JPH0474358B2

JPH0474358B2 -

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Publication number: JPH0474358B2
Application number: JP62234904A
Authority: JP
Priority date: 1987-09-21
Filing date: 1987-09-21
Publication date: 1992-11-26
Also published as: JPS6479194A

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕本発明は、キトサンオリゴ糖の還元生成物に関
し、詳しくは、キトサンオリゴ糖の本来の特性を
失なうことなく、安定性、特に水溶液における安
定性の向上した還元キトサンオリゴ糖およびその
製造法に関する。本発明の還元キトサンオリゴ糖は、キトサンオ
リゴ糖の有するほとんどすべての特性を失なつて
おらず、界面活性および溶液状態における安定性
が向上しており、それによつてキトサンオリゴ糖
と同様に広く利用することができ、食品、食品添
加物、化粧品成分、医薬品、医用材料および農業
用資材などの用途に広く利用することができる。〔技術の背景および従来技術の説明〕キトサンオリゴ糖は、キチンの脱アセチル化生
成物のキトサンを分解することによつて得られた
オリゴ糖である。キトサンは、エビやカニなどの
甲殻類の殻に含まれるキチンを脱アセチル化して
得られる多糖類である。キトサンは典型的にはＤ
−グリコサミンのβ−１、４重合体であるが、普
通多少のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基を
含んでいる。原料のキトサンオリゴ糖の製造にお
けるキトサンは、キトサナーゼによつて分解され
るものであれば、いかなるものであつてもこれを
使用することができるが、脱アセチル化度50〜
100％のキトサンを使用するのが好ましい。キト
サンを分解する方法には、亜硝酸による酸化分解
法〔エフ・ヤク他：セルロース・ケミストリ・ア
ンド・テクノロジー（F.Yaku et al：Cellulose
Chemistry and Technology）第11巻第421〜430
頁（1977年）〕、塩酸による加水分解法〔エス・テ
イー・ホロウイツツ他：ジヤーナル・オブ・アメ
リカン・ケミカル・ソサイエテイ（S.T.
Horowitz et al：J.A.C.S）第79巻第5046〜5049
頁（1957年）〕、塩素による酸化分解法（平野茂博
ら：日本農芸化学会、昭和59年度大会「講演要旨
集」第330頁）、酵素による分解法（堀内：日本農
芸化学会、昭和59年度大会「講演要旨集」第550
頁他）など種々の方法が提案されているが、本発
明者の一人は、パチルスNo.７−Ｍ（微工研菌寄第
8139号）により生産されたキトサナーゼによりキ
トサンオリゴ糖を生産する方法を提案した。（特
開昭62−30103号公報）一方キトサンを構成する単糖類のＤ−グルコサ
ミンをNi触媒により水素還元して、Ｄ−グルコ
サミニトールを生産する方法〔ピー・カラー・ア
ンド・ジエイ・メイヤー：ヘルベチカ（P.
