JPH05320204A - Ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 アセチル化度が10〜30％であるキトサンをバ
チルスNo.7-M（FERM P-8139)により生産されるキトサナ
ーゼによって分解した後、N-アセチル化することを特徴
とする、N-アセチルキトオリゴ糖の製造法。 【効果】 産業上有用な重合度が５〜７のN-アセチルキ
トオリゴ糖を効率的に製造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、N-アセチルキトオリゴ
糖、特に産業上有用である重合度が5 〜7 のN-アセチル
キトオリゴ糖を効率的に製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】キチンはエビやカニ等の甲殻類の殻から
得られる多糖類であって、セルロースと極めてよく似た
化学構造を有しており、セルロースを構成するグルコー
スの２位の水酸基がアセトアミド基で置換された2-アセ
トアミド-2-デオキシ-D-グルコース（N-アセチル-D-グ
ルコサミン）がβ-1,4-結合した直鎖状の多糖類であ
る。

【０００３】キチンを塩酸等で加水分解すると、単糖で
あるN-アセチル-D-グルコサミンのほか、N-アセチルキ
トビオース(GlcNAc)₂ 、N-アセチルキトトリオース(Glc
NAc) ₃ 、N-アセチルキトテトラオース(GlcNAc)₄ 、N-ア
セチルキトペンタオース(GlcNAc)₅ 、N-アセチルキトヘ
キサオース(GlcNAc)₆ 及びN-アセチルキトヘプタオース
(GlcNAc)₇ 等のN-アセチルキトオリゴ糖が生成する。

【０００４】N-アセチルキトオリゴ糖は、以前から有用
な物質として知られていたが、最近、これらのオリゴ糖
のうち比較的重合度の大きいものについて新しい報告が
幾つかあり、その有用性について注目されている。例え
ば、N-アセチルキトヘキサオースについてはマウスのsa
rcoma-180,MM-46,Meth-A solid tumorらのガン細胞に対
する生育阻害作用を有するという報告(A.Tokoro,et a
l.,Chem.Pharm.Bull.,36,784(1988)及びK.Suzuki,et a
l.,Carbohydr.Res.,151 403(1986)) やメロンのキチナ
ーゼのエリシターとしての働きがあるという報告(D.Rob
y,et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,143,885 (198
7))がある。また、N-アセチルテトラオースからN-アセ
チルヘプタオースのオリゴ糖については、好中球の免疫
活性を亢進するはたらきがあるという報告(S.Suzuki, e
t al.,"Chitin in Nature and Technology" ed by R.Mu
zzarelli,et al.,Plenum, New York, 1985,pp485-492)
がある。このように、N-アセチルキトオリゴ糖、特に重
合度の比較的大きいオリゴ糖は食品添加物、医薬品、生
化学材料等として、広範な用途に利用することができ、
このため、これらを経済的に製造する技術の開発が望ま
れていた。

【０００５】これまで、N-アセチルキトオリゴ糖の製造
方法としては、主に塩酸等の酸を利用するものが多く、
例えば、キチンを塩酸で加水分解して、N-アセチルキト
オリゴ糖を得る方法（J.A.Rupley,Biochim.Biophys.Act
a.,83,245-255 (1964)およびM.A.Raftery,et al.,Anal.
Biochem.,30,427-435 (1969))、またキトサンを塩酸加
水分解後、N-アセチル化し、N-アセチルキトオリゴ糖を
得る方法(S.A.Berker,et al.,J.Chem.Soc.,1958,2218-2
227 (1958))、あるいはキチンをフッ化水素で加水分解
して、N-アセチルキトオリゴ糖を得る方法(C.Bosso,et
al.,Carbohydr.Res.,156,57-68 (1986))が知られてい
た。

