문이다. 또한, 키토올리고당은 면역체계에 있는 T-세포(T-cell), 대식세포(Macrophage) 및 자연살해세포(Natural killer cell) 등을 활성화시킴으로써 가축 체내 면역력을 증진시키는 효과가 있는 것으로 보고된 바 있다.
키토올리고당을 제조하는 방법으로, 크게 화학적 분해법, 물리적 분해법 및 효소 분해법이 있다. 이중 화학적 분해법의 대표적인 예로서 염산, 황산 등의 산, 과산화수소 등을 이용한 가수분해 방식을 들 수 있는 바, 비교적 용이하게 키토산을 분해할 수 있으나 분자량 크기의 조절이 곤란하고, 키토올리고당의 분포가 균일하지 못하고 단량체를 생성하는 경향을 갖기 때문에 키토산 고유의 생리활성 효과를 확보하는데 한계가 있다. 특히, 화학적 분해법은 반응 조건이 까다롭고, 불순물을 제거하기 어렵기 때문에 대량생산이 곤란하고, 화장품 및 식품 분야에서 응용하는데 어려움이 있다.
또한, 물리적 분해법은 초음파, 마이크로파, 오존, 자외선 등을 이용하여 키토산을 분해하는 방식이다(예를 들면, 국내특허공개번호 제2012-119944호, 제2008-102769호 등). 그러나, 특수한 설비가 필요하고 반응시간이 길기 때문에 키토산의 물리적 성질이 변화하여 양호한 생리활성 기능을 확보하기 어렵다.
상술한 점을 고려하여, 미생물 유래 효소에 의한 가수분해를 통하여 키틴 또는 키토산으로부터 키토올리고당을 제조하는 기술이 알려져 있다. 이때, 사용 가능한 효소의 예는 바실러스(Bacillus) 균주 유래의 키토사나제, 스트렙토마이세스 유래의 효소 등이다.
이와 관련하여, 종래에 효소를 이용한 방식에서는, 도 1에 도시된 바와 같이 키토산에 강산(구체적으로 염산)을 첨가한 다음, 이에 효소를 투입하며, 최종적으로 건조를 통하여 키토올리고당을 제조한다. 그러나, 천연고분자인 키토산이 용해되더라도 높은 점성을 나타낼 수밖에 없으며, 시판 중인 가장 낮은 분자량의 키토산을 사용하는 경우에도 반응액 내 키토산의 농도(함량)은 약 5% 정도인데, 5% 이상 투입하거나 보다 높은 분자량의 키토산을 사용하면 수용액이 겔화되는 현상이 유발된다. 이 경우, 폐기 비용이 증가하게 되고, 겔의 폐기 역시 용이하지 않다.
특히, 종래 방식에 따르면, 고함량(예를 들면, 약 80% 이상)의 키토올리고당을 생산하기 위하여는 진한 염산(예를 들면, 35%의 농도)을 사용하는데, 효소 반응 중 유독가스가 발생할 수 있고, 더 나아가 취급 시 주의가 요구된다.
더 나아가, 종래 기술에서는 생성물 내에 2당 및 3당과 같은 낮은 분자량(중합도)을 갖는 키토올리고머의 비율이 상대적으로 높은 경우가 발생하는 바, 4당에서 8당까지의 키토올리고머가 요구되는 분야에서는 효과적으로 적용하기 곤란할 수 있다.
이처럼, 종래에 알려진 키토올리고당의 제조방법은 각각의 방식마다 해결해야할 문제점이 있으며, 특히 최근 관심을 받고 있는 효소 분해법에 대한 개선 필요성이 존재한다.
본 발명에서는 종래 기술, 특히 종래에 강산 첨가 후 효소를 투입하는 방식으로 키토산을 키토올리고당으로 전환시키는 방법에서 지적된 폐기물 발생, 진한 산 첨가에 따른 유독 가스 등의 발생, 낮은 분자량의 키토올리고당의 생성 및 키토올리고당 제조 비용 증가와 같은 문제점을 일거에 해결할 수 있는 방안을 제공하고자 한다.
본 발명의 제1 면에 따르면,
분해 효소 작용에 의하여 키토산으로부터 키토올리고당을 제조하는 방법으로서,
a) 수계 매질 내에 적어도 80 메쉬의 사이즈를 갖는 분말 형태의 키토산을 적어도 10 중량%의 농도로 첨가하여 키토산-함유 수계 매질을 제조하는 단계;
b) 상기 키토산-함유 수계 매질에 분해 효소를 전체 사용량의 25 내지 40%의 량으로 첨가하여 키토산-함유 수계 매질 내 키토산의 적어도 일부가 가수 분해된 제1 생성물-함유 수계 매질을 형성하는 단계;
c) 상기 제1 생성물-함유 수계 매질에 농도가 15 중량% 이하인 산 수용액을 첨가하여 제1 생성물-함유 수계 매질 내 고형물을 용해시킨 제2 생성물-함유 수계 매질을 제조하는 단계;
d) 상기 제2 생성물-함유 수계 매질에 분해 효소를 전체 사용량의 60 내지 75 중량%의 량으로 첨가하여 제2 생성물-함유 수계 매질 내 키토산이 키토올리고당으로 가수 분해된 제3 생성물-함유 수계 매질을 제조하는 단계; 및
e) 상기 제3 생성물-함유 수계 매질을 건조하여 이에 함유된 키토올리고당을 수득하는 단계;
를 포함하며,
여기서, 상기 분해 효소는 10,000 내지 50,000 unit/g 범위의 활성을 갖는 것으로, 상기 분해 효소의 전체 사용량은 단계 a)에서 첨가된 키토산 기준으로 0.05 내지 0.2 중량% 범위에서 정하여지는 방법이 제공된다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 단계 a)에서 첨가된 키토산의 분자량(Mw) 및 점도(20℃) 각각은 50 내지 400 kDa 및 3 내지 30 cps 범위일 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 단계 c)에서 첨가된 산은 염산, 황산 및 질산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 수득된 키토올리고당은 조성물 형태로서, 50 내지 80 중량%의 4 내지 8당, 10 내지 20 중량%의 3당, 1 내지 10 중량%의 2당 및 5 내지 30 중량%의 9당 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 제2 면에 따르면,
분해 효소 작용에 의하여 키토산으로부터 키토올리고당을 제조하는 방법으로서,
a') 키토산 투입 라인, 산 수용액 투입 라인, 분해 효소 투입 라인 및 하측에 생성물 배출 라인이 구비된 반응 용기의 키토산 투입 라인을 통하여 적어도 80 메쉬의 사이즈를 갖는 분말 형태의 키토산을 적어도 10 중량%의 농도로 함유하는 키토산-함유 수계 매질을 투입하는 단계;
b') 키토산 투입 라인을 닫고 분해 효소 투입 라인을 개방하여, 분해 효소를 전체 사용량의 25 내지 40%의 량으로 상기 반응 용기 내로 투입함으로써 키토산-함유 수계 매질 내 키토산의 적어도 일부가 가수 분해된 제1 생성물-함유 수계 매질을 형성하는 단계;
c') 효소 투입 라인을 닫고 산 수용액 투입 라인을 개방하여, 농도가 15 중량% 이하인 산 수용액을 첨가함으로써 제1 생성물-함유 수계 매질 내 고형물을 용해시킨 제2 생성물-함유 수계 매질을 제조하는 단계;
d') 산 수용액 투입 라인을 닫고 분해 효소 투입 라인을 개방하여, 분해 효소를 전체 사용량의 60 내지 75 중량%의 량으로 첨가함으로써 제2 생성물-함유 수계 매질 내 키토산이 키토올리고당으로 가수 분해된 제3 생성물-함유 수계 매질을 제조하는 단계;
e') 생성물 배출 라인을 개방하여 상기 제3 생성물-함유 수계 매질을 반응 용기로부터 배출하고, 이를 가압 필터로 이송하여 1차 여과하는 단계;
f') 상기 1차 여과를 거쳐 분리된 1차 여과액을 여과액 저장조로 이송한 후에 여과액 저장조의 분해 효소-함유 하측 부분 및 상측 부분으로 각각 분리하여 분해 효소 회수 라인 및 여과액 이송 라인을 통하여 배출하고, 이때 분리된 분해 효소-함유 하측 부분을 단계 b') 및 단계 d') 중 적어도 하나에 공급하는 단계;
g') 상기 단계 f')에서 분리된 상측 부분을 마이크로 필터로 이송하여 2차 여과액 및 잔여 부분으로 분리하는 단계; 및
h') 상기 2차 여과액을 건조하여 이에 함유된 키토올리고당을 수득하는 한편, 상기 잔여 부분을 여과액 저장조로 리사이클하는 단계;
를 포함하며,
여기서, 상기 분해 효소는 10,000 내지 50,000 unit/g 범위의 활성을 갖는 것으로, 상기 분해 효소의 전체 사용량은 단계 a')에서 반응 용기 내로 투입된 키토산 기준으로 0.05 내지 0.2 중량% 범위에서 정하여지는 방법이 제공된다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 반응 용기는 소정 간격을 두고 이격된 복수의 회전 가능한 다공성 구조물을 더 포함할 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 단계 e')에서 걸러진 고형물은, (i) 상기 단계 a')에 공급하거나, 그리고/또는 (ii) 단계 b') 및 단계 d') 중 적어도 하나에 공급할 수 있다.