Karrer and J.Meyer：Helvetica）第20巻第626
頁（1937年）〕、ヨシオ・マツシマ：ブレチン・オ
ブ・ケミカル・ソサイエテイ・オブ・ジヤパン
（Yoshio Matsushima：Bulletin of Chemical
Society of Japan）第24巻第144〜147頁（1950
年）〕が知られ、また中性糖およびアミノ糖を水
素化ホウ素ナトリウムで還元した後、ホウ酸塩や
夾雑物を除去して、糖アルコールを定量的に精製
する方法〔中川：佐賀大学農学彙報第48号第79−
86頁（1980年）〕が知られている。本発明者はキチンの脱アセチル化物のキトサン
について研究を続けているが、キトサンを、バチ
ルスNo.７−Ｍにより生産されたキトサナーゼによ
り分解して得たキトサンオリゴ糖は、溶液状態で
は、経時変化により着色し、また熱や光によつて
も着色し、不安定であることを見出し、さらに研
究を続けて、キトサンオリゴ糖を、ルテニウム触
媒を用いて水素還元すると、その末端還元基が還
元された還元キトサンオリゴ糖が得られること、
還元キトサンオリゴ糖は、キトサンオリゴ糖の特
性のほとんどのものを保持するが、物質的に安定
であることを見出し、これらの知見に基づいて本
発明に到達した。〔発明の目的および発明の要約〕本発明の目的は、キトサンオリゴ糖の新規な還
元生成物を提供することにあり、詳しくは、キト
サンオリゴ糖の特性を失なうことなく、保持する
が、安定性、特に溶液状態における安定性、およ
び界面活性の向上したキトサンオリゴ糖の還元生
成物を提供することにある。本発明は、式（）：〔式中、Ｒは−NH₂、−NH₂HX（Ｘは無機酸ま
たは有機酸の残基）または−NHCOCH₃であり、
ｎは０〜５の整数である〕に示される還元キトサンオリゴ糖である。本発明の還元キトサンオリゴ糖は、遊離のもの
の外に、酢酸塩または乳酸塩などの有機酸の塩、
あるいは塩酸塩または硝酸塩などの無機酸の塩、
さらに還元キトサンオリゴ糖の塩を中和もしくは
脱酸した生成物を含むことができる。本発明は、またキトサンオリゴ糖〔式（）〕
を水素還元することを特徴とする式（）に示さ
れる還元キトサンオリゴ糖の製造法である。特許請求の範囲中、式(2)の説明にＲとしてアセ
チルアミノ基を挙げたがこれは、原料となるキト
サンにＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基が一
部含まれるためその分解物を還元したオリゴ糖に
もアセチルアミノ基を含む残基が一部存在すると
いうことを意味するものである。本発明の還元キトサンオリゴ糖の製造法におい
て、原料物質のキトサンオリゴ糖は、キトサン
を、キトサナーゼにより分解して得られたキトサ
ンオリゴ糖であつて、Ｄ−グルコサミンの単糖類
を含むことなく、主として２〜８の重合度のキト
サンオリゴ糖を使用することができる。原料のキトサンオリゴ糖の製造におけるキトサ
ナーゼは、バチルス属に属する微生物により生産
され、５〜11のPH領域において安定なキトサナー
ゼを使用することができ、またバチルスNo.７−Ｍ
〔微工研菌寄第（FERM−Ｐ）8139号〕により生
産されたキトサナーゼを使用することができる。本発明の還元キトサンオリゴ糖の製造法におい
て、キトサンオリゴ糖の水素還元は、ラネー・ニ
ツケル触媒またはルテニウム触媒の存在の下に行
なうことができる。本発明のキトサンオリゴ糖の還元生成物は、キ
トサンオリゴ糖の末端還元基が還元されて−OH
基になつているが、キトサンオリゴ糖の有する特
性のほとんどのものを保持しており、安定性、特
に溶液状態における安定性が向上しており、さら
に良好な界面活性を保持している。〔発明の具体的な説明〕本発明の還元キトサンオリゴ糖は式（）に示
される物質であつて、キトサンオリゴ糖の還元末
端のＤ−グルコサミンがＤ−グルコサミニトール
に還元された物質であつて、単糖類モノマーの重