【０００６】しかし、これらの方法はいずれも、キチン
またはキトサンの大部分が単糖まで分解されてしまうた
め、産業上有用な重合度5 〜7 の高重合度N-アセチルキ
トオリゴ糖を効率良く調製することは困難であった。ま
た、このような酸の他、微生物の産生する酵素もキチ
ン、キトサンを分解することが知られている。例えばバ
チルス(Bacillus sp.)R-4 の生産するキトサナーゼ(Y.T
ominaga,Y.Tsujisaka,Biochimica et Biophysica Acta,
410,145-155 (1975)) 、ペニシリウム・イスランディク
ム(Penicillium islandicum)の生産するキトサナーゼ
(D.M.Fenton et al,Journal of General Microbiology,
126,151-165(1981))、バチルス(Bacillus sp.)99-5の生
産するキトサナーゼ（堀内、日本農芸化学会、昭和59年
度大会、講演要旨集、第550 頁）、ストレプトマイセス
(Streptomyces sp.)(J.S.Price,et al.,Journal of Bac
teriology,124,1574-1585 (1975)) およびストレプトマ
イセス・グリセウス(Streptomyces griseus)の生産する
キトサナーゼ(A.Ohtakara,"Chtin,Chitosan and Relate
d Enzymes",142-160(1984)Academic Press) と数多くの
報告例があるが、キトサンに作用させた後、N-アセチル
化することにより、N-アセチルキトオリゴ糖を著量に生
産するという報告は見当たらない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、微生
物の産生する酵素を利用し、N-アセチルキトオリゴ糖、
特にN-アセチルキトペンタオース、N-アセチルキトヘキ
サオース、及びN-アセチルキトヘプタオースを高収率で
得ることができる製造方法を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、微生物の
産生する酵素を利用して、N-アセチルキトオリゴ糖の前
駆物質であるキトサンオリゴ糖を製造する方法について
鋭意研究を行った結果、バチルス属に属する微生物の生
産するキトサナーゼを用いることにより、キトサンから
比較的重合度の大きいオリゴ糖を高収率で得られること
を見出し、さらに酵素の基質として、アセチル化度が10
〜30％であるキトサンを用いることにより、更にその収
率が向上することを見出し、これらの知見に基づき本発
明を完成するに至った。

【０００９】すなわち、本発明はキトサンをバチルス属
に属する微生物により生産されるキトサナーゼによって
分解した後、N-アセチル化することを特徴とする、N-ア
セチルキトオリゴ糖の製造法である。また、本発明は、
バチルス属に属する微生物がバチルスNo.7-Mであること
を特徴とする、前記記載のN-アセチルキトオリゴ糖の製
造法である。

