JPH0421477B2

JPH0421477B2 -

Info

Publication number: JPH0421477B2
Application number: JP61244254A
Authority: JP
Inventors: Masato Izume; Akira Taiho
Original assignee: Katakura Chikkarin Co Ltd
Current assignee: Katakura Chikkarin Co Ltd
Priority date: 1986-10-16
Filing date: 1986-10-16
Publication date: 1992-04-10
Also published as: JPS6398395A

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕本発明は、Ｄ−グルコサミンをほとんど含むこ
となく、Ｄ−グルコサミンおよびＮ−アセチル−
Ｄ−グルコサミンからなり、比較的高い重合度を
有するキトサンオリゴ糖の製造法に関する。本発明により得られたキトサンオリゴ糖は、食
品添加物、化粧品成分、医薬品または医療材料な
どの広範な用途に利用することができる。〔技術の背景および従来技術の説明〕キチンは、エビやカニなどの甲殻類や殻から得
られる多糖類であつて、セルロースと極めてよく
似た化学構造を有していて、セルロースを構成す
るグルコースの２位の水酸基がアセトアミド基で
置換された２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ
−グルコース（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミ
ン）がβ−１，４結合した直鎖状の多糖類であ
る。一方において、キトサンの分解産物のキトサン
オリゴ糖、たとえば、キトビオース（GlcN）₂、
キトトリオース（GlcN）₃、キトテトラオース
（GlcN）₄、キトペンタオース（GlcN）₅、および
キトヘキサオース（GlcN）₆などがアミノ糖（塩
基性の糖）であることから、これらのキトサンオ
リゴ糖を食品添加物（増量剤）、化粧品成分また
は医薬品などの広範な用途に利用することが考え
られ、これらのキトサンオリゴ糖を経済的に製造
する技術の開発が要望されている。最近、キトサンオリゴ糖のうちのキトヘキサオ
ース（GlcN）₆およびキトヘプタオース（GlcN）₇
に抗力カビ性が見出され〔デイー・エフ・ケンド
ラおよびリー・エー・ハドウイガー：エクスペリ
メンタル・マイコロジー（D.F.Kendra and Lee
A.Hadwiger：Experimental Mycology）第８
巻、第276−281頁（1984年）〕、さらに、キトサン
オリゴ糖の重合度の高いものに免疫機能進効果
が見出され〔鈴木ら：「第８回糖質シンポジウム
講演要旨集」第57〜58頁（1985年）〕、重合度が比
較的大きいキトサンオリゴ糖の製造技術の開発さ
要望されている。これまでに、塩酸による加水分解法〔エス・テ
イー・ホロウイツツ他：ジヤーナル・オブ・アメ
リカン・ケミカル・ソサイエテイ（S.T.
Horowitzet al：J.A.C.S）第79巻、第5046−
5049頁（1957年）〕、亜硝酸による酸化分解法〔エ
フ・ヤク他：セルロース・ケミストリ・アンド・
テクノロジー（F.Yaku et al：Cellulose
Chemistry and Technology）第11巻、第421−
430頁（1977年）〕、および塩素による酸化分解法
（平野茂博ら：日本農芸化学会、昭和59年度大会、
講演要旨集第330頁）がキトサンの化学的な分
解法として知られている。塩酸による加水分解法
は、キトサンオリゴ糖を生産することができる
が、高濃度の塩酸および長時間の反応を必要と
し、また多量のＤ−グルコサミンの単糖類の生成
により反応液からキトサンオリゴ糖を単離する工
程を必要とし、そのための操作がはん雑になり、
そのコストも高いという難点がある。また亜硝酸
または塩素による酸化分解法は、酸化による脱ア
ミノ化のために、純粋なキトサンオリゴ糖を得る
ことが困難であるという難点がある。これに対して、酸素法によるキトサンの分解で
は、酵素の特異性を利用することができるので、
Ｄ−グルコサミンのような単糖類の生成を少なく
して、目的とするキトサンオリゴ糖を著量に生産
することができる。これまでに報告されているキ
トサンを分解する酵素には、バチルス（Bacillus
sp.）Ｒ−４の生産するキトサナ−ゼ〔トミナガ
およびツジサカ：ビオヒミカ・エ・ビオフイジ
カ・アクタ（Y.Tominaga ＆ Y.Tsulisaka：
Biochimica et Biophysica Aota）第410巻、第