合度が２〜８のものを主としていて、Ｄ−グルコ
サミンおよびＤ−グルコサミニトールを含まない
物質である。還元キトサンオリゴ糖は、その末端還元基が還
元されていて、キトサンオリゴ糖に比べると、熱
および光に対する安定性が向上し、特に溶液状態
における安定性がさらに向上している。また還元
キトサンオリゴ糖は、キトサンオリゴ糖の特性の
大部分を残していて、抗菌性を有するが、毒性は
なく、また副作用もなく、さらに充分な保湿性を
有していて、食品、食品添加物、化粧品成分、医
薬品、医用材料および農業用資材などの広範な用
途に安全に利用することができる。本発明の還元キトサンオリゴ糖は、式（）に
示されるキトサンオリゴ糖の溶液をオートクレー
ブに装入し、これに加圧した水素を導入し、その
末端還元基を還元することによつて製造される。
この水素による還元反応に、ラネー・ニツケル触
媒またはルテニウム触媒を使用するのが好まし
い。本発明の式（）に示される還元キトサンオリ
ゴ糖の製造における原料物質の式（）に示され
るキトサンオリゴ糖は、その重合度が主として２
〜８のものであつて、Ｄ−グルコサミンの単糖類
を含まないものであつて、キトサンを分解するこ
とによつて製造される。キトサンの分解は、これ
までに知られている加水分解法、酸化分解法また
は酵素分解法のいずれによつても、行なうことが
できるが、キトサナーゼを使用する酵素分解法に
よるのが好ましく、キトサナーゼは、バチルス属
に属する微生物により生産され、５〜11のPH領域
において安定なキトサナーゼを使用するのが好ま
しく、またバチルスNo.７−Ｍ（微工研菌寄第8139
号）により生産されたキトサナーゼを使用するの
がさらに好ましい。バチルスNo.７−Ｍは、長崎県南高来郡小浜町雲
仙の原生沼の土壌よりキチンまたはキトサンを唯
一の炭素源とする培地に生育しうる細菌として分
離されたバチルス（Bacillus sp.）No.７株を親株
として、この親株をＮ−メチル−N′−ニトロソ
ーＮ−ニトロソグアニジン（NTG）で処理して
突然変異を誘発させ、得られたストレプトマイシ
ン耐性の変異株の中から、高活性のキトサナーゼ
を生産しうるものとして分離された変異株であつ
て、微工研菌寄第8139号（FERM Ｐ−8139）と
して通商産業省微生物工業技術研究所に寄託され
ている。バチルスNo.７−Ｍの菌学的性質は以下に示され
る。Ａ細胞の形態 (1) 細胞の形および大きさ：短桿菌、（肉汁および肉汁寒天斜面培養、37℃、24〜
72時間の培養） (2) 細胞の多形性の有無：無し、 (3) 運動性の有無：有り、（肉汁寒天半流動高層穿刺培養） (4) 胞子の有無：有り、内生胞子および裸の胞
子、球状、〔ドーナー（Dorner）の染色法およびウイ
ツツ（Witz）変法〕 (5) グラム染色性：陽性、〔肉汁寒天斜面培養、37℃、18時間、ヒユツ
カー（Hucker）の変法により染色〕Ｂ各培地における生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養（37℃、24〜168時間）：糸状の周縁を有する円形で、隆起した乳白色
のコロニーを形成する。コロニーの表面は凹凸
でやや光沢があり、半透明である。時間の経過
とともに盛上つてくる。色素は生産しない。 (2) 肉汁寒天斜面培養（37℃、24〜168時間）：拡布状に盛上つた乳白色のコロニーを形成す
る。コロニーは凸円形の隆起があり、光沢があ
る。生育は良好で、時間とともに拡がつてく
る。色素は生産しない。 (3) 肉汁液体培養（37℃、24〜168時間）：表面に膜を形成しない。時間とともに全体的
に濁つてくる。底部に絮状に（顆粒状）の沈デ
ンが形成され、徐々に多くなつてくる。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養（25℃、24〜168時
間）：穿刺線に沿つて生育し、液化する。表面およ