【００１０】さらに、本発明はキトサンのアセチル化度
が10〜30％であることを特徴とする、前記記載のN-アセ
チルキトオリゴ糖の製造法である。以下、本発明を詳細
に説明する。最初に、バチルスNo.7-Mの菌学的性質及び
この菌株により生産されるキトサナーゼの酵素化学的性
質を示す。バチルスNo.7-Mの菌学的性質 Ａ．細胞の形態 (1) 細胞の形および大きさ：短桿菌、（肉汁および肉汁
寒天斜面培地、37℃、24〜72時間の培養） (2) 細胞の多形成の有無：無し、 (3) 運動性の有無：有り、（肉汁寒天半流動高層穿刺培
養） (4) 胞子の有無：有り、内生胞子および裸の胞子、球
状、〔ドーナー(Dorner)の染色法およびウイッツ(Witz)
変法〕 (5) グラム染色性：陽性、〔肉汁寒天斜面培養、37℃、
18時間、ヒュッカー(Hucker)の変法により染色〕 Ｂ．各培地における生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養（37℃、24〜168 時間）：糸状の
周縁を有する円形で、隆起した乳白色のコロニーを形成
する。コロニーの表面は凹凸でやや光沢があり、半透明
である。時間の経過とともに盛り上がってくる。色素は
生産しない。 (2) 肉汁寒天斜面培養（37℃、24〜168 時間）：拡布状
に盛り上がった乳白色のコロニーを形成する。コロニー
は凸円形の隆起があり、光沢がある。生育は良好で、時
間とともに拡がってくる。色素は生産しない。 (3) 肉汁液体培養（37℃、24〜168 時間）：表面に膜を
形成しない。時間とともに全体的に濁ってくる。底部に
絮状（顆粒状）の沈澱が形成され、徐々に多くなってく
る。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養（25℃、24〜168 時間）：穿
刺線に沿って生育し、液化する。表面および内部は漏斗
状に生育し、液化する。液化部分は白濁する。 (5) リトマスミルク（37℃、24〜168 時間）：2日後か
ら上部が少しずつ液化し、４日目には完全に変色し、酸
性となった。凝固はしない。時間の経過とともに、液化
は進み、半透明になった。 Ｃ．生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元：− （硝酸塩肉汁培地、37℃、24〜120 時間） (2) 脱窒反応：− （駒形らの方法、発酵管を使用、37℃、24〜120 時間） (3) MRテスト：＋ （37℃、24〜168 時間） (4) VPテスト（アセチルメチルカルビノール生成試
験）：＋ （37℃、24〜168 時間） (5) インドールの生成：− （37℃、24〜168 時間） (6) 硫化水素の生成：− （TSI 寒天法、37℃、24〜168 時間） (7) デン粉の加水分解：＋ （37℃、24〜168 時間） (8) クエン酸の利用 （コーザーの培地、37℃、24〜168 時間）：− （クリステンセン培地、37℃、24〜168 時間）：＋ (9) 無機窒素源の利用（37℃、24〜168 時間） 硝酸塩：未定、アンモニウム塩：未定 (10)色素の生成 （マンニット・酵母エキス寒天斜面培地）：− 〔キング(King) A寒天斜面培地〕：− (11)蛍光の有無：無し (12)ウレアーゼ：＋ （クリステンセン─ウレア寒天培地、37℃、24〜168 時
間） (13)オキシターゼ：＋ （肉汁寒天培地、37℃、24〜48時間） (14)カタラーゼ：＋ （肉汁寒天培地、37℃、24〜48時間） (15)生育の範囲：（肉汁寒天培地） 温度：未定、pH：5 〜10、添加食塩濃度：未定、 (16)酸素に対する態度：好気性 （1 ％グルコース肉汁高層寒天培地、37℃、24〜72時
間） (17)O-F テスト〔ヒュー─ライフソン(Hugh-Leifson)
法、37℃、D-グルコース〕：発酵的に酸を生成する。

【００１１】(fermentative) (18)糖類からの酸およびガスの生成の有無 (37℃、24〜168 時間) ： 以上の菌学的性質については、バージエイス・マニュア
ル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー(Ber
gey's Manual Determinative Bacteriorogy)の第8 版(1
974 年) を検索したところ、No.7-M株はバチルス（Baci
llus) 属に属するのが相当であることがわかった。キトサナーゼの酵素化学的性質 (1) 作用 キトサンに作用し、分子の内部鎖から任意にβ-1,4結合
を分解して、主としてキトオリゴ糖(GlcN)_n (n=2〜8)
（2 量体〜8 量体）を生成する。キトオリゴ糖は高速液
体クロマトグラフィーを用いてキトサン分解液から分離
することができる。この分解液におけるキトサンの分解
度は45％である。カルボキシメチルセルロース(CMC) に
も作用し、ある程度はこれらを分解するが、キチンには
全く作用しない。 (2) 作用温度範囲および最適作用温度：可溶性キトサン
を基質とした場合、80℃まで作用し、最適作用温度は50
℃である。

【００１２】pH6.0 において10分間反応させた場合の温
度と比活性の関係を第１図に示す。 (3) 作用pH範囲および最適pH：pH3 〜9 の範囲において
作用し、最適pHはpH6 である。1 ％可溶性キトサン1ml
に各pHの緩衝液2ml および酵素液1ml を加えた反応液を
37℃において10分間反応させた場合のpHと酵素の比活性
の関係を第２図に示す。 (4) 熱安定性：50℃における15分間の保温まで、ほぼ安
定で、60℃における15分間の加熱により、酵素の約40％
が失活し、70℃における15分間の加熱により、完全に失
活した。

