KR0145132B1 - 키토올리고당의 효소적 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 천연 또는 분리정제된 키틴 또는 전처리된 키틴을 원료로 각종 키틴 분해 효소를 이용하여 가능성 키토올리고당을제조하는 과정에서 분쇄 마찰매체 효과를 줄수 있는 고형상의 매체를 첨가 교반함으로써 효소반응을 촉진시켜 키토올리고당의 생성수율과 반응속도를 현저히 증가시키는 분쇄마찰매체 효소반응계를 이용한 기능성 키토올리고당의 효소적 제조법에 관한 것이다.

본 발명에 의한 키토올리고당의 제조는 결정형 키틴 또는 전처리된 키틴을 250g/ℓ까지 완충용액에 현탁시키고, 기틴 분해 효소를 10~1,000units/g 키틴이 되도록 첨가하여 20~70℃에서 반응시켜 키토올리고당을 제조하는 과정에서 고형상의 분쇄마찰매체를 50~800g/ℓ까지 첨가하여 교반제조하는 것으로 기존의 다른방법에 비하여 높은 생성수율가 반응속도로 키토올리고당을 얻을 수 있는 고효율의 제조방법이다.

Description

키토올리고당의 효소적 제조방법

도1:본 발명에서 키토올리고당량의 변화를 시간이 경과함에 따라 관찰한 결과의 도표.

도2:본 발명에서 반응액의 키토올리고당의 조성을 고압 액체크로마 토그라피로 분석한 결과로서

(가):분쇄마찰 매체를 첨가하지 않은 경우

(나):분쇄마찰 매체를 첨가한 경우

도3:본 발명에서 키토올리고당량의 변화를 시간이 경과함에 따라 관찰한 결과의 도표

도4:본 발명에서 반응시간에 따른 키토올리고당 생성량을 측정한 결과의 도표.

본 발명은 천연, 분리정제, 또는 전처리된 키틴을 원료로 각종 키틴 분해 효소를 이용하여 기능성 키토올리고당을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 특히 효소반응시 분쇄마찰매체 효과를 줄 수 있는 고형상의 매체를 첨가 교반함으로서 효소반응을 촉진시켜 키토올리고당의 생성수율과 반응속도를 현저히 증가시키도록 한 분쇄마찰매체 효소반응계를 이용한 기능성 키토올리고당의 효소적 제조방법에 관한 것이다.

키토올리고당이란 엔아세틸글루코사민 단량체가 한분자에서 열분자까지 베타-1, 4- 결합된 키틴올리고당과 단량체로 디아세틸글루코사민이 중합된 구조를 갖고 있는 키토산올리고당을 의미한다.

키토올리고당은 항종양, 항암, 항진균 및 면역부활 촉진효과와 같은 각종 기능성을 갖고 있다.

또한 인체에서 칼로리화되지 않고 장내 유산균에 의해 대사가 이루어짐으로써 장내 유용세균의 증식을 촉진하며, 또한 기존의 감미료인 설탕이나 멕아당과 혼합 사용할 경우 기능성 당으로도 이용될 수 있다.

따라서 최근 식품, 의약품등 여러 분야에서 점차 그 이용이 증가되고 있다.

원료인 키틴은 자연계에 섬유소 다음으로 풍부한 매년 재생되는 자원으로 갑각류나 곤충의 껍질, 연체동물의 기관, 균류의 세포벽, 식물세포의 벽등에 존재하며, 게껍질의 70%, 곤충류 껍질의 30~60%, 연체동물 표피 중량의 40% 전후를 이루고 있다.

그 구조는 엔아세틸글루코사민이 베타-1, 4- 결합된 중합체이며, 무기염인 탄산칼슘, 단백질, 카로틴과 같은 색소들과 복합체로 존재한다.

또한 키토산올리고당 생성을 위한 기질로 사용되는 키토산은 키틴을 고농도 수산화나트륨으로 처리하여 엔아세틸 결합을 가수분해하여 아세틸기를 제거함으로써 얻어진다.

키토올리고당의 제조방법으로는 결정형 키틴을 강산으로 가수분해시켜 저분자의 키토올리고당을 얻는 화확적 제조방법과 키틴 분해 효소를 사용하는 효소적 제조방법이 있다.

화확적 제조방법은 농축 염산등으로 키틴을 저온에서 12시간 이상 교반시키면서 반응시켜 저분자 상태의 키토올리고당을 생성시키는 방법이다.

이와 같은 화확적 제조방법은 강산에 의하여 키틴 고분자가 무작위로 가수분해됨으로써 적절한 분자크기의 키토올리고당을 얻기 어렵고 가수분해후 당생성물을 다시 중화시켜야 하는 공정상의 결점을 지니고 있다.

