KR100367992B1 - 올리고키토산의제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 갑각류의 게에서 추출한 키틴으로부터 얻은 키토산을 묽은 염산수용액에 용해시키고, 효소를 첨가하여 가수분해시키고, 가수분해된 반응액을 80-100℃의 온도로 가열하여 효소를 실활시키고, 효소실활된 반응액을 미세여과하여 불순물을 제거하고, 불순물이 제거된 여액을 분말화시켜 올리고키토산을 제조함으로써 중합도가 5-10인 올리고키토산의 제조방법에 관한 것이다.

이러한 올리고 키토산의 제조방법은 대량생산에 적용하여 순도 높은 올리고키토산을 생산하고 또한 공정을 최적화함으로써 수율을 극대화시킬 수 있다.

Description

올리고 키토산의 제조방법

본 발명은 키토산을 이용한 올리고 키토산의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 주요 중합도가 5-10인 올리고키토산의 제조방법에 관한 것이다.

키토산의 전구체인 키틴은 아미노당으로 구성되어 있는 다당류의 일종으로서, 산업적으로 이용되는 원료는 게나 새우이다. 예전에는 이들의 껍질에 붙어 있는 단백질이 부패하여 악취 뿐만 아니라 그들의 강한 결합으로 인하여 용해성이 좋지 않기 때문에 산업 폐기물로 취급되어 왔으나 최근에는 여러 분야에서의 소재로 주목을 받고 있는 관계로 폐기물 처리 문제와 천연자원의 이용 면에서 키틴에 대한 많은 연구가 진행 중에 있다.

키토산은 키틴을 탈아세틸화시킨 물질로서 분자량에 따라 동맥경화와 심장병을 예방하는 탈콜레스테롤 작용(Lipids, 1988, 23, 187-91), 간장기능의 강화작용, 상처치유 및 세포재생 효과와 세균 억제효과 등의 효능· 효과(Advances in chitin and chitosan, 5th international conference on chitin and chitosan held in princeton)가 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 키토산은 이러한 여러 생리활성 및 물리화학적 특성을 지니고 있지만 키토산을 녹일 수 있는 용매는 몇 가지 용매를제외하고는 극히 제한되어 있다.

최근에는 키토산을 화학적 방법 및 효소적 방법에 의하여 가수분해시켜 저분자량의 올리고키토산을 제조하는 방법이 개발됨에 따라서 이의 효능· 효과가 알려지고 있으며, 용도개발에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히 현재까지 밝혀진 연구 결과에 의하면 올리고키토산중 효능을 나타낼 수 있는 당은 중합도가 5이상이 되야 한다. 그러나 현재 화학적 방법 및 효소적 방법에 의하여 제조되는 올리고키토산은 중합도가 2-4인 것이 대부분이거나 또는 중합도가 30이상이다.

기존의 올리고 키토산을 제조하는 방법으로서는 농염산을 이용한 가수분해 방법, HF를 이용한 방법 및 NaNO₂를 이용한 방법이 있다. 그러나 이러한 화학적 방법들은 반응조건이 까다로울 뿐만 아니라 불순물의 제거가 어렵기 때문에 대량생산이 어렵고, 분리에 따른 비용이 많이 소요된다. 뿐만 아니라 화장품 및 식품에의 응용에는 어려움이 있다.

최근에는 키토산나아제를 이용한 효소적 가수분해 방법에 대한 많은 연구가 이루어지고 있으나 이 방법에 의한 대부분의 올리고키토산은 중합도가 2-4당이 주를 이루며, 아직은 키토산나아제의 활성 및 기질에 대한 특이성에 대한 것은 연구단계에 있다. 또한 이러한 키토산나아제의 가격이 상당히 비싸기 때문에 대량생산에의 적용에 많은 어려움이 수반된다.

본 발명자는 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 예의 연구 검토한 결과,구조적으로 유사한 셀룰로오즈(cellulose)의 가수분해 효소인 셀룰라제(cellulase)를 이용하여 2당에서 10당의 올리고 키토산을 분리 및 제조하는 방법을 개발하였으며 이를 대량생산에 적응하여 순도 높은 올리고 키토산을 생산하고 또한 공정을 최적화함으로씨 수율을 극대화시키는데 성공함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 주요 중합도가 5-10인 올리고키토산의 제조 및 분리하는 방법과 이의 대량생산방법에 기초를 두고 있다.