본 발명에 따른 키토산으로부터 키토올리고당을 제조하는 방법은 산 첨가 전 및 후에 각각 소정 량의 효소 첨가를 통하여 종래의 효소적 가수분해 방식에서 발생하는 폐기물 발생, 진한 산 첨가에 따른 유독 가스 등의 발생 및 취급성 저하, 생성물 내 낮은 분자량의 키토올리고당의 비율 증가 및 키토올리고당 제조비용 증가와 같은 문제점을 일거에 해결할 수 있다. 더 나아가, 종래 기술에 비하여 많은 량으로 사용되는 분해 효소를 회수하여 재활용할 수 있는 방안을 제시하고 있는 등, 상용화에 유리한 장점을 제공한다. 따라서, 향후 광범위한 적용이 기대된다.
도 1은 종래 기술에 따라 효소 가수분해 방식으로 키토산으로부터 키토올리고당을 제조하는 일련의 절차를 보여주는 순서도이고;
도 2는 일 구체예에 따라 효소의 분할 첨가(투입) 방식을 통하여 키토산으로부터 키토올리고당을 제조하는 일련의 절차를 보여주는 순서도이고;
도 3은 예시적인 구체예에 따라 효소에 의한 가수분해 및 키토올리고당의 분리/회수가 통합된 키토산으로부터 키토올리고당을 제조하는 예시적인 공정을 도시하는 공정도이고; 그리고
도 4a 및 도 4b 각각은 예시적인 구체예에 따른 효소 반응기 내 구조를 개략적으로 도시하는 사시도 및 단면도이다.
본 발명은 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있다. 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 첨부된 도면은 이해를 돕기 위한 것으로, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 있어서, 사용되는 용어는 하기와 같이 정의될 수 있다.
"효소"는 기질에 바인딩되어 화학 반응의 활성화 에너지를 낮추고 효소-기질 복합체를 형성하는 단백질 촉매를 의미할 수 있으며, 전형적으로 기질에 대한 특이성을 나타낸다.
"분해 효소"는 가수 분해에 의하여 키토산을 해중합 또는 저분자화 반응시켜 낮은 분자량의 올리고머 등으로 전환시킬 수 있는 효소를 의미할 수 있다.
"효소 활성"은 1분 동안에 걸쳐 1몰의 글루코사민을 유리하는 효소량을 1 단위(unit)로 정의할 수 있다.
"여과"는 일반적으로 유체가 여과 매질(filtering medium)을 통과할 여과 매질의 포어보다 큰 입자가 걸러지도록 함으로써 유체로부터 고상 입자(고형물)를 분리하는 한편, 여과 매질을 통과한 유체는 여과액으로 배출하는 공정을 의미할 수 있다.
어떠한 구성 성분 또는 단계를 "포함"한다고 할 때, 이는 별도의 언급이 없는 한, 다른 구성 성분 및/또는 단계를 더 포함할 수 있음을 의미한다.
A. 전체적인 개시 내용
본 발명의 일 면에 따르면, 키토산 분해 효소의 작용에 의하여 키토산을 키토올리고당으로 전환시키는 과정에서 산 첨가 단계를 기준으로 키토산 분해 효소를 소정량으로 분할 첨가(투입)하고, 필요에 따라서는 산 첨가 역시 적어도 2회의 분할 첨가를 수반할 수 있다. 또한, 효소에 의한 가수분해에 앞서 수계 매질(구체적으로, 물) 내에 반응물인 키토산을 높은 함량으로 첨가함에도 불구하고 원활히 가수분해를 수행한 결과, 높은 함량의 분해 생성물(고형분)을 함유하는 수계 매질이 수득되어 후속 건조 과정에 소요되는 비용을 저감할 수 있다. 더 나아가, 본 발명의 다른 면에서는 추가적으로 후단 공정인 여과 공정과 통합하고, 이로부터 분리된 효소를 리사이클하여 재활용함으로써 분해 효소의 분할 첨가(또는 투입)에 따른 효소의 전체 사용량 증가를 억제할 수 있다.
키토산-함유 수계 매질의 제조
일 구체예에 따라 효소의 분할 첨가(투입) 방식을 통하여 키토산으로부터 키토올리고당을 제조하는 일련의 절차는 도 2에 도시된 바와 같다.
도 2에 도시된 바와 같이, 먼저 반응 용기 내에 키토산을 투입하는데, 이때 키토산은 수계 매질, 구체적으로 물에 첨가된다.