145−155頁（1975年）〕、ペニシリウム・イスラン
デイクム（Penicillium islandicum）の生産する
キトサナーゼ〔デイー・エム・フエントン等：ジ
ヤーナルオブ・ジエネラル・ミクロバイオロジ
ー（D.M.Fenton et al：Journal of General
Microbiology）、第126巻、第151−165頁（1981
年）〕、バチルス（Bacillus.sp.）99−５の生産す
るキトサナーゼ（堀内：日本農芸化学会、昭和59
年度大会、講演要旨集第550頁）、ストレプトマ
イセス（Streptomyces sp.）No.６〔ジエイ・エ
ス・プライス等：ジヤーナル・オブ・バクテリオ
ロジー（J.S.Price et al：Journal of
Bacteriology）第124巻、第1574−1585頁（1975
年）〕およびストレプトマイセス・グリセウス
（Streptomyces griseus）の生産するキトサナー
ゼ〔オオタカラ：キチン、キトサン・アンド・リ
レイテツド・エンザイムス（A.Ohtakara：
Chitin、Chitosan and Related Enzymes）第
147〜160頁（1985年）、アカデミツクプレス〕
が知られている。一方、キチナーゼは、キチンを分解する酵素と
いわれ、細菌、カビおよび植物等に広く分布して
存在している。これまでに、アスペルギルス・ニガー
（Aspergillus niger）K14から得られるキチナー
ゼはキチンを分解するが、粉末キトサンおよびグ
リコールキトサンは分解しないと報告され〔エ
ー・オオタカラ：アグリカルチユラル・アンド・
バイオロジカル・ケミストリ（A.Ohtakara：
Agricultural and Biological Chemistry）第28
巻第811〜818頁（1964年）〕、またストレプトマ
イセスグリセウス（streptomyces griseus）か
ら得られるキチナーゼはキトサンおよびキトサン
オリゴ糖（２量体、３量体および４量体）を分解
しないと報告されていて〔エル・アール・バージ
ヤー他：ビオヒミカ・エ・ビオフイジカ・アクタ
（L.R.Berger et al：Biochimica et Biophysica
Acta）第29巻第522〜534頁（1958年）〕、キト
サンはキチナーゼの良い基質とは考えられていな
いが、キトサンをキチナーゼの基質として用いた
例〔エム・ブイ・トレシー：バイオケミカル・ジ
ヤーナル（M.V.Tracey：Biochemical Journal）
第61巻第579〜585頁（1956年）〕があるが、キ
トサンの粘度がバシドミセテス
（Basidomycetes）由来のキチナーゼにより低下
したことが述べられているにすぎない。すなわち
キトサンをキチナーゼにより分解し、重合度の高
いキトサンオリゴ糖を生産するという報告は見当
らない。またキチンは、水、希酸、希アルカリ等には全
く溶解しないで、キチンにキチナーゼを作用させ
ても、反応速度が遅く、さらに重合度の高いオリ
ゴ糖が得られない。本発明者らは、キトサンオリゴ糖を経済的に生
産する技術の開発を企図して、市販の細菌または
カビに由来するキチナーゼをキトサンに作用させ
ると、高重合度のオリゴ糖を含むが、Ｄ−グルコ
サミンの単糖類をほとんど含まないキトサンオリ
ゴ糖が得られることを見出し、この知見に基づい
て本発明に到達した。〔発明の目的および発明の要約〕本発明の目的は、キトサンオリゴ糖の製造法を
提供することにあり、詳しくは、Ｄ−グルコサミ
ンの単糖類をほとんど含まないキトサンオリゴ糖
の製造法を提供することにある。本発明は、キトサンをキトサンオリゴ糖に分解
し得るキチナーゼにより分解して、Ｄ−グルコサ
ミンの単糖類をほとんど含まないオリゴ糖を得る
ことを特徴とするキトサンオリゴ糖の製造法であ
る。本発明のキトサンオリゴ糖の製造におけるキト
サンは、脱アセチル化度が50〜99％のキトサンを
使用することができ、またコロイダルキトサンを
使用することができる。キトサンをキトサナーゼにより分解して、キト
サンオリゴ糖をつくる場合、酵素作用の時間を延
長すると、Ｄ−グルコサミンの単糖類の含量が増
大するから、Ｄ−グルコサミンの単糖類の含量の
少ないキトサンオリゴ糖を得るには、その酵素作
用の時間を厳密に調整することを必要とするが、
本発明のキチナーゼによるキトサンの分解による
と、酵素作用の時間を延長しても、Ｄ−グルコサ
ミンの単糖類を生成しないから、本発明では反応
における酵素作用の時間を厳密に調整しなくて
も、Ｄ−グルコサミンの単糖類を含まないキトサ
ンオリゴ糖を得ることができ、それによつて本発
明のキトサンオリゴ糖の製造における工程管理は
容易であるという利点、効果がある。〔発明の具体的な説明〕本発明により製造されるキトサンオリゴ糖は、
重合度が２〜８のＤ−グルコサミンを含み、Ｄ−