【００１３】温度と比活性の関係を第３図に示す。 (5) pH安定性：0.1M緩衝液中で30℃において2 時間放置
した後、残存する酵素活性を測定したが、pH5 〜11の範
囲において安定であった。pH10〜11において安定である
ことは、バチルスNo.7-Mにより生産されたキトサナーゼ
の大きな特徴の一つである。pHと比活性の関係第４図に
示す。 (6) 阻害剤 バチルスNo.7-Mにより生産されたキトサナーゼは1×10
^-3M の終濃度のHgCl₂、PbCl₂ 、AgNO₃ 、および 4×10
^-3M 濃度のPCMBの存在によりほぼ100 ％が阻害された。 (7) 基質特異性：種々の基質を使用し、基質の終濃度を
0.25％とした時に、酵素反応液4ml 当たり酵素蛋白質1m
g によって1 時間に遊離する全還元糖とヘキソサミンの
量（mg/mg 蛋白質/ 時 )を測定した。その結果が表１に
示される。

【００１４】

【表１】

【００１５】バチルスNo.7-Mにより生産されたキトサナ
ーゼは、コロイダルキトサン、可溶性キトサンおよびグ
ライコールキトサンをよく分解し、カルボキシメチルセ
ルロース(CMC) も若干分解したが、粉末キトサンには作
用しなかった。またコロイダルキチン、グライコールキ
チン、粉末キチンおよびメチルセルロースは全く分解し
なかった。 (8) 分子量 SDS-ポリアクリルアミド電気泳動法により分子量を測定
した結果を第５図に示す。第５図において（○）はバチ
ルスNo7.-Mにより生産されたキトサナーゼの分子量であ
って、約41,000である。

【００１６】セファデックスG-100 を用いたゲル濾過法
により分子量を測定した結果を第６図に示す。第６図に
おいて（○）はバチルスNo.7-Mにより生産されたキトサ
ナーゼの分子量であって、約30,000である。 (9) 酵素力価の測定法：1gの粉末キトサン（28メッシ
ュ）を50mlの0.1M酢酸水溶液に溶解し、0.1M酢酸ナトリ
ウム水溶液でpH6.0 に調製した後、0.1M酢酸緩衝液( p
H：6.0)を加えて、全容を100ml にして、基質の1 ％可
溶性キトサン溶液に調製する。

【００１７】37℃において5 分間プレインキュベートし
た基質の1 ％可溶性キトサン溶液1ml に、同様にプレイ
ンキュベートした酵素液1ml を加え、37℃において正確
に10分間酵素反応を行わせる。その後反応液を3 分間煮
沸して酵素反応を停止させ、反応液中に生成した還元糖
を定量する。この条件において１分間に1 μモルのグル
コサミンに相当する還元糖を遊離させる酵素量を、1 単
位(unit)のキトサナーゼ活性とする。

【００１８】次に本発明の構成について詳細に説明す
る。本発明に用いる微生物としては、バチルス属に属す
る微生物であって、キトサナーゼを産生するものであれ
ば、特に限定されないが、好ましい菌株としてはバチル
スNo.7-Mが挙げられる。バチルスNo.7-Mは、長崎県南高
来郡小浜町雲仙の原生沼の土壌よりキチンまたはキトサ
ンを唯一の炭素源とする培地に生育しうる細菌として分
類されたバチルス(Bacillus sp.)No.7株を親株として、
この親株をN-メチル-N'-ニトロソ-N-ニトロソグアニジ
ン(NTG) で処理して突然変異を誘発させ、得られたスト
レプトマイシン耐性の変異株の中から高活性のキトサナ
ーゼを生産しうるものとして分類された変異株である。
本菌株は、微工研菌寄第8139号(FERM P-8139) として通
商産業省微生物工業技術研究所に寄託されている。