이와 관련하여, 키토산의 형태는 특별히 한정되는 것은 아니나, 분자 구조 내 키토산의 사슬이 결정성 및 비정질 특성을 모두 포함할 수 있다. 예시적 구체예에 따르면, 키토산의 분자량(Mw)은, 예를 들면 약 50 내지 400 kDa, 구체적으로 약 70 내지 350 kDa, 보다 구체적으로 약 100 내지 300 kDa 범위일 수 있는 바, 키토산의 분자량이 지나치게 높은 경우에는 후속 가수 분해 과정에서 지나치게 높은 탄소수의 당이 형성될 뿐만 아니라, 추가적으로 수행되는 여과 과정에서 생성물의 손실을 야기하여 수율이 저하될 수 있다. 특히, 수계 매질 내에 고함량의 키토산을 첨가할 경우, 겔화물 또는 응집물의 증가뿐만 아니라, 원활한 가수분해 반응을 저해하는 요인으로 작용할 수 있다. 반면, 키토산 분자량이 지나치게 작을 경우에는 최종 생성물 내에 2당 및 3당과 같은 저분자량의 키토올리고당의 함량이 증가하여 바람직한 생성물 분포를 확보하기 곤란하기 때문에 키토올리고당의 활용 범위를 축소시킬 수 있다. 따라서, 전술한 분자량 범위의 키토산을 사용하는 것이 바람직하다. 한편, 키토산의 점도는 분자량과 관련성이 있는 바, 일 예로서, 예를 들면 약 3 내지 30 cps, 구체적으로 약 5 내지 25 cps, 보다 구체적으로 약 10 내지 20 cps 범위일 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 키토산의 탈아세틸화도는, 예를 들면 적어도 약 80%, 구체적으로 적어도 약 90% 이하, 보다 구체적으로 적어도 약 95%, 특히 구체적으로 적어도 약 98%일 수 있으며, 특정 구체예에서 탈아세틸화도는 실질적으로 100%일 수 있다. 이와 같이, 키토산 내 아세틸기를 제거하는 과정은, 예를 들면 약 80 내지 120℃(구체적으로 약 100 내지 110℃)에서 진한 수산화나트륨(예를 들면, 농도 30 내지 50%)으로 처리하는 방식으로 수행될 수 있다. 이와 같이, 키토산 내 아세틸기를 소정 수준 이하로 조절하는 이유는 유리 아미노기를 최대한 많이 함유시킬 필요가 있기 때문이다(즉, 높은 아세틸화도를 갖는 경우, 아민기에 아세틸기가 결합한 부분이 많아 아민기의 기능성 발현(또는 화학적 반응성)이 곤란함을 의미함).
본 구체예에 따르면, 키토산은 소정 사이즈 이하의 분말 형태로 제공될 필요가 있다. 구체적으로, 키토산은 물에 용해되지 않은 상태에서는 효소 분해 반응이 일어나기 어렵다. 다만, 미립자의 분말 형태에서는 콜로이드처럼 존재할 수 있기 때문에 할 경우, 어느 정도 효소에 의한 가수분해 반응이 일어날 수 있다. 이러한 점을 고려하여, 본 발명에서 사용되는 키토산은 적어도 약 80 메쉬, 구체적으로 적어도 약 150 메쉬, 보다 구체적으로 적어도 약 200 메쉬의 분말 형태로 수계 매질에 첨가될 수 있다. 이를 위하여, 입수된 키토산을 당업계에 공지된 분쇄수단, 예를 들면 볼 밀 등을 이용하여 키토산을 소정 사이즈 이하로 분쇄하는 단계가 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서, 반응물인 키토산-함유 수계 매질의 제조 시, 예를 들면 적어도 약 10 중량%, 구체적으로 적어도 약 12 중량%, 구체적으로 약 14 내지 18 중량% 범위의 높은 함량으로 첨가한다는 점을 주목할 필요가 있다. 이는 종래기술에서 대략 5 중량% 또는 그 이하의 농도로 조절하는 점과는 구별되며, 초기 반응물 내 키토산 함량을 증가시킴으로써 최종 생성물(수계 매질 내에 함유됨)의 회수 과정에서 수반되는 건조 등에 수반되는 처리 비용을 절감할 수 있다.
제1 생성물-함유 수계 매질의 제조(1차 효소 첨가 단계)
도 2를 참조하면, 이후 수계 매질 내 키토산을 용해시키기 위하여 산을 첨가하기에 앞서 가수분해 효소를 첨가하는 단계(1차 효소 첨가 단계)가 수행된다.
이와 관련하여, 효소는 키토산을 키토올리고당으로 가수분해시키는 활성을 갖는 한, 특별히 한정되는 것은 아니다. 일 예로서, 분해 효소로서 아스파르질러스 속, 뮤코 속 및 페니실니움 속과 같은 곰팡이류, 스트렙토마이세스 속 및 바실러스 속과 같은 세균류 등으로부터 유래하는 키토사나아제(chitosanase), 키티나아제(chitinase), 리소자임(lysozyme), 베타-글루코시다아제(β-glucosidase), 파파인(papain) 등을 사용할 수 있으며, 상기 나열된 종류를 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 예시적인 키토산 분해 효소 및 성상을 하기 표 1에 나타내었다.
기원 최적 pH 최적 온도(℃)
Bambusa oldhami 3-4 60
Paenibacillus sp. 1794 4.8 80-85
Aspergillus QD-2 5.6 55
Anabaena fertilissima 7.5 27
Streptomyces roseolus 5 50
Acinetobacter calcoaceticus TKU024 6 50
Janthinobacterium sp. 4239 5-7 45
Gongronella sp. JG 5.6 55-60
Serratia marcescens TKU011 5 50
Bacillus cereus D-11 6 60
본 발명에 있어서, 고농도로 첨가된 키토산으로 인하여 부분적으로 겔화 현상이 일어나도 겔 내부에 잔류하여 키토산을 어느 정도 가수분해할 수 있는 효소를 선정하는 것이 바람직할 수 있는 바, 이러한 관점에서 바실러스 속으로부터 유래하는 키토사나아제를 사용할 수 있다. 이와 관련하여, 키토사나아제 중 엑소형의 경우에는 효소 특성 상 1당, 글루코사민 등과 같은 단량체의 생성이 증가할 수 있음을 고려하면, 엔도형의 키토사나아제를 사용하는 것이 바람직하다.
특히, 분해 효소는, 예를 들면 약 10,000 내지 50,000 unit/g, 구체적으로 약 20,000 내지 45,000 unit/g, 보다 구체적으로 약 25,000 내지 40,000 unit/g 범위의 효소 활성을 갖는 종류일 수 있다. 이외에도, 효소의 최적 활성화 pH는, 예를 들면 약 4 내지 7, 구체적으로 약 4.5 내지 6, 보다 구체적으로 약 5 내지 5.5 범위일 수 있다.
이때, 1차 효소 첨가 단계에서 사용되는 효소의 량은 앞선 단계에서 사용되는 전체 효소 사용량을 기준으로, 후속 산 처리 단계를 거친 후에 수행되는 2차 효소 첨가 단계에서 사용되는 효소의 량에 대하여 적절한 비율로 정할 필요가 있다. 구체적으로, 1차 효소 첨가 단계에서는 본 발명의 공정에서 사용되는 분해 효소의 전체 사용량의 약 25 내지 40 중량%, 구체적으로 약 28 내지 37 중량%, 보다 구체적으로 약 30 내지 35 중량% 범위에서 정하여지는 량으로 분해 효소를 첨가할 수 있는 바, 이는 후술하는 2차 효소 첨가 단계에 비하여 상대적으로 낮은 수준이다. 이때, 1차 효소 단계에서 분해 효소가 일정 수준 미만의 량으로 사용될 경우, 고함량의 키토산이 함유된 수계 매질 내 분해 효소의 함량이 낮아 키토산을 가수분해하기 곤란하기 때문에 효소의 분할 첨가에 따른 장점을 구현하는데 한계가 있는 반면, 분해 효소의 첨가량이 지나치게 많은 경우에는 효소의 총 사용량을 증가시켜 경제성 면에서 바람직하지 않다. 따라서, 전술한 범위 내에서 조절하는 것이 유리하다.
한편, 도시된 구체예에서 분해 효소는 분말 형태로 첨가될 수도 있으며, 택일적으로 물에 용해시킨 수용액 또는 분산액 형태로 첨가할 수 있다. 또한, 분해 효소의 종류에 따라서, 소량의 산 또는 염기를 첨가하여 겔 내부에 존재하는 효소의 작용에 의한 가수분해 반응을 촉진할 수도 있다. 또한, 양이온성을 나타내는 키토산으로 인하여 수계 매질 내 pH가 증가할 경우에는 키토산의 용해성 저하로 인하여 원하는 수준의 가수분해를 수행하기 곤란한 만큼, 효소의 활성에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 산을 소량 첨가할 수도 있다.
