JP3055965B2 - キチン含有材料の酵素的分解方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、キチン含有材料の酵素
的分解方法に関し、詳しくは、キチン含有材料を酵素反
応により効率よく分解する方法を提供するものである。

【０００２】

【従来の技術】キチンは自然界に豊富に存在する多糖類
であり、カニ、エビ等の甲殻類の殻、昆虫の外骨格、あ
るいはある種のカビの細胞壁等に含まれている。

【０００３】キチンは、Ｎ−アセチルグルコサミンがβ
−１，４グリコシド結合により結ばれた長分子であり、
これを高濃度熱アルカリ溶液中で脱アセチル化するとキ
トサンが得られる。このキトサンは、金属イオンやタン
パクに対する吸着能が高く、凝集剤あるいはバイオリア
クターの担体等に利用されている。

【０００４】また、キチン、キトサンの成形体は生体適
合性がよく、手術用の縫合糸や人工皮膚等にも使用され
ている。

【０００５】さらに、キチン、キトサンの分解物である
ポリマーあるはオリゴマーは抗菌活性、抗腫瘍活性があ
ることが知られている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】このようにキチンを材
料として得られる物質は、産業上利用価値が高いもので
ある。しかし、従来キトサンを分解するために行われて
いる酸加水分解では分解の程度を調節することが困難で
あるために得られる分解物は低分子のものが多い。

【０００７】一方、キチナーゼ等の分解酵素を用いた分
解方法では、反応の条件が穏やかであり、さらに、酵素
によって反応特異性にバラエティーがあるため分解の程
度を調節し易いという利点があるが、従来知られている
酵素では効率よく分解できないという問題点がある。

【０００８】したがって、キチン含有材料やキトサン含
有材料を効率よく分解でき、かつ、分解の程度のコント
ロールが可能な方法が望まれている。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意研究を行った結果、キチン含有材料
を尿素及び／又は界面活性剤を含む溶液に晒すことによ
り、分解酵素に対して消化されやすくなることを見出
し、本発明に至った。

【００１０】すなわち本発明は、キチン含有材料を含む
溶液に分解酵素を存在させ、酵素反応を行うことにより
キチン含有材料を分解する方法において、キチン含有材
料を尿素及び／又は界面活性剤を含む溶液に晒す工程
と、尿素及び／又は界面活性剤存在下あるいは非存在下
でキチン含有材料とβ−１，４グリコシド結合分解酵素
を共存させる工程とを含むことを特徴とするキチン含有
材料の酵素的分解方法、さらに、前記キチン含有材料を
尿素及び／又は界面活性剤を含む溶液に晒す工程中に、
溶液を加熱する操作を伴うことを特徴とするキチン含有
材料の酵素的分解方法である。

【００１１】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１２】＜１＞本発明のキチン含有材料 本発明に使用するキチン含有材料は、主としてカニ、エ
ビ等の甲殻類の外骨格、カビ、酵母、キノコを含む菌類
の細胞壁等から得ることができる。

【００１３】これらを、例えば、希酸で脱灰し、濃アル
カリで除タンパク後、水洗することにより本発明の材料
として使用することができる。

【００１４】＜２＞キチン含有材料の前処理 キチンは分子内あるいは分子間の水素結合あるいは疎水
結合により、強固な結晶構造をとっており、これがキチ
ン分解酵素が働きにくくしている原因であると考えられ
る。したがって水素結合あるいは疎水結合を緩めること
ができれば、キチン分解酵素により消化されやすくなる
と考えられる。

【００１５】水素結合は、尿素、グリセロール、グアニ
ジン等の化合物を使用することにより弱くすることがで
きる。また、疎水結合を弱めるには、界面活性剤を使用
すればよい。

【００１６】したがって、これらの化合物の溶液にキチ
ン含有材料を晒し、キチンの結晶構造を破壊した後にキ
チン分解酵素を働かせることにより、効率よくキチンを
分解することができる。

【００１７】しかし、水素結合や疎水結合は、一般に酵
素タンパクの活性発現に必要な立体構造の維持に寄与し
ていると考えられており、これらの結合を緩める条件で
は酵素が失活するおそれがあるため、前記化合物を酵素
と共存させる場合には厳密な条件が必要となる。

【００１８】前記化合物でキチン含有材料を前処理し、
この化合物を除いた後に酵素反応を行う場合には、キチ
ンの立体構造が不可逆的に変化している必要があり、ま
た、この化合物存在下で酵素反応を行う場合には、キチ
ン分解酵素が失活しない条件である必要がある。