【００１９】本発明の微生物を培養する培地には、炭素
源としては、コロイダルキトサン、キトサン等を、窒素
源としては、ペプトン、酵母エキス、肉エキス等を用い
ることができ、他に無機塩類、緩衝液等として、リン酸
塩、硫酸マグネシウム、硫酸第二鉄等を添加することも
できる。このような条件を満たす培地としては例えば、
ペプトン−酵母エキス培地、肉汁培地等が挙げられる。
また培地内のpHは５〜８、温度は20〜60℃であることが
好ましい。培養方法は好気性の微生物に用いられる培養
方法であればいずれも用いることができ、例えば、振盪
培養法、通気攪拌培養法等を用いることができる。培養
期間は、接種する種菌の量により異なるが、上記の培
地、培養条件で１〜７日間培養すればよい。

【００２０】微生物より酵素液を調製するには、特別な
方法を用いる必要はなく、公知の方法でよい、すなわ
ち、充分に微生物が増殖した培地中の培養液を遠心分離
または濾過により固形物を除去し、その上澄液を酵素液
とすればよく、また、得られた酵素液を硫安塩析、ゲル
濾過、イオン交換クロマトグラフィー等により不純物を
除去し、酵素の純度を高めることも可能である。

【００２１】キトサンはキチンをアルカリ処理し、脱ア
セチル化されて得られる多糖類であるが、本発明にはキ
トサンのアミノ基の一部がアセチル化されている部分N-
アセチルキトサンを使用することが好ましく、特にその
アセチル化度が10〜30％である部分N-アセチル化キトサ
ンを使用することが好ましい。この部分N-アセチルキト
サンの調製は、キチンをアルカリ処理し、脱アセチル化
することで行うこともできるが、予めほとんどアセチル
基の存在しないキトサンを調製しておき、これに無水酢
酸等のアセチル化剤を加えアセチル化して行うこともで
きる。

【００２２】キトサナーゼによりキトサンを分解するた
めには、キトサンを酸によって溶解させる必要がある。
この際使用する酸としてはキトサンを溶解し得るもので
あれば、どのようなものでもよく、例えば塩酸または硝
酸の希薄溶液、ギ酸、酢酸、乳酸、グルタミン酸または
アスコルビン酸の希薄溶液を使用するができる。この分
解反応を効率的に進行させるためには、温度20〜50℃と
し、pHはギ酸緩衝液、酢酸緩衝液、乳酸緩衝液等により
3 〜9 付近に維持することが好ましい。反応に用いるキ
トサナーゼの量は反応時間、反応温度等の反応条件を考
慮して決めればよいが、キトサン１ｇに対し、10〜30un
it程度添加するのが好ましい。また、反応時間について
は、その時間の長短により生成するキトオリゴ糖の重合
度分布が変化するため、予備実験において反応時間と生
成するオリゴ糖の重合度分布との関係を調べておき、そ
の結果に応じて反応時間を決めるのが望ましい。

【００２３】反応液よりキトオリゴ糖を精製し、それを
重合度ごとに分離するためには、キトサナーゼを失活さ
せた後、反応液から遠心分離または濾過によって上澄液
を集め、これをゲル濾過、高速液体クロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィー等の処理を行う。得
られたキトオリゴ糖をN-アセチル化するには無水酢酸、
塩化アセチル、等によりアセチル化すればよく、その
後、電気透析等により更に不純物を除去し、凍結乾燥等
を行なうことによりN-アセチルキトオリゴ糖の粉末を得
ることができる。

【００２４】以下、参考例及び実施例により本発明を具
体的に説明するが、本発明はこれによって何ら制限を受
けるものではない。

【００２５】

【参考例１】（種培養の調製）250ml 容三角フラスコ
に、酵母エキス0.8 ％、ペプトン0.4 ％、肉エキス0.2
％、コロイダルキトサン0.5 ％を含む液体培地(pH:7.2)
50mlを入れ、常法により殺菌した後、これに予め液体培
養したバチルス(Bacillus sp.) No.7-M(FERM P-8139)を
接種し、30℃において、1 日間振とう培養した。

【００２６】（酵素生産用培養液の調製）5L容三角フラ
スコ2 本に、上記と同一の組成の液体培地をそれぞれ1L
ずつ入れ、常法により殺菌した後、これに上記で得られ
た種培養液40mlを接種し、30℃において、4 日間振とう
培養した。培養液を6000rpm において遠心分離して、固
体を除去し、得られた上澄液のキトサナーゼの活性を前
記の酵素力価の測定法によって測定した。上澄液1ml当
たり0.99単位であった。