예시적 구체예에 따르면, 제1 효소 첨가 단계 중 효소에 의한 가수분해는 교반 조건 하에서 수행될 수 있는 바, 이때 회전 속도는, 예를 들면 약 50 내지 200 rpm, 구체적으로 약 100 내지 150 rpm 범위에서 정하여질 수 있으나, 이는 예시적인 취지로 이해될 수 있다. 또한, 가수분해 반응은 효소의 종류에 따라 정하여질 수 있으나, 예를 들면 약 35 내지 60℃, 구체적으로 약 40 내지 55℃, 보다 구체적으로 약 45 내지 50℃의 범위에서 조절 가능하며, 또한 반응 시간은, 예를 들면 약 3 내지 50 시간, 구체적으로 약 5 내지 30 시간, 보다 구체적으로 약 7 내지 20 시간의 범위 내에서 조절 가능하다.
본 발명에 있어서, 1차 효소 첨가 단계에서 효소 첨가 초기에는 겔화 현상이 유발될 수 있으나, 겔 내부에 함유된 효소의 작용에 의하여 가수분해 반응이 일어나며, 그 결과 제1 생성물-함유 수계 매질이 생성된다. 다만, 수계 매질 내에 상당량의 키토산이 균일하게 용해되지 않은 상태로 존재할 수 있다.
제2 생성물-함유 수계 매질의 제조(산 수용액 첨가 단계)
도 2에 따르면, 1차 효소 첨가 단계 이후, 제1 생성물-함유 수계 매질에 산 수용액을 첨가하여 제2 생성물-함유 수계 매질을 제조하는 단계가 수행된다. 이때, 산(산 수용액) 첨가는 수계 매질 내에 용해되지 않은 상태로 존재하는 키토산을 용해시켜 후속 2차 효소 첨가 단계에서 충분한 가수분해가 일어날 수 있도록 하기 위함이다.
도시된 구체예에 따르면, 산은 무기산인 강산을 사용할 수 있는 바, 유기산을 사용하는 경우에 비하여 고농도의 키토올리고당-함유 생성물을 얻는데 유리하기 때문이다. 이러한 강산의 예로서 염산, 황산, 질산 등을 들 수 있으며, 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 염산을 사용할 수 있는 바, 후술하는 바와 같이 염산을 당량 이하로 첨가할 경우(묽은 염산을 사용할 경우), 과도한 분자량 저하 등의 현상이 발생하지 않기 때문이다.
본 발명에 있어서, 주목할 점은 종래기술에서와 달리 묽은 산(산 수용액)을 첨가하는 것이다. 묽은 산 수용액을 사용할 경우, 진한 산(대략 35 중량%)을 사용할 때 발생하는 유독 가스의 생성 등의 문제점을 완화시킬 수 있고, 취급성 면에서도 유리하다. 또한, 진한 농도의 산 첨가 시 생성된 키토올리고머의 분자량이 과도하게 감소하는 현상을 억제할 수 있다. 이와 관련하여, 묽은 산 수용액의 농도는, 예를 들면 약 15 중량% 이하, 구체적으로 약 10 중량% 이하, 보다 구체적으로 약 5 내지 9 중량% 범위에서 정하여질 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 산 수용액의 첨가량은 앞선 1차 효소 첨가 단계에서 생성된 제1 생성물-함유 수계 매질 내에 미분해 상태의 고형물로 존재하는 키토산을 용해시켜 균일한 매질을 형성할 수 있는 범위에서 정하여질 수 있다. 일 예로서, 제2 생성물-함유 수계 매질 내 미분해 상태의 고형물(또는 불용분) 함량이, 예를 들면 약 10 중량% 미만, 구체적으로 약 5 중량% 미만, 보다 구체적으로 약 2 중량% 미만이 되도록 첨가할 수 있다. 일 예로서. 산 수용액(염산 수용액)의 농도가 9%인 경우, 키토산 100중량부 기준으로, 예를 들면 약 110 내지 150 중량부, 구체적으로 약 120 내지 140 중량부, 보다 구체적으로 약 130 내지 135 중량부 범위에서 조절될 수 있다.
산 수용액의 첨가로 인하여 제1 생성물-함유 수계 매질 내 효소의 활성이 저감되어 분해 반응은 서서히 진행될 수 있고, 또한 충분한 시간 동안 유지할 경우에는 다시 균일한 용액 형태로 전환될 수 있다. 이와 관련하여, 산 첨가 및 유지 시간은, 예를 들면 약 1 내지 24 시간, 구체적으로 약 2 내지 12 시간, 보다 구체적으로 약 4 내지 6 시간 범위 내에서 조절될 수 있다. 또한, 키토산의 용해를 촉진할 수 있도록 교반 조건 하에서 산 수용액을 첨가할 수 있는 바, 이때 회전 속도는, 예를 들면 약 20 내지 100 rpm, 구체적으로 약 40 내지 90 rpm, 보다 구체적으로 약 50 내지 80 rpm 범위에서 조절할 수 있다.
다른 예시적 구체예에 따르면, 산 수용액은 적어도 2회에 걸쳐 분할 방식으로 첨가할 수 있다. 구체적으로, 효소는 강산과의 접촉 시간이 증가할수록 실활되는 경향을 갖기 때문에 분할 방식으로 첨가하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 분할 첨가 방식에 의하여 키토산의 용해된 부분이 증가하면서 강산과의 접촉 시간이 감소하기 때문에 효소의 실활을 억제하는데 유리하다. 예시적 구체예에 따르면, 분할 첨가 간격은, 예를 들면 약 0.1 내지 3 시간, 구체적으로 약 0.5 내지 2.5 시간, 보다 구체적으로 약 1 내지 2 시간 범위에서 정하여질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
제3 생성물-함유 수계 매질의 제조(2차 효소 첨가 단계)
도 2를 참조하면, 산 수용액의 첨가 다음에는 균일한 상태의 제2 생성물 내 잔여 키토산을 키토올리고당으로 전환시키기 위하여, 2차 효소 첨가 단계를 수행한다.
2차 효소 첨가 단계에서 사용하는 효소는 1차 효소 첨가 단계에서 사용된 범위 내에서 선정하여 첨가할 수 있다. 택일적으로, 1차 효소 첨가 단계 및 2차 효소 첨가 단계에서의 매질 환경(예를 들면, pH 및/또는 온도)이 구별될 경우, 필요에 따라서는 각각의 단계마다 상이한 분해 효소를 사용할 수 있다.
이와 관련하여, 2차 효소 첨가 단계에서는 전체 공정 중 분해 효소의 전체 사용량에서 1차 효소 첨가 단계에서 사용된 량을 제외한 나머지의 분해 효소를 첨가할 수 있는 바, 예시적으로 약 60 내지 75 중량%, 구체적으로 약 63 내지 72 중량%, 보다 구체적으로 약 65 내지 70 중량% 범위일 수 있다.
본 발명에 있어서, 분해 효소의 전체 사용량은 반응물인 키토산-함유 수계 매질 내 키토산 기준으로, 약 0.05 내지 0.2 중량%, 구체적으로 약 0.06 내지 0.15 중량%, 보다 구체적으로 약 0.08 내지 0.12 중량% 범위 내에서 정하여질 수 있다. 본 발명에 있어서, 2차 효소 첨가에 의한 가수분해를 통하여 키토산의 대부분은 이보다 저분자량의 올리고머 형태로 전환되며, 이때 전환된 키토올리고당의 평균 분자량(Mw)은, 예를 들면 약 20 kDa 이하, 구체적으로 약 15 kDa 이하, 보다 구체적으로 약 12 kDa 이하의 범위일 수 있다.