び内部は漏斗状に生育し、液化する。液化部分
は白濁する。 (5) リトマスミルク（37℃、24〜168時間）：２日後から上部が少しずつ液化、４日目には
色は完全に変色し、酸性となつた。凝固はしな
い。時間の経過とともに、液化は進み、半透明
になつた。Ｃ生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元：− （硝酸塩肉汁培地、37℃、24〜120時間） (2) 脱窒反応：− （駒形らの方法、発酵管を使用、37℃、24〜
120時間） (3) MRテスト：＋（37℃、24〜168時間） (4) VPテスト（アセチルメチルカルビノール）
生成試験：＋（37℃、24〜168時間） (5) インドールの生成：− （37℃、24〜168時間） (6) 硫化水素の生成：− （TSI寒天法、37℃、24〜168時間） (7) デン粉の加水分解：＋（37℃、24〜168時間） (8) クエン酸の利用（コーザーの培地、37℃、24〜168時間）：− （クリステンセンの培地、37℃、24〜168時
間）：＋ (9) 無機窒素源の利用（37℃、24〜168時間）硝酸塩：未定、アンモニウム塩：未定、 (10) 色素の生成（マンニツト・酵母エキス寒天斜面培地）：− 〔キング（King〕Ａ寒天斜面培地）：− (11) 蛍光の有無：無し (12) ウレアーゼ：＋（クリステンセン−ウレア寒天培地、37℃、
24〜168時間） (13) オキシダーゼ：＋（肉汁寒天培地、37℃、24〜48時間） (14) カタラーゼ：＋（肉汁寒天培地、37℃、24〜48時間） (15) 生育の範囲：（肉汁寒天培地）温度：未定、 PH：５〜10、添加食塩濃度：未定、 (16) 酸素に対する態度：好気性（１％グリコース肉汁高層寒天培地、37℃、
24〜72時間） (17) Ｏ−Ｆテスト〔ヒユー−ライフソン
（Hugh−Leifson）法、37℃、Ｄ−グルコー
ス〕：発酵的に酸を生成する。（fermentative） (18) 糖類からの酸およびガスの生成の有無（37
℃、24〜168時間）：

【表】以上の菌学的性質について、バージエイス・マ
ニユアル・オブ・デターミネイテイブ・バクテリ
オロジー（Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology）の第８版（1974年）を検索した
ところ、No.７−Ｍ株はバチルス（Bacillus）属に
属するのが相当であることがわかつた。バチルスNo.７−Ｍにより生産されたキトサナー
ゼの酵素化学的性質は以下に示すとおりである。 (1) 作用：キトサンに作用し、分子の内部鎖から任意に
β−１，４結合を分解して、主としてキトサン
オリゴ糖（GlcN）_o（ｎ＝２〜８）（２量体〜８
量体）を生成する。キトサンオリゴ糖は高速液
体クロマトグラフイーを用いてキトサン分解液
から分離することができる。この分解液におけ
るキトサンの分解度は約45％である。カルボキ
シメチルセルロース（CMC）にも作用し、あ
る程度はこれを分解するが、キチンには全く作
用しない。 (2) 作用温度範囲および最適作用温度：可溶性キトサンを基質とした場合、80℃まで
作用し、最適作用温度は50℃である。 PH6.0において10分間反応させた場合の温度
と比活性の関係を第１図に示す。 (3) 作用PH範囲および最適PH： PH３〜９の範囲において作用し、最適PHはPH
６である。１％可溶性キトサン１mlに各PHの緩衝液２ml
および酵素液１mlを加えた反応液を37℃におい
て10分間反応させた場合のPHと酵素の比活性の
関係を第２図に示す。 (4) 熱安定性： 50℃における15分間の保温まで、ほぼ安定
で、60℃における15分間の加熱により、酵素の
約40％が失活し、70℃における15分間の加熱に
より、完全に失活した。温度と比活性の関係を第３図に示す。 (5) PH安定性： 0.1M緩衝液中で30℃において２時間放置し