グルコサミンの単糖類をほとんど含まないキトサ
ンオリゴ糖である。このキトサンオリゴ糖は、陽イオンとして作用
し、また吸湿性を有するから、化粧品に使用した
ときに皮膚の保湿剤として有用である。またキト
サンオリゴ糖のうちの比較的高重合度のものは、
安全性が高く、かつ抗カビ性および抗菌性を有す
るから、化粧品、食品等の防腐剤、また土壌改良
剤または種子コーテイング剤などにおける抗カビ
剤および抗菌剤として使用するのに適している。本発明のキトサンオリゴ糖の製造においては、
先ずキトサン溶液を調製する。キトサンは酸に溶
けるので、キトサンに酸水溶液を加えて、キトサ
ン溶液とする。これとは別に、キチナーゼ溶液を
調製し、前に得られたキトサン溶液とともに、反
応温度においてプレインキユベートした後、キチ
ナーゼ溶液を、キトサン溶液に加え、反応温度に
おいてキトサンをキチナーゼによつて分解する。
反応温度は、キチナーゼによつて最適温度が異な
るので、それぞれのキチナーゼの最適温度にて反
応するのが好ましい。また、反応液のPHは、それ
ぞれのキチナーゼの最適PHで反応させることがで
きる。本発明のキトサンオリゴ糖の製造に使用す
るキトサンは、キチナーゼによつて分解されるも
のであれば、いかなるものであつてもこれを使用
することができるが、脱アセチル化度50〜100％
のキトサンを使用するのが好ましい。これらのキ
トサンにキチナーゼを加えて分解する場合、前記
のキトサン溶液の他に、コロイダルキトサンを水
に懸濁した状態におくこともできる。キトサン溶液の調製に使用する酸は、キトサン
を溶解しうるものであれば、有機酸または無機酸
のいかなるものであつてもこれを使用することが
できるが、塩酸または硝酸の希薄溶液、ギ酸、酢
酸、乳酸、グルタミン酸またはアスコルビン酸の
希薄溶液を使用するのが好ましい。キトサンオリゴ糖の重合度分布は、反応温度、
反応時間、反応PH等によつて変化するから、予備
実験において、反応温度、反応時間、反応PHと生
成物のキトサンオリゴ糖の重合度分布の関係を実
験的に求めておき、これに基づいて所望の重合度
分布のキトサンオリゴ糖を得るのに必要な反応時
間とすることもできる。所定の反応時間の経過後に、反応液中のキチナ
ーゼを失活して、反応を停止し、反応液の遠心分
離または濾過によつて上澄液を集め、これを常法
のイオン交換樹脂によるクロマトグラフイー、ゲ
ル濾過または活性炭による着色物質の除去などを
行なつて、不純物を除去した後、乾燥して、所望
のキトサンオリゴ糖の粉末を得る。６種のキチナーゼを使用して、コロイダルキチ
ンおよび脱アセチル化度が、100、91、90、79、
75、66および59％のキトサンを分解して還元糖の
生成量を調べた試験例を記述する。試験例１ストレプトマイセス・アンチビオチクス
（Streptomyces antibiotics）由来のキチナーゼ
を使用した試験例である。 (1) キチナーゼ溶液の調製キチナーゼ〔カルビオヘム
（CALBIOCHEM）社製品〕を脱イオン水に溶
解し、0.2mg／mlのキチナーゼ溶液を調製した。 (2) 試料の調製 (2‐1) コロイダルキチン懸濁液の調製水１にキチン40ｇを加え、氷冷しなが
ら、これに濃硝酸1280mlを加えて溶解した
後、ガラスフイルターで濾過し、瀘液を10
の水中に撹拌しながら加えた。生成した沈澱
を濾取し、充分に水洗して、コロイダルキチ
ンを得て、これに水を加え、撹拌して、0.5
％コロイダルキチン溶液を調製した。 (2‐2) キトサン溶液の調製脱アセチル化度が100、91、90、79、75、
66および59％のキトサン１ｇをそれぞれのビ
ーカーに取り、それぞれ1M酢酸25mlを添加
し、撹拌した後、これに2M酢酸ナトリウム
溶液25mlを加え、さらに撹拌した後、水を加
えて、全量を200mlにして、それぞれの0.5％
キトサン溶液を調製した。 (3) 試験方法 (3‐1) PH5.0における酵素反応試料１mlを試験管に取り、これに0.1M酢
酸バツフアー（PH：5.0）２mlを加え、37℃
においてプレインキユベートした後、あらか
じめ37℃においてプレインキユベートしたキ
チナーゼ溶液１mlを加え、37℃において６時
間反応させ、その後、試験管を加熱し、３分
間沸とうして、反応を停止させた。反応液中の生成還元糖量をシヤーレス
（Shales）変法により測定した。生成還元糖量の測定における標準は、コロ
イダルキチンの試料では、Ｎ−アセチル−Ｄ
−グルコサミンを、またキトサンの試料で
は、Ｄ−グルコサミンをそれぞれ使用した。 (3‐2) PH5.0における酵素反応（３−１）における0.1M酢酸バツフアー
（PH：5.0）の代りに、0.1Mリン酸ブツフア
ーを使用し、（３−１）の同様にして、反応
を行ない、さらに生成還元糖量を測定した。 (4) 試験の結果第１表に示すとおりであつた。