이처럼, 산 수용액의 첨가 전 및 후에 효소를 분할 첨가함에 따라 산 수용액의 첨가에 의하여 앞서 1차 첨가된 효소가 실활되기 때문에, 산 수용액 첨가 후 효소 첨가 방식(통상적으로, 키토산 기준으로 약 0.04 중량% 이하로 첨가됨)에 비하여 효소의 전체 사용량은 증가하게 된다. 예를 들면, 단일 효소 첨가 방식에 비하여, 예를 들면 약 30% 이상, 구체적으로 약 40% 이상, 보다 구체적으로 약 50 내지 70% 효소 사용량이 증가하기는 하나, 키토산 대비 효소의 사용량 비가 상당히 낮기 때문에 원가 상승에 중대한 영향을 미치지는 않는다. 오히려, 반응물인 키토산-함유 수계 매질 내 키토산의 함량을 증가시키면서 제조 공정을 운전할 수 있기 때문에 결과적으로 형성되는 제3 생성물-함유 수계 매질 내 키토올리고당의 농도(함량)은 현저히 증가한다. 따라서, 가수분해 반응의 후처리 공정(예를 들면, 건조 공정)을 효율적으로 수행할 수 있는 만큼, 효소 사용량의 증가를 초과하는 운전비용 절감 효과를 제공할 수 있다.
한편, 2차 효소 첨가 단계의 반응 조건은 1차 효소 첨가 단계에서 기술된 범위 내에서 동일하거나 상이하게 조절될 수 있는 바, 중복되는 기재는 생략하기로 한다.
키토올리고당의 회수
본 발명에 따르면, 2차 효소 첨가 단계를 거쳐 형성된 제3 생성물-함유 수계 매질을 건조시켜 분말 형태로 제조될 수 있다.
선택적으로, 건조에 앞서 제3 생성물이 후속 공정에 앞서 효소에 의하여 지속적으로 분해되어 지나치게 낮은 키토올리고당이 형성되는 것을 억제할 목적으로 효소의 실활 단계를 수행할 수 있다. 이를 위하여, 제3 생성물-함유 수계 매질을, 예를 들면 약 65 내지 95℃, 구체적으로 약 70 내지 90℃, 보다 구체적으로 약 75 내지 85℃로 승온시켜 분해 효소의 활성을 저감하는 단계를 더 수행할 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 제3 생성물-함유 수계 매질은 동결 건조, 열풍 건조, 분무 건조 등과 같이 당업계에서 공지된 방식으로 건조될 수 있다. 이때, 분무 건조가 바람직할 수 있다. 분무 건조는 고온(예를 들면, 약 150 내지 200℃, 구체적으로 약 160 내지 180℃)의 유입 공기를 도입하여 수행될 수 있고, 미립화 공기 압력은, 예를 들면 약 1.5 내지 5 bar, 구체적으로 약 2 내지 4 bar 범위에서 조절될 수 있다.
분말 형태로 회수된 키토올리고당은 다양한 중합도를 갖는 올리고당 화합물의 조성물 형태로 수득될 수 있다. 이와 관련하여, 과도하거나 불충분한 가수분해로 인하여 3당 이하 또는 9당 이상의 키토올리고당이 주로 생성될 경우, 적용 분야에 있어서는 바람직하지 않을 수 있으며, 4당에서 8당까지의 키토올리고당의 함량을 일정 수준 이상으로 유지하는 것이 바람직할 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 수득된 키토올리고당 중 4 내지 8당의 함량은, 예를 들면 약 50 내지 80 중량%, 구체적으로 약 55 내지 75 중량% 범위일 수 있다. 2당 및 3당의 함량 각각은, 예를 들면 약 1 내지 10 중량%(구체적으로, 약 3 내지 7 중량%), 그리고 약 10 내지 20 중량%(구체적으로 약 12 내지 17 중량%) 범위일 수 있다. 또한, 9당 이상의 함량은, 예를 들면 약 5 내지 30 중량%(구체적으로 약 10 내지 20 중량%) 범위일 수 있다. 이외에도, 소량의 단당류, 불순물 등이 함유될 수 있다.
B. 가수분해 및 키토올리고당의 분리/회수가 통합된 공정
효소에 의한 가수분해 유닛 및 키토올리고당의 분리/회수 유닛이 통합된 예시적인 공정은 도 3에 도시된 바와 같다.
도 3을 참조하면, 통합 공정은 크게 반응 용기(101), 가압 필터(106), 여과액 저장조(108) 및 마이크로 필터(109)를 구비한다. 이때, 각각의 라인을 통하여 반응 용기(101) 내로 도입되는 유체 흐름은 당업계에 공지된 밸브를 이용하여 개폐 및/또는 이송량을 조절할 수 있다.
도시된 구체예에 있어서, 반응 용기(101)는 키토산 투입 라인(103), 산 수용액 투입 라인(104), 및 분해 효소 투입 라인(105)이 구비되어 있다. 또한, 가수분해 반응 생성물을 반응 용기(101) 외부로 배출하기 위하여 반응 용기(101)의 하측에 생성물 배출 라인이 구비되어 있다. 또한, 반응이 용이하도록 교반기(102)가 구비되어 있다.
먼저, 키토산 투입 라인(103)을 통하여 키토산-함유 수계 매질을 투입한다. 그 다음, 키토산 투입 라인(103)을 닫고 분해 효소 투입 라인(105)을 개방하여 반응 용기(101) 내로 소정 량의 분해 효소(구체적으로, 물에 용해되거나 분산된 형태)를 도입하여 1차 효소 첨가에 따라 수계 매질 내 키토산의 적어도 일부가 가수 분해된 제1 생성물-함유 수계 매질을 형성할 수 있다.
이와 같이, 1차 효소 첨가에 따른 부분적인 가수분해 단계가 수행되어 종료하면, 효소 투입 라인을 닫고 산 수용액 투입 라인(104)을 개방하여 산 수용액을 반응 용기(101) 내로 도입한다. 그 결과, 앞선 1차 효소 첨가 단계에서도 용해되지 않은 키토산을 비롯하여 고형물(구체적으로 겔화물)의 상당량이 용해됨에 따라, 비교적 균일한 상태의 제2 생성물-함유 수계 매질이 형성될 수 있다.
그 다음, 산 수용액 투입 라인(104)을 닫고 분해 효소 투입 라인(105)을 다시 개방하여, 공정에서 사용되는 분해 효소의 전체 량의 잔여부(필요 시 그 이상의 량)를 반응 용기(101) 내로 이송하는 방식으로 2차 효소 첨가 단계를 수행한다. 이에 따라, 제2 생성물-함유 수계 매질 내에 함유된 키토산 대부분이 키토올리고당으로 가수 분해된 제3 생성물-함유 수계 매질을 형성할 수 있다.
도시된 구체예에 따르면, 제3 생성물-함유 수계 매질은 반응 용기(101) 하측과 연통된 배출 라인을 통하여 가압 필터(107)로 이송하여 매질 내 고형분을 제거하고 여과액을 배출한다(1차 여과). 이때 압착을 위하여 압축기(compressor)가 구비되는 바, 가압 필터의 여과 압력은, 예를 들면 약 0.3 내지 5 기압, 구체적으로 약 0.5 내지 3 기압, 보다 구체적으로 약 1 내지 2 기압의 압력을 가할 수 있다. 이후, 가압 필터를 거친 여과액(1차 여과액)은 밸브 조작에 의하여 여과액 저장조(108)로 이송된다. 여과액 저장조(108)에서는 전단에서 이송된 1차 여과액 및 후단의 마이크로 필터(109)로부터 리사이클되는, 2차 여과액을 제외한 잔여 흐름(부분)이 도입된다.