효소적 제조방법을 이용할 경우, 사용 효소의 종류, 첨가량, 그리고 효소반응 조건을 변화시켜 키토올리고당의 분자 크기를 조절할 수 있어 화학적 가수분해 방법보다는 효율적인 제조방법이라고 볼 수 있다.

그러나 자연상태의 키틴 또는 키토산과 같은 전처리된 키틴은 키틴 분해 효소에 의해 쉽게 분해되지 않는 결정 구조를 이루고 있어 효소 가수분해작용이 매우 어려워 키토올리고당 생성수율이 매우 낮은 문제점이 있다.

이러한 문제점을 해결코자 혈정형 키틴을 전처리하여 구조를 변형시켜 사용하는데, 그 방법으로는 강산으로 부분 가수분해시켜 교질상태의 키틴으로 만들거나 인산으로 처리하여 팽윤상태의 키틴으로 구조를 변형시켜 원료로 사용하고 있다.

이와 같이 전처리된 키틴을 제조하는 경우 강산으로 전처리한 후 이를 다시 중화시키는 공정이 필요하며, 구조변형된 키틴 또는 키토산의 회수율이 50%정도로 원료의 손실이 많아 경제적 손실이 큰 공정상의 결점이 있다.

또한 이와 같이 전처리된 키틴을 효소반응 기질로 이용하여도 현재의 방법으로는 키토올리고당의 수율이 20~30% 정도의 수준에 머무르로 있어 이에 대한 개선이 필요하다.

본 발명자들은 생전분의 효소 당화시 고형 마찰매체를 첨가하여 교반시켜줌으로써 효소반응 속도와 수율을 현저히 증가시키는 고형 분쇄마찰매체를 이용한 생전분의 무증자 당화법(한국특허 제27323 호) 및 분쇄마찰매체 함유 불균일상 효소반응계를 활용한 생전분의 직접 전환에 의한 맥아당 제조법(한국특허 제58329 호)에 관한 발명을 완성한 바 있다.

이러한 분쇄마찰매체 함유 효소반응계를 사용할 경우 불용성 전분은 고형매체의 마찰작용과 효소의 침식작용의 상호보완작용으로 단편화되므로서 효소작용이 매우 용이하게 되어 기존의 중자액화를 통한 제조방법보다 높은 반응속도와 생산수율을 얻을 수 있었으며, 또한 분리정제 공정상의 잇점도 갖고 있었다.

최근 본 발명자들은 키틴 분해 효소를 이용하여 기능성 키토올리고당의 제조에 관한 연구를 수행하였는데, 그 결과 결정형 키틴을 키틴 분해 효소만으로 키토올리고당을 생성시킬 경우 키토올리고당 수율이 매우 낮고 반응속도도 느려 장시간 반응시켜야 되는 문제점이 야기되었으며, 이에 대한 개선이 필요함을 알았다.

이를 개선할 목적으로 본 발명자들은 생전분의 당화공정에 적용시킨 바있는 분쇄마찰매체 함유 효소반응계를 키토올리고당 제조에 적용시켰으며, 그 결과 첨가된 분쇄마찰매체에 의하여 키틴의 구조가 단편화됨으로써 효소작용을 받을 수 있는 가용표면적이 현저히 증가됨으로서 키틴의 분해가 촉지되어 당생성수율과 속도가 현저히 증가됨을 알아 본 발명을 완성하였다.

본 발명을 보다 구체적으로 설명하면, 기질로는 천연 결정형 키틴, 분리 정제된 결정형 키틴, 또는 키토산, 콜로이달키틴, 팽윤 키틴과 같은 전처리된 키틴을 사용한다.

키틴 분해효소로는 아스파르질러스속, 뮤코속, 페니실니움속등의 곰팡이류와 스트렙조마이세스속, 바실러스속등의 세균류들이 생산하는 엔도형 및 엑소형 키티네이즈와 키토사네이즈, 그리고 라이소자임을 사용한다.

고형 분쇄마찰매체로는 유리구, 테프론, 세라믹, 신소재 등과 같은 구형, 타원형, 무정형 등 여러 형태의 고형매체를 사용하며, 구형을 주로 사용하지만 그 모양은 크게 중요하지 않다.

또한 고형 분쇄마찰매체의 크기는 직경 3㎜정도가 적절하지만 다른 크기의 것도 사용할 수 있다.

분쇄마찰매체를 포함한 반응액의 교반 및 혼합에는 회전축과 회전익을 이용한 기계적 교반, 반응기 자체를 교반시키는 회전통 교반기, 유체를 활용한 유동층 반응기등 반응액을 원활히 분쇄마찰시킬 수 있는 구조를 지닌 반응기이면 된다.