【００２７】（酵素液の精製）上記で得られた上澄液を
混合し、得られた混合液1.81L に固体硫安1.015g( 硫安
80％飽和に相当する) を加え、濾過し、得られた沈澱物
を蒸留水に溶解し、177ml とした。この酵素液を蒸留
水、引き続いて、0.02M リン酸緩衝液(pH:6.0)に対して
透析した後、得られた酵素液を、予め0.02 Mリン酸緩衝
液で平衡化したCM- セファデックスC-50を充填したカラ
ム〔2.6cm(径)×45cm（長さ）〕に流してキトサナーゼ
を吸着させた。ほとんどの不純蛋白質は素通り区分に集
まっていた。このカラムを0.02M リン酸緩衝液350ml で
洗浄した後、0 〜0.5Mの塩化ナトリウムで直線的濃度勾
配により酵素蛋白質を溶出した。

【００２８】次にキトサナーゼ活性を示した第218 〜24
0 のフラクションを合し、これをダイアフローメンブレ
ンフィルターPM−10（アミコン社製品）を用いた限外濾
過装置で17倍に濃縮し、この濃縮液に、セファデックス
G-100 を用いるゲル濾過を行った。このゲル濾過のキト
サナーゼ活性を示した第50〜63のフラクションを合し、
再びCM−セファデックスC−50によるカラムクロマトグ
ラフィーを行った。前回と同じ条件で酵素を吸着し、0
〜0.5Mの塩化ナトリウムで直線的濃度勾配により酵素蛋
白質を溶出した。

【００２９】このカラムクロマトグラフィーにおいて2
〜42unit/ml のキトサナーゼ活性を示すフラクションが
得られた。

【００３０】

【参考例２】（均一反応系におけるキトサンの調製）キ
チン30g を42％NaOH300gに懸濁させ、１週間室温で放置
した。この懸濁液に砕氷2.90kgを加え、キチンを溶解
し、アルカリキチン溶液とした。このときの、NaOH濃度
は5 ％であった。この溶液を50℃で168 時間加熱する
と、反応なかばより沈澱が生成した。この沈澱を濾別
後、メタノール、アセトンで洗浄した後、乾燥し、キト
サン23.1g を得た。コロイド滴定法により求めたキトサ
ンのアセチル化度は24％であった。 （100 ％脱アセチル化キトサンからの部分N-アセチルキ
トサンの調製）100 ％脱アセチル化キトサン5gを100ml
の2 ％酢酸に溶解後、メタノール190ml を加え、攪拌し
た。この溶液に、キトサンのアミノ基当たり0.1 〜0.3
モル当量の無水酢酸を加え、室温で一晩攪拌した。生成
物を1N NaOH-MeOH(1:1)2L に滴下し、室温で一晩攪拌
し、ゲルを形成させた。このゲルを脱塩水で充分に洗浄
後、凍結乾燥し、部分N-アセチルキトサンを得た。元素
分析法により求めた部分N-アセチルキトサンと無水酢酸
添加量の関係を表２に示した。

【００３１】

【表２】

【００３２】

【参考例３】（キトオリゴ糖の調製）参考例２で均一反
応系により調製したキトサン（アセチル化度24％）を用
いて、0.5 ％キトサン溶液（pH6.0,0.1Mギ酸緩衝液）を
調製した。キトサン溶液100ml を37℃でプレインキュベ
ート後、 8.3単位のキトサナーゼを加え、37℃で24時間
インキュベートした。反応を4 分間煮沸することにより
停止させた後、冷却し、ロータリーエバポレーターを用
いて、1/20に濃縮した。濃縮した分解液4ml （キトサン
換算400mg ）を予めギ酸緩衝液(pH4.2,I＝0.2)で平衡化
したバイオゲルP-2 カラム(2.56 ×180cm)にアプライ
し、同緩衝液で溶出した。得られたクロマトグラムを図
７に示した。棒線で示したF-2 からF-8 画分を分取し、
エバポレーターで濃縮後、マイクロアシライザーG1（旭
化成製）で脱塩後、凍結乾燥後した。F-2,F-3,F-4 画分
は高速液体クロマトグラフィーで純度を確認したところ
ほぼ純品であったが、F-5 及びF-6 画分は、わずかに不
純物が混入していたので、再び先に述べたバイオゲルP-
2 カラムを用いて精製した。それぞれの画分の収量は、
F-2 45mg、F-3 101mg 、F-4 67mg、F-5 33mg、F-6 47m
g、F-7 44mg、F-8 198mg であった。