한편, 가압 필터(108)에서 걸러진 여과액 이외의 부분(분리된 고형물)의 경우, 미반응 키토산, 효소, 기타 불순물 등을 함유할 수 있는 바, 물 저장조(도시되지 않음)로부터 공급된 물(예를 들면, 약 30 내지 50℃)을 이용하여 가압 필터로부터 분리되어 배출될 수 있다. 이때, 가압 필터에 의하여 분리된 고형물의 입자는, 전형적으로 약 10 ㎛ 이상, 보다 전형적으로 약 20 ㎛ 이상, 특히 전형적으로는 약 50 ㎛ 이상의 사이즈를 가질 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 분리 배출된 고형물 내 효소, 키토산 잔여물 등을 재활용하기 위하여, 가압 필터로부터 분리 배출된 고형물을 리사이클하여 신규 키토산-함유 수계 매질과 조합하여 반응 용기(101) 내로 도입할 수 있다. 이와 함께, 또는 별도로, 분리 배출된 고형물을 1차 효소 첨가 단계 및 2 효소 첨가 단계 중 적어도 하나로 리사이클할 수도 있다.
상술한 바와 같이, 가압 필터로부터 배출된 1차 여과액은 여과액 저장조(108)에서 마이크로 필터(109)로부터 이송되는 잔여 흐름(부분)과 조합되는 바, 여과액 저장조(108) 내 내용물의 하측 부분은 분해 효소 회수 라인(110)을 통하여 배출된다. 이때, 배출된 하측 부분은 미세한 고형물이 함유될 수 있으며, 특히 분해 효소 등을 함유할 수 있다. 이러한 분해 효소-함유 부분(유체)은 1차 효소 첨가 단계 및 2차 효소 첨가 단계 중 적어도 하나에 리사이클될 수 있다.
한편, 여과액 저장조의 상측 부분(1차 여과액을 함유함)은 여과액 저장조로부터 배출되어 마이크로 필터(109)로 이송되어 2차 여과 단계를 거치게 된다. 마이크로 필터(109)의 경우, 전형적으로 약 10 ㎛ 이하, 보다 전형적으로 약 5 ㎛ 이하, 보다 구체적으로 약 0.1 내지 3 ㎛ 범위의 고형물 입자를 걸러 분리하게 된다(2차 여과). 예시적으로, 마이크로 필터에 가해지는 구동 압력은, 예를 들면 약 0.5 내지 5 기압, 구체적으로 약 0.8 내지 4 기압, 보다 구체적으로 약 1 내지 3 기압 범위일 수 있다. 2차 여과 과정에서 분리된 2차 여과액은 키토올리고머를 함유하는 수용액(또는 수분산액) 형태로 배출되어 후공정을 거쳐 회수될 수 있다. 또한, 2차 여과 과정에서 걸러진 잔여 부분은 여과액 저장조(108)로 이송한다.
상술한 바와 같이, 분해 효소에 의한 키토산의 가수분해 유닛 및 키토올리고당의 분리/회수(정제) 유닛을 통합한 공정을 구현할 경우, 2단의 여과 공정을 통하여 분리된 효소-함유 부분을 리사이클하여 효소 첨가 단계에서 재활용할 수 있는 바, 산 수용액 처리 전 및 후에 효소를 첨가함으로써 야기되는 효소의 총 사용량 증가에 따른 손실을 상쇄시킬 수 있다. 더 나아가, 2단 여과 공정 중 가압 필터로부터 분리 배출되는 1차 여과액 이외의 고형물을 신규 반응물과 함께 조합하거나, 그리고/또는 효소 첨가 단계로 리사이클함으로써 전체 공정의 생성물 수율을 높일 수 있을 뿐만 아니라, 사용된 분해 효소를 재활용할 수 있는 추가적인 방안을 제공한다.
한편, 예시적인 구체예에 따른 효소 반응기 내 구조를 도 4a 및 도 4b에 각각 개략적으로 도시하였다.
상기 도면을 참조하면, 효소 반응 및 산 첨가에 의한 효과를 개선하기 위하여, 통상의 교반기(102)를 대체하여 개선된 반응 용기(200)가 사용된다. 도시된 구체예에 따르면, 교반기 축(204)에 소정 간격을 두고 이격된 복수의 회전 가능한 다공성 구조물(203)을 구비한다. 이때, 각각의 다공성 구조물(203)은 요부가 형성된 지지 부재(202)에 안착되어 교반 과정에서도 안정적으로 지지될 수 있도록 구성된다. 상기 지지 부재의 주연부 또는 테두리는 요부에 안착된 다공성 구조물(203)이 회전 운동 과정에서 이탈되지 않도록 하는 치수로 도출될 수 있도록 구성되고, 추가적으로 다공성 구조물을 고정 또는 체결할 수 있는 별도의 수단이 구비될 수도 있다. 도시된 구체예에서는 2개의 다공성 구조물(203)이 구비되어 있으나, 이는 예시적인 것으로 다공성 구조물의 개수는 변화 가능하다. 또한, 다공성 구조물의 사이즈는 반응 용기의 규모 등에 따라 변화할 수 있고, 이의 단면은 원형 이외에 다양한 형상, 예를 들면 타원형 등도 가능하다.
예시적으로, 다공성 구조물은 표면에서 효소와 반응물이 원활히 접촉할 수 있고, 균일한 혼합이 일어나는데 적합한 유체 흐름 특성을 제공할 수 있는 재질 및 기하학적 형상을 갖도록 구성되는 것이 바람직하다. 이러한 재질의 예로서, 플라스틱 또는 수지계 재질(예를 들면, 폴리프로필렌(PP), 폴리에틸렌(PE), 폴리염화비닐(PVC), 폴리카보네이트(PC), 폴리에스테르, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET), 폴리우레탄(PU) 등), 무기계(예를 들면, 실리콘, 유리, 세라믹 등), 각종 유기계 (예를 들면, 페이퍼, 섬유, 가죽 등), 금속계(예를 들면, 구리(Cu), 알루미늄(Al), 스테인레스 스틸(SUS), 금(Au), 은(Ag), 티타늄(Ti) 등)을 들 수 있다.
예시적 구체예에 있어서, 다공성 구조물은 도시된 바와 같이 메쉬 타입의 구조물일 수 있다. 이러한 구조물의 경우, 예를 들면 금속(예를 들면 스테인레스 스틸(SUS), 구리, 알루미늄, 티타늄 등) 메쉬 구조, 섬유(예를 들면, 나일론, 폴리에스테르, 폴리우레탄, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 테플론(Teflon) 등) 메쉬 구조, 페이퍼(예를 들면, Kimtech 페이퍼, 니트로셀룰로오스 페이퍼, 필터 페이퍼), 세라믹 필터 구조물 등일 수 있다. 특정 구체예에 따르면, 다공성 구조물은 스테인리스 스틸 재질일 수 있는 바, 강도 및 내구성이 양호하고, 또한 키토산-함유 용액의 경우에는 중금속 흡착능이 우수하기 때문에 다른 금속성 재질을 사용할 경우에는 식품 등의 분야에서는 적합하지 않을 수 있기 때문이다.