【表】試験例２ストレプトマイセス属の微生物由来のキチナー
ゼを使用した試験例である。 (1) キチナーゼ溶液の調製キチナーゼ〔アイ・シー・エヌ（ICN）社製
品〕を脱イオン水に溶解し、0.8mg／mlのキチ
ナーゼ溶液を調製した。 (2) 試料の調製 (2‐1) コロイダルキチン懸濁液の調製試験例１と同様にして行なつた。 (2‐2) キトサン溶液の調製試験例１と同様にして行なつた。 (3) 試験方法 (3‐1) PH5.0における酵素反応試験例１のキチナーゼ溶液の代りに、試験
例２のキチナーゼを使用して、試験例１と同
様にして行なつた。 (3‐2) PH5.0における酵素反応試験例１のキチナーゼ溶液の代りに、試験
例２のキチナーゼを使用して、試験例１と同
様にして行なつた。 (3‐3) PH5.0における酵素反応における分解曲線脱アセチル化度が66％のキトサンについ
て、試験例１のキチナーゼ溶液の代りに、試
験例２のキチナーゼ溶液を使用して、試験例
１の（３−１）と同様にして、酵素反応を行
ない、第１図に示す時間の経過後に、試験管
を加熱し、３分間沸とうして、反応を停止さ
せ、シヤーレス（Shales）変法により生成還
元糖量を測定した。 (4) 試験の結果（３−１）および（３−２）の酵素反応の試
験の結果は第２表に示すとおりであつた。（３−３）の酵素反応における分解曲線の試
験の結果は第１図に示すとおりであつた。