【００１９】このような条件をみたす化合物として、尿
素、あるいはＨＬＢ価（親水疎水比：Ｈｙｄｒｏｐｈｉ
ｌｅ Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ Ｂａｌａｎｃｅ）が１０〜
２０である界面活性剤を挙げることができ、これらは併
用してもよい。界面活性剤としては、ＨＬＢ価が１４付
近のものが特に好ましく、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００（ポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエー
テル、ＨＬＢ価＝１３．５）を挙げることができる。

【００２０】これらの化合物を用いてキチン含有材料を
前処理するには、具体的には、これらの化合物を単独
で、あるいは組み合わせて含む溶液にキチンを加え、１
〜２４時間放置すればよい。この際に、攪拌を行うこと
が好ましいが、静置しておいてもよい。

【００２１】尿素の濃度は、尿素存在下で酵素反応を行
う場合には、０．１〜０．４Ｍが好ましい。濃度が低す
ぎると尿素による変性の効果が少なく、高すぎると酵素
が失活するため、上記範囲が好ましい。

【００２２】また、キチンを変性させ、尿素を除いた後
に酵素反応を行う場合には、尿素は飽和濃度まで使用す
ることができるが、より高濃度の方が好ましい。

【００２３】Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の濃度として
は、０．１〜５(W/V)％が好ましい。キチン含有材料を
尿素及び／又は界面活性剤溶液に晒す際に、加熱するこ
とにより結晶構造を壊す効果を高めることができる。特
に、尿素濃度が０．１Ｍ程度の低濃度の場合にこの効果
は著しい。この加熱処理は、１００℃で数分〜数時間行
えばよく、３０分程度が好ましい。具体的には、尿素及
び／又は界面活性剤溶液にキチン含有材料を加え、煮沸
すればよい。

【００２４】＜３＞キチン分解酵素によりキチン含有材
料を分解する方法 本発明に使用するキチン分解酵素として、キチンを構成
するβ−１，４グリコシド結合を切断するβ−１，４グ
リコシド結合分解酵素を使用する。この酵素としては、
例えばリゾチーム(Mucopeptide N-acetylmuramyhydrola
se, EC 3.2.1.17)、キチナーゼ(EC 3.2.1.14)等の加水
分解酵素を挙げることができる。

【００２５】これらの中では、卵白リゾチームが入手し
やすく安価である。キチナーゼは、種々の由来のものが
知られているが、Serratia marcescens、Streptomyces
griseus由来のもの等が市販されている。

【００２６】本発明により、キチン含有材料を分解する
方法を以下に示す。キチン含有材料を、緩衝液に尿素及
び／又は界面活性剤溶液を溶解した溶液に加える。その
後、あるいはこの溶液を加熱した後、キチン分解酵素を
加え酵素反応を行う。この際に攪拌しながら反応させる
のが望ましい。

【００２７】尿素及び界面活性剤非存在下で酵素反応を
行う場合には、キチン含有材料を尿素及び／又は界面活
性剤溶液に加えた後、あるいはこの溶液を加熱した後、
キチン含有材料を水で数回洗浄し、緩衝液に懸濁させ酵
素を加えて酵素反応を行う。この方法によれば、尿素に
より失活しやすい酵素も使用することができる。

【００２８】緩衝液としては、中性帯域で使用可能な緩
衝液が好ましく、ｐＨを中性付近となるように調製した
リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液等を挙
げることができる。

【００２９】酵素反応を行う温度は、酵素が失活しない
温度範囲内であればよいが、酵素活性の至適温度範囲内
で行うことが好ましい。

【００３０】例えば、リゾチームの場合には、好ましく
は、３０〜６０℃で反応を行う。キチン含有材料を尿素
及び／又は界面活性剤溶液中で加熱する場合に、耐熱性
酵素を使用することにより、キチン含有材料の変性処理
と同時に酵素反応を行なうことも可能であり、短時間で
処理できる。さらに、高温で反応を行うことは、反応速
度の増加により処理時間を一層短縮でき、あるいは雑菌
の汚染を防止できる等の利点がある。

【００３１】酵素反応は、酵素を溶媒に溶解した状態で
行うことができるが、酵素を不溶性担体に固定化したも
のを使用することも可能である。酵素の固定化は、ポリ
アクリルアミドゲル等に包括する方法、イオン交換樹脂
に吸着させる方法等一般に酵素の固定化に使用される方
法により行うことができる。