た後、残存する酵素活性を測定したが、PH５〜
11の範囲において安定であつた。PH10〜11にお
いて安定であることは、バチルスNo.７−Ｍによ
り生産されたキトサナーゼの大きな特徴の一つ
である。PHと比活性の関係を第４図に示す。 (6) 阻害剤：バチルスNo.７−Ｍにより生産されたキトサナ
ーゼは、１×10^-3Ｍの終濃度のHgCl₂，PbCl₂，
AgNO₃，およびPCMBの存在によりほぼ100
％が阻害された。 (7) 基質特異性：種々の基質を使用し、基質の終濃度を0.25％
とした時に、酵素反応液４ml当り酵素蛋白質１
mgによつて１時間後に遊離する全還元糖とヘキ
ソサミンの量（mg／mg蛋白質／時）を測定し
た。その結果が第１表に示される。

〔Ｗ−７ラネー・ニツケル（Raney Ni）触媒の調製〕

100ml容の三角フラスコに、NaOH6.5ｇを蒸留
水25mlに溶解した溶液を入れ、50℃の湯浴中に浸
し、攪拌しながら、Ni−Al合金粉末５ｇを三角
フラスコに加えた。その液を、さらに50分間、50
℃において穏やかに攪拌した後、蒸留水およびエ
タノールを用い、デカンテーシヨンにより、触媒
を洗浄し、Ｗ−７ラネー・ニツケル触媒を調製し
た。〔還元キトサンオリゴ糖の調製〕参考例２で得たキトサンオリゴ糖（塩酸塩）粉
末7.5ｇを蒸留水40mlに溶解し、容量100c.c.のオー
トクレーブに入れ、これに先に調製したＷ−７ラ
ネー・ニツケル触媒1.5ｇを加えた。オートクレ
ーブを密閉した後、80気圧（室温）の水素をオー
トクレーブに導入し、80気圧の水素圧の下に、攪
拌しながら反応液の温度を60℃より110℃までゆ
つくり昇温し、110℃に６時間保持した。反応液をオートクレーブから取り出し、室温に
放冷した後、反応液を濾過して触媒を除去した。
ロンドルーモルガン（Rondle−Morgan）法によ
り反応液の還元率を測定し、93.9％の還元率の結
果を得た。この反応液を、30℃のインキユベーターに入
れ、１週間放置したが、色の変化は見られなかつ
た。高速液体クロマトグラフイー（HPLC）を用い
て還元キトサンオリゴ糖の同定を行つた。還元キ
トサンオリゴ糖はそのままではHPLCで分離する
ことが不可能であるため、還元したサンプルを予
めアセチル化し分離可能としたものをHPLCにか
け同定を行つた。 HPLCの条件カラム：東ソ−NH₂−60 溶離液：アセトニトリル／水＝65：35 流速：1.0ml／分圧力：52Kg／cm² 検出器：UV210nm 結果は図８のクロマトグラムに示すとおりであ
つた。実施例２（ルテニウム黒触媒の調製）塩化ルテニウム（RuCl₃・3H₂Ｏ）の１％水溶
液を90〜95℃に加熱し、攪拌しながら、これに５
％LiOH水溶液を、上澄液のPHが7.5になるまで滴
下した。その混合液を濾過した後、残つた沈澱を
熱蒸留水により、アルカリの流出が認められなく
なるまで洗浄し、その後乾燥した。その１ｇを取
り、蒸留水100mlに懸濁し、室温において常圧の
水素により還元した。この還元によつて生じたル
テニウム黒の沈澱を蒸留水で洗浄した後、乾燥し
てルテニウム黒触媒を調製した。（還元キトサンオリゴ糖の調製） 30ml容の試験管に、参考例２で調製したキトサ
ンオリゴ糖（塩酸塩）粉末1.5ｇを取り、蒸留水
７mlを加えて溶解した。この試験管をオートクレ
ーブに収容し、試験管に、先に調製したルテニウ
ム黒触媒50mgを加え、オートクレーブを密閉した
後、60気圧（常温）の水素をオートクレーブに導
入し、60気圧の水素圧の下に試験管内の反応液を
攪拌しながら、室温より100℃までゆつくり昇温
し、100℃に５時間保持した。試験管をオートクレーブより取り出し、室温に
放冷した後、反応液を濾過して触媒を除去した。
ロンドル−モルガン（Rondle−Morgan）法によ
り反応液の還元率を測定し、100％の還元率の結