【００３３】次に、これらのオリゴ糖の構造をFAB-マス
スペクトル、エキソ−β−グルコサミダーゼを用いた酵
素分解法及び¹H-NMRにより同定した。それぞれの画分と
糖構造を表３に示した。

【００３４】

【表３】

【００３５】

【参考例４】種々のアセチル化度のキトサンに対するキ
トサナーゼの作用を調べた。参考例２で調製した部分N-
アセチルキトサン（アセチル化度、10％ ,16％, 21％,
24％ ,30％）を用い、0.5 ％キトサン溶液（pH6.0, 0.1
M 酢酸緩衝液）を調製した。0.5 ％キトサン溶液30mlに
キトサナーゼ90μl （2.5 単位）を加え、37℃で24時間
インキュベートした。分解物の組成を参考例３で用いた
高速液体クロマトグラフィーを用いて調べた。図８に示
すように、２糖、３糖、及び４糖はキトサンのアセチル
化度が上昇するにしたがって、減少した。一方、５糖は
アセチル化度10〜30％の範囲で高い値を維持し、10〜21
％で最高である。また６糖はアセチル化度10〜20％の範
囲で高い値を維持し、10〜16％で最高となった。そこ
で、必要とするN-アセチルキトオリゴ糖の重合度を変化
させるには、基質であるキトサンのアセチル化度を変化
させれば良いことがわかった。すなわちN-アセチルキト
オリゴ糖の２、３、４糖を必要とする場合には、アセチ
ル化度の低いキトサンを用いて分解した後アセチル化す
ることにより、製造することができ、N-アセチルキトオ
リゴ糖の５糖あるいは６糖を必要とする場合には、アセ
チル化度10〜30％程のキトサンを用いた後にアセチル化
して得ることができる。