본 발명을 보다 상세히 설명하면 키틴을 40-50%(w/v) 수산화나트륨수용액에 침적시킨후 90-120℃에서 탈아세틸화시켜 키토산을 얻고, 이후 충분히 수세된 저분자량의 키토산을 이용하여 묽은 염산용액과 혼합하여 키토산 용액을 제조한다(고분자량의 키토산은 용매에 대한 용해도가 저분자량의 키토산과 비교하여 현저히 낮으며 용액의 점도가 높기 때문에 교반의 어려움이 있으며 이에 따른 수율의 저하를 가져오므로 올리고 키토산을 제조하기에는 저분자량의 키토산을 이용함이 적당하다). 키토산이 완전히 용해된후 용액의 온도를 45-50℃부근으로 조절하고 이후 알칼리수용액(소듐 바이카보네이트 수용액)을 서서히 첨가하여 pH를 4.5-5.0로 조절한다. 이는 셀루라제의 최적 활성을 띄는 조건이다. 본 발명에서 사용한 셀룰라제는 트리코더마 비리드(Trichoderma viride)에서 기원된 것으로써 엔도(endo)형이며, 가수분해반응에 의한 올리고 키토산의 분자량은 셀룰라제의 기질 즉, 키토산에 대한 농도와 반응시간, 용액의 pH에 따라 좌우된다.

효소의 농도는 기질 대비 0.1-3%로 사용되며 시간은 6-48시간으로 조절하는것이 적절하다. 효소실활을 위하여 80-100℃로 가열하여 미세여과를 통하여 효소를 제거하고, 이후 결정화 공정을 통하여 물을 제거한후 고순도의 미황색 올리고 키토산을 얻는다. 반응시간이 6시간 이하일 경우 최종제품에서 단백질의 함량이 높아져 적합하지 않고 48시간이 넘을 경우 너무 심한 분해로 인한 이당류, 삼당류의 분포가 많아지며 제품의 성상에도 불리하다.

이하 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

(비교예 1)

본 실험은 화학적 가수분해방법에 의한 올리고키토산의 제조방법이다.

저분자량 키토산을 묽은 염산용매에 용해시켜 NaNO₂수용액(10% w/v)을 서서히 첨가시켜 반응을 진행시켰다. 이때 NaNO₂의 양은 키토산과의 몰비를 계산하여 첨가한다. 본 비교예에서는 올리고 키토산의 DP(degree of polymerization)2와 DP6을 기준으로 제조하였다. 반응 온도는 6-10℃를 유지시켰으며 반응시간은 6시간으로 정하였다. 반응 종료시 최종 pH는 4-5이며 이후 중화반응을 거쳐 여과후 NaBH₄를 서서히 첨가시켰다. 이것은 용액중 올리고 키토산의 말단기에 존재하는 알데히드기를 환원시키기 위함이다. 이후 2-3시간 동안 충분히 교반후, 분리· 정제를 거쳐 올리고 키토산을 회수하였다.

회수된 올리고키토산을 완전히 건조시킨 후 올리고키토산 수용액을 제조하여 박층 크로마토그래피로 분자량 분포를 확인하였다. 박층 크로마토그래피의 플레이트는 실리카겔이 도포되어 있는 것을 사용하였으며 전개는 이소프로판올, 피리딘,아세트산, H₂O를 10 : 4 : 6 : 10의 중량비로 혼합한 용매를 사용하였으며 발색시약은 닌히드린 시액을 사용하였다.

전개결과 DP2와 DP6 모두 전개가 안되었다. 따라서 DP2, DP6의 분자중합도는 실제로는 중합도 6을 훨씬 넘는 것으로 보인다.

(실시예 1)

저분자량 키토산, 농염산, 이온수의 질량비를 3:2:95의 비율로 혼합하여 키토산 3%용액으로 제조하였다. 키토산을 완전히 용해시킨후 온도를 50℃로 고정시키고, 이 상태에서 소듐 바이카보네이트 수용액(10w/v%)을 서서히 첨가하여 pH를 4.5-5.0로 맞추었다. 이 조건은 셀룰라제의 최적 활성 조건이다. 셀룰라제를 5-10w/v%수용액으로 제조한 후 키토산에 대하여 0.1%의 양을 키토산용액에 가한후 서서히 교반하여 6시간 반응시켰다. 이후 반응액을 90-100℃에서 20-30분 동안 가열하여 효소를 실활시켜 반응을 종료시킨후 규조토여과를 하여 불순물을 제거하였다. 여액을 1/5이상 농축한후 95% 에탄올을 농축액의 4-5배부피 가하여 올리고 키토산을 회수하였다.