교반강도는 원활한 효소반응을 촉진시킬 수 있도록 키틴의 구조를 변화시키는데 적절한 교반속도를 이용하여야 하며, 과다한 교반은 효소를 실활시켜 역효과를 주게 된다.

원료인 결정형 키틴의 첨가농도는 10~250g/ℓ 정도가 적당하며, 결정형 키틴 기질당 적정 키틴 분해 효소의 첨가비율은 키틴 분해 효소의 종류에 따라 다르나 10~1,000units/g 키틴 정도가 적절하다.

분쇄마찰매체 첨가량은 50~800g/ℓ가 적합하며, 효소의 반응온도 범위는 최적 온도인 20~70℃ 전후이다.

반응액의 pH는 사용하는 키틴 분해 효소의 종류 및 기원에 따라 다르나 적정 pH 범위는 3.5~9.0 정도이다.

본 발명을 실시예에 따라 상세히 설명하면 다음과 같다.

[실시예1]

분리정제된 결정형 키틴 50g을 인산완충용액(pH7.0) 1.0ℓ에 현탁시키고, 아스파르질러스속이 분비하는 키틴 분해 효소 200units와 직경 3㎜의 유리구 300g을 첨가하여 50℃에서 200rpm으로 60시간동안 교반하므로서 키토올리고당 생성반응을 수행하였다.

이때 생성된 키토올리고당의 변화를 시간이 경과함에 따라 관찰한 결과는 도1과 같다.

또한 비교를 목적으로 분쇄마찰매체를 첨가하지 않을 경우도 포함시켰다.

본 발명에 의한 경우 48시간 반응후 당생성 수율이 44%였으며 기존의 제조방법인 분쇄마찰매체를 첨가하지 않은 경우의 15%에 비하여 크게 향상되었다.

또한 반응액의 키토올리고당의 조성을 고압액체크로마토그라피로 분석한 결과는 도2와 같으며, 분쇄마찰매체를 첨가하지 않은 경우와 그 조성은 거의 유사하였으며, 중합도가 1에서 6인 각종 키토올리고당이 생성되었다.

도2에서의 시간( )은 효소반응시간임.

도2 중 숫자부호 설명

1;엔아세틸디글루코사민, 2;키토바이오즈, 3;키토트리오즈, 4;키토테트라오즈, 5;키토펜타오즈, 6;키토헥사오즈

[실시예2]

강염기로 전처리하여 아세틸기를 제거한 결정형 키토산을 원료로 사용하고 그외의 방법은 실시예 1과 동일한 조건으로 분쇄마찰매체 함유 불균일상 효소 반응계에서의 키토산올리고당을 생성반응을 수행하였다.

이때 생성된 전체 키토산오리당량의 변화를 시간이 경과함에 따라 관찰한결과는 도3과 같다. 또한 비교를 목적으로 분쇄마찰매체를 첨가하지 않을 경우도 포함시켰다.

본 발명에 의한 경우 48시간 반응후 당생성 수율이 48%였으며, 기존의 제조방법인 분쇄마찰매체를 첨가하지 않은 경우의 17%에 비하여 크게 향상되었다.

[실시예3]

진한 염산용액으로 전처리된 콜로이달 키틴을 원료로 하고 그외의 방법은 실시예1에서와 같은 조건으로 분쇄마찰매체 함유 불균일상 효소반응계에서 키토올리고당 생성반응을 수행하였을 때 반응시간에 따른 키토올리고당 생성량을 측정한 결과는 도4와 같다.

본 발명에 의한 경우 48시간 반응후 당생성 수율이 65%였으며, 기존의 제조방법인 분쇄마찰매체를 첨가하지 않은 경우의 30%에 비하여 크게 향상되었다.

Claims (3)

1. 원료인 키틴을 10/`250g/ℓ까지 완충용액에 현탁시키고, 키틴 효소를 10~1,000units/g 키틴이 되도록 첨가하여 20~70℃에서 반응시켜 키토올리고당을 제조하는 과정에서 고형상의 분쇄마찰매체를 50~800g/ℓ까지 처가하여 교반하여 줌으로써 효소반응을 촉진시켜 수율과 반응속도가 현저히 증가되도록 하는 키토올리고당의 효소적 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 원료 키틴으로 천연 또는 분리정제된 키틴, 키토산, 전처리된 콜로이달키틴, 팽윤 키틴과 같은 불용성 또는 현탁성 키틴을 사용하는 키토올리고당의 효소적 제조방법.
3. 제1항에 있어서,키틴 분해효소로 아스파르질러스속, 뮤코속, 페니실니움속과 같은 곰팡이류, 스트렙토마이세스속 및 바실러스속과 같은 세균류, 식물, 그리고 동물류에 의해 분비되는 키틴 분해효소, 키토산 분해효소, 그리고 라이소자임을 사용하는 키토올리고당의 효소적 제조방법.