【表】試験例３ストレプトマイセス・グリセウス
（Streptomyces griseus）由来のキチナーゼを使
用した試験例である。 (1) キチナーゼ溶液の調製キチナーゼ〔シグマ（SIGMA）社製品〕を
脱イオン水に溶解し、0.2mg／mlのキチナーゼ
溶液を調製した。 (2) 試料の調製 (2‐1) コロイダルキチン懸濁液の調製試験例１と同様にして行なつた。 (2‐2) キトサン溶液の調製試験例１と同様にして行なつた。 (3) 試験方法 (3‐1) PH5.0における酵素反応試験例１のキチナーゼ溶液の代りに試験例
３のキチナーゼ溶液を使用して、試験例１と
同様にして行なつた。 (3‐2) PH6.0における酵素反応試験例１のキチナーゼ溶液の代りに、試験
例３のキチナーゼ溶液を使用し、また試験例
１の0.1Mリン酸バツフアー（PH：6.5）の代
りに、0.1Mリン酸バツフアー（PH：6.0）を
使用して、試験例１と同様にして行なつた。 (4) 試験の結果第３表に示すとおりであつた。

【表】試験例４アエロモナス・ヒドロフイラ（Aeromonas
hydrophila）由来のキチナーゼを使用した試験例
である。 (1) キチナーゼ溶液の調製キチナーゼ〔合同酒精社製品〕を脱イオン水
に溶解し、１mg／mlのキチナーゼ溶液を調製し
た。 (2) 試料の調製 (2‐1) コロイダルキチン懸濁液の調製試験例１と同様にして行なつた。 (2‐2) キトサン溶液の調製試験例１と同様にして行なつた。 (3) 試験方法 (3‐1) PH5.0における酵素反応試験例１のキチナーゼ溶液の代りに試験例
４のキチナーゼを使用して、試験例１と同様
にして行なつた。 (3‐2) PH6.5における酵素反応試験例１のキチナーゼ溶液の代りに試験例
４のキチナーゼ溶液を使用して、試験例１と
同様にして行なつた。 (4) 試験の結果第４表に示すとおりであつた。

【表】試験例５セラチア・マルスセンス（Serratia
marcescens）由来のキチナーゼを使用した試験
例である。 (1) キチナーゼ溶液の調製キチナーゼ〔シグマ（SIGMA）社製品〕を
脱イオン水に溶解し、0.67mg／mlのキチナーゼ
溶液を調製した。 (2) 試料の調製 (2‐1) コロイダルキチン懸濁液の調製試験例１と同様にして行なつた。 (2‐2) キトサン溶液の調製試験例１と同様にして行なつた。 (3) 試験方法 (3‐1) PH5.0における酵素反応試験例１のキチナーゼ溶液の代りに試験例
５のキチナーゼ溶液を使用し、試験例１の同
様にして行なつた。 (3‐2) PH6.5における酵素反応試験例１のキチナーゼ溶液の代りに、試験
例５のキチナーゼ溶液を使用し、試験例１の
同様にして行なつた。 (4) 試験の結果第５表に示すとおりであつた。

【表】試験例６カビ由来のキチナーゼを使用した試験例であ
る。 (1) キチナーゼ溶液の調製キチナーゼ〔コツホーライト（Koch−
Light）社製品〕を脱イオン水に溶解して、
0.57mg／mlのキチナーゼ溶液を調製した。 (2) 試料の調製 (2‐1) コロイダルキチン懸濁液の調製試験例１と
同様にして行なつた。 (2‐2) キトサン溶液の調製試験例１と同様にして行なつた。 (3) 試験方法 (3‐1) PH5.0における酵素反応試験例１のキチナーゼ溶液の代りに、試験
例６のキチナーゼ溶液を使用し、試験例１と
同様にして行なつた。 (3‐2) PH6.5における酵素反応試験例１のキチナーゼ溶液の代りに、試験
例６のキチナーゼ溶液を使用し、試験例１の
同様にして行なつた。 (3‐3) PH6.5における酸素反応における分解曲線脱アセチル化度が66％のキトサンの試料に
ついて、試験例１のキチナーゼ溶液の代り
に、試験例６のキチナーゼ溶液を使用して、
試験例１の（３−２）と同様にして、酵素反
応を行ない、第２図に示す時間の経過後に、
試験管を加熱し、３分間沸とうして、反応を
停止させ、シヤーレス（Shales）変法により
生成還元糖量を測定した。 (4) 試験の結果 (3‐1) および（３−２）の酵素反応の試験の結果
は第６表に示すとおりであつた。（３−３）の酵素反応における分解曲線の試
験の結果は第２図に示すとおりであつた。

〔試験例の結果の考察〕

第２図によると、キトサンをキチナーゼによつ
て分解すると、分解時間を長くしてもＤ−グルコ
サミンの生成量は増加しないから、キトサンオリ
ゴ糖を生成することがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は試験例２の（３−３）の試験の結果を
示す図表であり、第２図は試験例６の（３−３）
の試験の結果を示す図表である。

Claims

【特許請求の範囲】１キトサンをキトサンオリゴ糖に分解し得るキ
チナーゼで分解して、Ｄ−グルコサミンの単糖類
をほとんど含まないオリゴ糖を得ることを特徴と
するキトサンオリゴ糖の製造法。２キトサンが、脱アセチル化度が50〜99％のキ
トサンであることを特徴とする特許請求の範囲第
１項に記載のキトサンオリゴ糖の製造法。３キトサンが、コロイダルキトサンであること
を特徴とする特許請求の範囲第１項または第２項
に記載のキトサンオリゴ糖の製造法。