이후 완전히 건조된 올리고 키토산을 수용액으로 제조한후 박층크로마토그래피로 전개시킨 결과, 전개가 안되었다(전개조건은 비교예 1과 동일하다). 따라서 이 조건에서 제조된 올리고 키토산의 중합도는 DP10이상인 것으로 예상된다.

(실시예 2)

키토산에 대한 셀룰라제의 농도를 1%로 한 것을 제외한 나머지 반응조건은실시예 1과 동일하게 하였다.

회수된 올리고 키토산을 박층 크로마토그래피로 전개시킨 결과 전개가 안되었다. 실시예 1과 마찬가지로 중합도가 DP10이상인 것으로 예상된다.

(실시예 3)

효소를 키토산에 대하여 3% 첨가하고, 나머지 반응조건은 실시예1과 동일하게 하였다.

박층 크로마토그래피로 전개시킨 결과 DP2-10까지 고른 분포를 나타내었다. 박층 크로마토그래피 전개 결과는 아래와 같다.

(실시예 4)

효소를 키토산에 대하여 3% 첨가하고 반응시간을 15, 24, 48시간으로 변화시켜 가며 올리고 키토산을 제조하였다.

제조된 각각의 올리고키토산에 대하여 박층 크로마토그래피를 이용하여 분자량 분포를 조사하였다. 전개 결과 15, 24, 48시간의 분자량은 6시간동안 반응시킨 올리고 키토산에 비하여 DP10 부근이 희미한 것으로 보아 DP10이상의 분자가 상대적으로 적은 것으로 예상된다.

박층 크로마토그래피 전개 결과는 아래와 같다.

이상의 결과를 바탕으로 공장생산에 적용할 경우 다음의 3가지 문제가 발생할 수 있다.

첫째, 키토산의 농도가 3%이기 때문에 배치(batch)당 생산수율이 3%를 넘을 수 없다. 따라서 생산수율이 현저히 낮기 때문에 제조원가면에서 다른 제품에 비하여 경쟁력이 없다.

둘째, 제조된 올리고키토산의 분리, 정제공정중 효소실활공정후 여과공정을 거친 여액에서 올리고키토산을 분리하기 위하여 에탄올을 첨가하여 올리고키토산의 용해도를 저하시켜 침전을 형성시킨다. 그러나 올리고키토산은 분자량이 작기 때문에 침전에 사용되는 에탄올의 양은 상당한 양을 필요로 한다. 따라서 이에 따른 원료의 비용이 상승하여 제조원가에 상당한 영향을 미치게 된다.

셋째, 키토산의 용해액에 완충액(buffer)인 탄산수소나트륨수용액을 첨가하여 pH를 조절하는데 이때 해리된 나트륨이온과 염소이온이 결합하여 올리고키토산의 생성시 염을 형성하여 같이 침전되게 된다. 따라서 생성된 올리고키토산의 맛을 보면 짠맛을 강하게 느낄 수 있다. 이는 올리고키토산의 순도를 떨어뜨릴 수 있다.

위의 문제점은 다음과 같은 키토산의 특성을 이용함으로써 해결할 수 있다.

키토산의 말단기에 있는 아민기는 키토산이 염산수용액에 용해될 때 -NH₃+의 형태로 용해된다. 따라서 키토산이 용해됨에 따라 자연히 pH는 상승하게 된다. 이런 원리를 이용하여 키토산의 용해도한계범위에서 함량을 높이면 완충액(buffer)를 사용하지 않고 pH를 조절할 수 있다. 이에 따라서 생산수율을 높일 수 있으며, 완충액(buffer)를 사용하지 않음으로써 염의 생성을 방지하여 제품의 순도를 향상시킬 수 있다.