【００３６】

【実施例】参考例２で調製した部分N-アセチルキトサン
（アセチル化度10％）を用いて、0.5 ％キトサン溶液(
pH6.0, 0.1M 酢酸緩衝液）を調製した。キトサン溶液10
0ml にキトサナーゼ167 μl(8.3 単位) を加え、37℃で
24時間インキュベートした。反応後4 分間煮沸して反応
を停止させた。得られた分解液をロータリーエバポレー
ターを用いて、1/20に濃縮した。この濃縮液全量をあら
かじめギ酸緩衝液(pH4.2 ,I＝0.2)で平衡化したバイオ
ゲルP-4 カラム(2.65 ×175cm)およびバイオゲルP-2 カ
ラム(2.65 ×165cm)にアプライし、同緩衝液で溶出し
た。得られたクロマトグラムを図９に示した。棒線で示
したA,B,C,D,E,F 画分を分取し、ロータリーエバポレー
ターで濃縮後、マイクロアシライザーG1を用いて、脱塩
し、凍結乾燥した。得られた画分を、糖濃度0.5 ％とな
るように0.04M Na₂CO₃水溶液に溶解し、メタノール及び
無水酢酸をそれぞれ最終濃度44％及び1.1 ％になるよう
に加えた。室温で一晩攪拌後、ロータリーエバポレター
を用いて濃縮乾固し、さらに糖濃度0.5 ％となるように
0.1N NaOH を加え、室温で30分間放置した。反応後、1N
HClを用いて、pH6.0 に調製した後、再びマイクロアシ
ライザーG1を用いて脱塩し、凍結乾燥した。N-アセチル
化して得られた画分の同定を高速液体クロマトグラフィ
ー、FAB-マススペクトルを用いて行った。図１０に高速
液体クロマトグラフィーの結果を示した。図中のSは標
準(GlcNAc)_n (n=1〜6)を示し、数字１〜６はそれぞれ(G
lcNAc)₁ 、(GlcNAc)₂ 、(GlcNAc)₃ 、(GlcNAc)₄ 、(Glc
NAc)₅および(GlcNAc)₆ の各ピークを示す。また図中のA
〜F は前記のゲル濾過による画分A〜F を示す。高速液
体クロマトグラフィーはカラムとして、ラジアルパッ
ク、μボンダパックカラム（8.0 ×100mm 、ウォーター
ズ製) を用い、溶離液は、アセトニトリル−水混合液
（70：30）、検出はUV検出器を用い、210nm の吸光度を
測定した。A,B,C,D,E 画分はそれぞれ、標準(GlcNAc)_n
の(GlcNAc)₂ 、(GlcNAc)₃ 、(GlcNAc)₄ 、(GlcNAc)₅ お
よび(GlcNAc)₆ と同じリテンションタイムに溶出した。
またF 画分は標準の(GlcNAc)₆ よりも遅れて溶出した。
一方、ピーク面積から求めたA,B,C,D,E,F 画分の純度は
A,80％以上、B,C,D,E;95％以上、F;90％以上であった。
さらに、N-アセチル化して得られた画分の同定をFAB-マ
ススペクトルを用いて行い、A,B,C,D,E,F 画分をN-アセ
チル化して得られた糖はそれぞれ、(GlcNAc)₂ 、(GlcNA
c)₃ 、(GlcNAc)₄ 、(GlcNAc)₅ 、(GlcNAc)₆ 、(GlcNAc)
₇ であることが明らかになった。収量はそれぞれ26mg、
117mg 、70mg、41mg、60mg、および45mgであった。

【００３７】

【発明の効果】バチルス属に属する微生物の生産する酵
素は、単糖類を産生することなくキトサンを比較的重合
度の大きいオリゴ糖に分解することができる。またその
際、用いるキトサンのアセチル化度を限定することによ
り、高重合度のオリゴ糖をより高収率で得ることができ
る。このため本発明は、従来その調製が困難とされてき
た重合度5 〜7 程度のN-アセチルキトオリゴ糖の製造を
容易にし、食品、医療等の広い分野に大きく貢献するも
のである。

【図面の簡単な説明】

【図１】キトサナーゼの作用温度範囲における温度と比
活性の関係を示す図。

【図２】キトサナーゼの作用pH範囲におけるpHと比活性
の関係を示す図。

【図３】キトサナーゼの熱安定性における温度と比活性
の関係を示す図。

【図４】キトサナーゼのpH安定性におけるpHと比活性の
関係を示す図。

【図５】キトサナーゼの分子量測定の結果を示す図。

【図６】キトサナーゼの分子量測定の結果を示す図。

【図７】キトサン加水分解物のゲル濾過のクロマトグラ
ムを示す図。

【図８】キトサンのアセチル化度と分解後の糖の組成を
示す図。

【図９】キトサン加水分解物のゲル濾過のクロマトグラ
ムを示す図。

【図１０】N-アセチル化した画分の高速液体クロマトグ
ラフィーの結果を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07） 7804−4Ｂ (72)発明者 永江 信一 茨城県土浦市大字常名字向荒久5508番地 片倉チッカリン株式会社筑波総合研究所Ｒ ＆Ｄセンター内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 キトサンをバチルス属に属する微生物に
   より生産されるキトサナーゼによって分解した後、N-ア
   セチル化することを特徴とする、N-アセチルキトオリゴ
   糖の製造法。
2. 【請求項２】 バチルス属に属する微生物がバチルスN
   o.7-Mであることを特徴とする、請求項１記載のN-アセ
   チルキトオリゴ糖の製造法。
3. 【請求項３】 キトサンのアセチル化度が10〜30％であ
   ることを特徴とする、請求項１または請求項２記載のN-
   アセチルキトオリゴ糖の製造法。