果を得た。この反応液を30℃のインキユベーターに入れ、
１週間放置したが、色の変化は見られなかつた。実施例３（ルテニウム黒触媒による還元キトサンオリゴ
糖の調製） 30ml容の試験管に、参考例２で調製したキトサ
ンオリゴ糖（塩酸塩）粉末1.5ｇを取り、蒸留水
７mlを加えて溶解した。この試験管をオートクレ
ーブに収容し、試験管に、実施例２で調製したル
テニウム黒触媒100mgを加え、オートクレーブを
密閉した後、60気圧（常温）の水素をオートクレ
ーブに導入し、60気圧の水素圧の下に、試験管内
の反応液を攪拌しながら、室温より100℃までゆ
つくり昇温し、100℃に３時間保持し、さらに温
度を123℃まで上昇させ、123℃に２時間保持し
た。試験管をオートクレーブより取り出し、室温に
放冷した後、反応液を濾過して触媒を除去した。
ロンドル−モルガン（Rondle−Morgan）法によ
り反応液の還元率を測定し、100％の還元率の結
果を得た。この反応液を30℃のインキユベーターに入れ、
１週間放置したが、色の変化は見られなかつた。〔発明の効果〕キトサンオリゴ糖を水素還元して、還元キトサ
ンオリゴ糖にすることによつてキトサンオリゴ糖
本来の性質を失なうことなく、熱および光に対し
て安定にすることができ、さらに経時変化による
着色を防止することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はバチルスNo.７−Ｍにより生産されたキ
トサナーゼの温度と比活性の関係を示す図表であ
り、第２図はバチルスNo.７−Ｍにより生産された
キトサナーゼのPHと比活性の関係を示す図表であ
り、第３図はバチルスNo.７−Ｍにより生産された
キトサナーゼの熱安定性における温度と比活性の
関係を示す図表であり、第４図はバチルスNo.７−
Ｍにより生産されたキトサナーゼのPH安定性にお
けるPHと比活性の関係を示す図表であり、第５図
のバチルスNo.７−Ｍにより生産されたキトサナー
ゼのSDS−ポリアクリルアミド電気泳動法による
分子量測定の結果を示す図表であり、第６図はバ
チルスNo.７−Ｍにより生産されたキトサナーゼの
セフアデツクスＧ−50を用いたゲル濾過法による
分子量測定の結果を示す図表であり、そして第７
図は参考例２において調製されたキトサンオリゴ
糖の重合度分布を示す図表であり、第８図は実施
例１で得られた還元キトサンオリゴ糖の高速液体
クロマトグラムを示す図表である。

Claims

【特許請求の範囲】１式（）：〔式中、Ｒは−NH₂、−NH₂HX（Ｘは無機酸ま
たは有機酸の残基）または−NHCOCH₃であり、
ｎは０〜５の整数である〕に示される還元キトサンオリゴ糖。２式（）：〔式中、Ｒは−NH₂、−NH₂HX（Ｘは無機酸ま
たは有機酸の残基）または−NHCOCH₃であり、
ｎは０〜５の整数である〕に示される還元キトサンオリゴ糖を水素還元する
ことを特徴とする式（）：〔式中、Ｒは−NH₂、−NH₂HX（Ｘは無機酸ま
たは有機酸の残基）または−NHCOCH₃であり、
ｎは０〜５の整数である〕に示される還元キトサンオリゴ糖の製造法。３水素還元が、ラネー・ニツケル触媒またはル
テニウム触媒の存在の下に行なわれることを特徴
とする特許請求の範囲第２項に記載の還元キトサ
ンオリゴ糖の製造法。４キトサンオリゴ糖が、キトサンを、バチルス
属に属する微生物により生産される酵素であつ
て、５〜11のPH領域において安定なキトサナーゼ
によつて、分解して得られるものであつて、Ｄ−
グリコサミンの単糖類を含むことなく、主として
２〜８の重合度を有するキトサンオリゴ糖である
ことを特徴とする特許請求の範囲第２項または第
３項に記載の還元キトサンオリゴ糖の製造法。５キトサナーゼが、バチルスNo.７−Ｍ（微工研
菌寄第8139号）により生産されたキトサナーゼで
あることを特徴とする特許請求の範囲第４項に記
載の還元キトサンオリゴ糖の製造法。