예시적 구체예에 따르면, 다공성 구조물로서 2차원 또는 3차원 구조 또는 구조물을 특별한 제한 없이 사용할 수 있으나, 지지 부재(202)에 안착되어 회전하는 과정에서 이탈되지 않도록 2차원 형상을 갖는 것이 유리할 수 있다. 이와 같이, 다공성 구조물을 사용할 경우, 보다 높은 표면적을 제공할 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 다공성 구조물은 메쉬 망 형태일 수 있는 바, 이때 포어 사이즈 및 메쉬를 구성하는 금속 또는 섬유 스트랜드의 두께(직경)는, 각각 예를 들면 약 0.1 내지 1000 ㎛(구체적으로 약 1 내지 500 ㎛, 보다 구체적으로 약 10 내지 50 ㎛) 및 약 1 내지 1000 ㎛(구체적으로 약 10 내지 500 ㎛, 보다 구체적으로 약 50 내지 100 ㎛) 범위에서 정하여질 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 명확히 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적에 불과하며 발명의 영역을 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예
교반기가 구비된 플라스크에 증류수 500 mL를 투입하고, 탈아세틸화도가 약 99%인 키토산(Mw: 292.2 kDa)을 첨가하고 상온에서 교반하여 약 15%(w/w) 농도의 키토산-함유 분산물을 제조하였다. 이후, Bacillus sp.로부터 유래된 엔도 타입의 키토사나아제(분자량: 45 kDa; 효소 활성: 35,000 unit/g)를 증류수 400 mL에 앞서 첨가된 키토산 기준으로 0.02%(w/w)의 량으로 투입하면서 40℃에서 120 rpm의 속도로 8 시간 동안 교반시켰다. 그 다음, 묽은 염산 수용액(농도: 9%(w/w))을 33 mL씩 같은 량으로 분할하고, 2 시간 간격으로 투입하여 육안으로 구별되는 불용분이 사라질 때까지 70 rpm의 속도로 교반하였다.
산 첨가 및 유지 과정이 종료된 다음에는 동일한 키토사나아제를 앞서 첨가된 키토산 기준으로 0.04%(w/w)의 량으로 투입하면서 40℃에서 120 rpm의 속도로 15 시간 동안 교반시켰고, 85℃를 승온시켜 30분 동안 처리함으로써 효소를 실활시켜 가수분해 반응을 종료하였다.
상술한 과정을 통하여 수득된 생성물 용액을 폴리에스테르계 여과포를 사용한 소형 가압 필터(여과 압력: 0.7 기압) 및 마이크로 필터(포어 직경: 약 0.7 ㎛; 구동 압력 1 기압)를 순차적으로 거치도록 하여 여과액을 수득하였다. 수득된 여과액의 농도는 11.2%(w/w)이었다. 이를 분무 건조기(상품명: PC-18; 공기 온도: 170℃; 공기 압력: 2.5 bar)를 이용하여 건조시켜 분말 형태의 생성물을 수득하였다.
HLPC 및 분자량 측정장치(Y-500)를 이용하여 수득된 가수분해 생성물(수율: 95%)의 성상 및 성분을 분석하였다.
분석 결과, 생성물의 평균 분자량(Mw)은 약 14.2 kDa이었다. 또한, 생성물의 조성은, 키토올리고당 기준으로, 2당 5.3 중량%, 3당 12.5 중량%, 4당 20.3중량%, 5당 14.2중량%, 6당 12.1중량%, 7당 8.6중량%, 8당 7,1 중량%, 그리고 9당 이상 및 기타 화합물이 밸런스로 함유되었다.
비교예 1
반응물인 키토산-함유 수분산물 중 키토산 농도를 5 중량%로 조절하였고, 1차 효소 첨가 단계 없이 키토산-함유 분산물 내에 농축 염산(35%(w/w))을 첨가하여 키토산을 균일하게 용해시켰다. 그 과정에서 염산 특유의 이취가 감지되었다.
그 다음, 실시예 1에서와 동일한 키토나아제를 사용하여 앞서 첨가된 키토산 기준으로 0.04%(w/w)의 량으로 투입하면서 40℃에서 120 rpm의 속도로 23 시간 동안 교반시켰고, 85℃를 승온시켜 30분 동안 처리함으로써 효소를 실활시켜 가수분해 반응을 종료하였다. 생성물을 실시예 1에서와 동일하게 가압 필터 및 마이크로 필터를 거쳐 분리과정을 수행한 후, 분무 건조기를 이용하여 건조시켜 분말 형태의 생성물을 수득하였다. 수득된 분말 생성물의 량은 실시예 1에 비하여 약 42%(중량 기준) 수준이었다.
생성물의 성상 및 조성 분석 결과, 평균 분자량(Mw)은 약 0.72 kDa이었다. 또한, 생성물의 조성은, 키토올리고당 기준으로, 2당 35.3 중량%, 3당 22.5 중량%, 4당 13.3중량%, 5당 6.2중량%, 6당 5.1중량%, 7당 3.3중량%, 8당 2,7 중량%, 그리고 9당 이상 및 기타 화합물이 밸런스로 함유되었다. 분석 결과, 실시예 1에 비하여 저분자량의 키토올리고당의 함량이 증가한 반면, 4 내지 8당의 함량은 상당히 감소함을 알 수 있다.
비교예 2
실시예 1에서와 동일한 키토산-함유 수분산물(15%(w/w))을 사용하되, 1차 효소 단계를 수행하지 않고, 효소 첨가 단계에서 첨가된 키토산 기준으로 0.06%(w/w)의 량으로 투입하면서 가수분해를 수행하였다. 이후, 실시예 1에서와 동일한 절차를 거쳐 여과액을 수득하였다. 그 과정에서 겔화물이 다량으로 생성됨을 육안을 관찰할 수 있었고, 해당 겔화물은 후처리 공정인 2단 여과 과정에서 걸러져 분리되었다. 수득된 여과액의 농도는 4.1%(w/w)이었다. 또한, 분무 건조를 통하여 수득된 분말 생성물은 실시예 1 대비 약 32%(중량 기준) 수준이었는 바, 이는 반응물 내에 고함량으로 함유된 키토산의 상당 부분이 겔화되어 키토올리고당으로 전환되지 않고 여과 과정에서 제거되었음을 지시한다.
실시예 2
가압 필터 및 마이크로 필터 각각으로부터 분리된 여과액 이외의 성분을 증류수로 2회 세척하고 건조시킨 후에 분해 효소로 재사용한 것을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 절차에 따라 키토올리고당을 제조하였다. 그 결과, 2단 여과를 거쳐 수득된 여과액의 농도는 약 9.3%(w/w)이었고, 분무 건조를 거쳐 얻어진 분말 생성물은 실시예 1에 비하여 약 84% 수준이었다.
또한, 생성물 분석 결과, 평균 분자량(Mw)은 약 17.2 kDa이었다. 또한, 생성물의 조성은, 키토올리고당 기준으로, 2당 7.1 중량%, 3당 10.9 중량%, 4당 15.9중량%, 5당 17.1중량%, 6당 18.1중량%, 7당 10.6중량%, 8당 8,1 중량%, 그리고 9당 이상 및 기타 화합물이 밸런스로 함유되었다.
상술한 결과는 재사용된 분해 효소를 신규 분해 효소와 적절히 조합할 수 있는 통합 공정으로 구성할 경우, 비교예 1에 비하여 신규 분해 효소의 사용량이 증가하더라도 리사이클을 통하여 분해 효소의 사용량 증가에 따른 비용 증가를 상쇄시킬 수 있음을 시사한다.