다음의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

(실시예 5)

염산 2.05%수용액을 제조한후 키토산을 서서히 첨가하여 용액의 pH를 50℃에서 4.7-4.8을 유지시켰다. 이때 키토산의 농도는 4.67%이다. 이후 셀룰라제를 기질에 대하여 3%첨가한 후 15시간동안 가수분해를 시켰다. 이 조건에서 셀룰라제는 최적의 활성을 띄어 DP 6-10의 올리고키토산을 생성할 수 있게 된다. 가수분해후 효소를 실활시킨후 제거하고 농축을 하여 부피를 반으로 줄인후에 분무건조를 하여 미세한 분말의 올리고키토산을 얻었다. 이때 분무건조 입구의 온도는 120℃로 조절하였는데 입구온도가 너무 높게되면 제품이 갈변화되기 때문에 분무건조기입구의 온도를 적절하게 조절함은 제품의 질을 결정함에 중요한 요인이 된다. 이와같이 수득된 올리고키토산에서는 짠맛을 전혀 느낄 수 없었다.

위의 실시예 1-4에서는 올리고키토산을 회수하기위해서 1/5농축을 한후 4-5배의 에탄올을 가하여 침전시키며, 미립자의 분말을 얻기위해 다시 분쇄공정을 거친후 수분을 줄이기 위해 건조공정을 해야하는 번거로움과 동시에, 공정의 복잡화로 인한 제조경비가 상승하게 된다. 그러나 실시예 5에서와 같이 분무건조공정을 통하여 이러한 여러 공정을 한 공정으로 단순화시켜 제조경비의 상승을 줄일 수 있을 뿐만 아니라 최종제품의 수율도 에탄올을 이용한 공정보다 높은 80-90%로 높일 수 있다.

(실시예6)

실시예 5에서와 같은 비율로 키토산을 용해시켜 50℃에서 pH를 4.7-4.9로 조절한후 셀룰라제를 2%첨가하여 4시간동안 부분가수분해시킨 다음 염산 2%수용액을 서서히 가하여 용액의 pH를 1-2정도로 맞춘후 키토산을 가하여 pH를 4.7-4.9로 상승시켰다. 이때 pH 4.7-4.9까지 올리는데 소요된 키토산의 양은 초기 투여된 키토산의 약 60-70%정도이다. 이후 셀루라제를 3%첨가하여 15시간동안 가수분해를 진행시킨 다음 효소를 실활시켜 반응을 끝낸후 효소를 제거하고 농축공정을 거치지 않고 바로 분무건조를 하였다. 고형분의 함량이 8%이상이면 분무건조를 위한 조건이 되므로 농축을 할 필요가 없는 것이다. 이 방법에 의하여 실시예 5에서보다 약 1.7배 높은 수율을 얻을 수 있었다. 박층크로바토그래피 전개결과 실시예 4의 15시간 결과와 동일하였다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 올리고 키토산의 제조방법은 대량생산에 적용하여 순도 높은 올리고 키토산을 생산하고 또한 공정을 최적화함으로써 수율을 극대화시킬 수 있다.

Claims (1)

1. 갑각류의 게에서 추출한 키틴으로부터 얻은 키토산을 묽은 염산수용액에 용해시키고, 효소를 첨가하여 가수분해시킨후, 가열하여 효소를 실활시키고, 여과 및 분말화공정을 거쳐 올리고 키토산을 제조하는 방법에 있어서,

   묽은 염산수용액에 상기 키토산을 용해시켜 pH 4.7-4.9로 조정하고, 이때 키토산 용액의 pH 조정은 완충액(buffer)을 사용하지 않고 키토산의 용해도한계범위에서 키토산의 함량을 높여 조정하여 키토산 용액을 얻고,

   얻어진 키토산 용액에 트리코더마 비리드 유래의 엔도형 셀룰라제를 키토산에 대해 0.1-3중량% 첨가하여 키토산을 부분가수분해시킨 후, 다시 묽은 염산수용액을 가하여 키토산용액의 pH를 1-2 정도로 낮추고 다시 키토산을 첨가하고 pH를 4.7-4.9로 올린 다음 셀룰라제를 0.1-3중량% 첨가하여 2차로 가수분해시키고, 이때 가수분해반응은 45-50℃의 온도에서 6-48시간 반응시키고,

   가수분해된 반응액을 80-100℃의 온도로 가열하여 효소를 실활시키고,

   효소실활된 반응액을 미세여과하여 불순물을 제거하고,

   불순물이 제거된 여액을 농축공정을 거치지 않고 곧바로 분무건조하는 일련의 공정으로 이루어진 것을 특징으로 하는 중합도 5-10인 올리고키토산의 제조방법.