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 모두 본 발명의 영역에 속하는 것으로, 본 발명의 구체적인 보호범위는 첨부된 특허청구범위에 의하여 명확해질 것이다.

Claims (8)

  1. 분해 효소 작용에 의하여 키토산으로부터 키토올리고당을 제조하는 방법으로서,
    a) 수계 매질 내에 적어도 80 메쉬의 사이즈를 갖고 분자량(Mw)이 50 내지 400 kDa 범위인 분말 형태의 키토산을 14 내지 18 중량%의 농도로 첨가하여 키토산-함유 수계 매질을 제조하는 단계;
    b) 상기 키토산-함유 수계 매질에 분해 효소를 전체 사용량의 25 내지 40 중량%의 량으로 첨가하여 키토산-함유 수계 매질 내 키토산의 적어도 일부가 가수 분해된 제1 생성물-함유 수계 매질을 형성하는 단계;
    c) 상기 제1 생성물-함유 수계 매질에 10 중량% 이하의 농도를 갖는 산 수용액을 첨가하여 제1 생성물-함유 수계 매질 내 고형물을 용해시킨 제2 생성물-함유 수계 매질을 제조하는 단계, 상기 산 수용액 내 산은 염산, 황산, 질산 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 무기 강산이고, 또한 상기 첨가되는 산 수용액의 량은 제2 생성물-함유 수계 매질 내 불용분의 함량이 2 중량% 미만이 되는 범위에서 정하여짐;
    d) 상기 제2 생성물-함유 수계 매질에 분해 효소를 전체 사용량의 60 내지 75 중량%의 량으로 첨가하여 제2 생성물-함유 수계 매질 내 키토산이 키토올리고당으로 가수 분해된 제3 생성물-함유 수계 매질을 제조하는 단계; 및
    e) 상기 제3 생성물-함유 수계 매질을 건조하여 이에 함유된 키토올리고당을 수득하는 단계;
    를 포함하며,
    여기서, 상기 분해 효소는 10,000 내지 50,000 unit/g 범위의 활성을 갖는 것으로, 상기 분해 효소의 전체 사용량은 단계 a)에서 첨가된 키토산 기준으로 0.05 내지 0.2 중량% 범위에서 정하여지고, 그리고
    상기 수득된 키토올리고당은 조성물 형태로서, 55 내지 80 중량%의 4 내지 8당, 10 내지 20 중량%의 3당, 1 내지 10 중량%의 2당 및 5 내지 30 중량%의 9당 이상을 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계 a)에서 첨가된 키토산의 탈아세틸화도는 적어도 80%이고, 그리고
    상기 단계 a)에서 첨가된 키토산의 분자량(Mw) 및 점도(20℃) 각각은 50 내지 400 kDa 및 3 내지 30 cps 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단계 c) 중 산 수용액을 적어도 2회에 걸쳐 분할 방식으로 동일한 체적으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 삭제
  5. 분해 효소 작용에 의하여 키토산으로부터 키토올리고당을 제조하는 방법으로서,
    a') 키토산 투입 라인, 산 수용액 투입 라인, 분해 효소 투입 라인 및 하측에 생성물 배출 라인이 구비된 반응 용기의 키토산 투입 라인을 통하여 적어도 80 메쉬의 사이즈를 갖고 분자량(Mw)이 50 내지 400 kDa 범위인 분말 형태의 키토산을 14 내지 18 중량%의 농도로 함유하는 키토산-함유 수계 매질을 투입하는 단계;
    b') 키토산 투입 라인을 닫고 분해 효소 투입 라인을 개방하여, 분해 효소를 전체 사용량의 25 내지 40 중량%의 량으로 상기 반응 용기 내로 투입함으로써 키토산-함유 수계 매질 내 키토산의 적어도 일부가 가수 분해된 제1 생성물-함유 수계 매질을 형성하는 단계;
    c') 효소 투입 라인을 닫고 산 수용액 투입 라인을 개방하여, 10 중량% 이하의 농도를 갖는 산 수용액을 첨가함으로써 제1 생성물-함유 수계 매질 내 고형물을 용해시킨 제2 생성물-함유 수계 매질을 제조하는 단계, 상기 산 수용액 내 산은 염산, 황산, 질산 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 무기 강산이고, 또한 상기 첨가되는 산 수용액의 량은 제2 생성물-함유 수계 매질 내 불용분의 함량이 2 중량% 미만이 되는 범위에서 정하여짐;
    d') 산 수용액 투입 라인을 닫고 분해 효소 투입 라인을 개방하여, 분해 효소를 전체 사용량의 60 내지 75 중량%의 량으로 첨가함으로써 제2 생성물-함유 수계 매질 내 키토산이 키토올리고당으로 가수 분해된 제3 생성물-함유 수계 매질을 제조하는 단계;
    e') 생성물 배출 라인을 개방하여 상기 제3 생성물-함유 수계 매질을 반응 용기로부터 배출하고, 이를 가압 필터로 이송하여 1차 여과하는 단계;
    f') 상기 1차 여과를 거쳐 분리된 1차 여과액을 여과액 저장조로 이송한 후에 여과액 저장조의 분해 효소-함유 하측 부분 및 상측 부분으로 각각 분리하여 분해 효소 회수 라인 및 여과액 이송 라인을 통하여 배출하고, 이때 분리된 분해 효소-함유 하측 부분을 단계 b') 및 단계 d') 중 적어도 하나에 공급하는 단계;
    g') 상기 단계 f')에서 분리된 상측 부분을 마이크로 필터로 이송하여 2차 여과액 및 잔여 부분으로 분리하는 단계; 및
    h') 상기 2차 여과액을 건조하여 이에 함유된 키토올리고당을 수득하는 한편, 상기 잔여 부분을 여과액 저장조로 리사이클하는 단계;
    를 포함하며,
    여기서, 상기 분해 효소는 10,000 내지 50,000 unit/g 범위의 활성을 갖는 것으로, 상기 분해 효소의 전체 사용량은 단계 a')에서 반응 용기 내로 투입된 키토산 기준으로 0.05 내지 0.2 중량% 범위에서 정하여지고,
    상기 수득된 키토올리고당은 조성물 형태로서, 55 내지 80 중량%의 4 내지 8당, 10 내지 20 중량%의 3당, 1 내지 10 중량%의 2당 및 5 내지 30 중량%의 9당 이상을 포함하며,
    상기 단계 e')에서 걸러진 고형물은, (i) 상기 단계 a')에 공급하거나, 그리고/또는 (ii) 단계 b') 및 단계 d') 중 적어도 하나에 공급하고,
    상기 반응 용기는 소정 간격을 두고 이격된 복수의 회전 가능한 다공성 구조물을 더 포함하며, 이때 상기 다공성 구조물은 요부가 형성된 지지 부재에 안착되고, 상기 지지 부재의 주연부 또는 테두리는 요부에 안착된 다공성 구조물이 회전 운동 과정에서 이탈되지 않도록 하는 치수로 도출되어 있으며, 그리고
    상기 다공성 구조물은 나일론, 폴리에스테르, 폴리우레탄, 폴리에틸렌테레프탈레이트 및 테플론으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 섬유 재질의 메쉬 망 형태로서 포어 사이즈 및 메쉬를 구성하는 섬유 스트랜드의 직경은, 각각 0.1 내지 1000 ㎛ 및 1 내지 1000 ㎛ 범위에서 정하여지는 방법.
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