【００３２】分解反応により生成するキチン含有材料の
分解物の精製は、例えば、活性炭等の吸着剤処理により
残留溶媒を除去し、液体クロマトグラフィー、ゲル濾過
等により行うことができる。

【００３３】

【００３４】尚、本発明の方法は、キチンのみならずキ
トサンの酵素分解にも同様に適用できる。この場合に
は、酵素としてキトサナーゼ(Chitosanase)等を使用す
ればよい。

【００３５】また、強固な立体構造を有するために効率
的な酵素分解が困難であるセルロース、キシラン、その
他のヘミセルロース、難溶性デンプン等の多糖類、ある
いはリグニン等の難分解性高分子化合物にも同様な応用
が考えられる。尿素存在下で使用できる酵素が知られて
いない場合には、本発明のうち、尿素除去後に酵素反応
を行う方法を適用することができる。

【００３６】

【実施例】本発明を、実施例によりさらに詳細に説明す
る。

【００３７】

【実施例１】まず、キチンを尿素等を含む緩衝液中に晒
すことによる、キチン分解酵素によるキチンの分解率の
向上を調べた。

【００３８】２０(W/V)％グリセロール、０．５(W/V)％
ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、１(W/V)％Ｔｗｅ
ｅｎ ２０、１(W/V)％プルロニックＬ４４（旭電化
（株）製）、１(W/V)％アンヒトール２４Ｂ（花王
（株）製）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００あるいは０．２
Ｍ尿素を溶解した１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）に、キチン（和光純薬工業製）を２(W/V)％となる
ように加え、１００℃で１時間煮沸した後、リゾチーム
（和光純薬工業製 Ｎｏ．１２２−０２６７３）を２(W
/V)％となるように加え、４０℃で攪拌しつつ反応を行
った。

【００３９】反応開始から４１時間後に反応生成物の解
析を、Ａｓａｈｉ Ｐａｋ ＮＨ２Ｐ−５０カラム（旭化
成工業（株）製）またはＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐｏｌｙａ
ｍｉｎｅカラム（（株）山村化学研究所製、（株）ワイ
エムシィから購入）を用いた高速液体クロマトグラフィ
ーにより行い、加えたキチンの量に対する、分解により
生成したＮ−アセチルグルコサミンの単量体、２量体及
び３量体の総量の比を変換率として、図１に示した。

【００４０】この結果から、キチンを尿素あるいはＴｒ
ｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む溶液に晒すことにより、リ
ゾチームにより分解されやすくなることがわかる。

【００４１】

【実施例２】キチンの分解に及ぼす尿素の濃度の影響を
調べた。

【００４２】尿素を０．２Ｍ、０．５Ｍ、１．０Ｍ、
１．５Ｍあるいは２．０Ｍ含む１００ｍＭ リン酸緩衝
液（ｐＨ６．０）にキチン（和光純薬工業製）を加え、
実施例１と同様に分解効率を調べ、結果を図２に示し
た。尚、反応は４０時間行った。

【００４３】この結果から、尿素の濃度は、０．１〜
０．４Ｍがよいことがわかった。

【００４４】

【実施例３】キチンを尿素溶液に晒す際の加熱が、キチ
ンの酵素分解に及ぼす効果を調べた。

【００４５】尿素を含む１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）にキチン（Ｓｉｇｍａ社製）を１(W/V)％に
なるように加え、１００℃で３０分間あるいは２時間攪
拌しながら加熱した溶液、及び加熱をしなかった溶液
に、リゾチームを１(W/V)％加え、４０℃で攪拌しなが
ら反応させた。それぞれ尿素濃度は、０．１Ｍ、０．２
Ｍ、０．３Ｍについて行った。

【００４６】酵素を加えてから６７時間後に実施例１と
同様に反応生成物を解析し、変換率を図３に示した。

【００４７】この結果から、加熱をしなくても尿素濃度
が高ければキチンを効率よく分解できるが、加熱するこ
とによりさらに分解効率が高くなることがわかった。特
に、尿素が低濃度である場合に加熱の効果は大きい。

【００４８】

【実施例４】次に、キチンを尿素溶液に晒した後に水で
洗浄し、尿素を除いてから酵素分解を行った実施例につ
いて説明する。

【００４９】尿素溶液にキチン（Ｓｉｇｍａ社製）を１
(W/V)％加え、１００℃で３０分間攪拌しながら加熱し
た後、水洗を数回行い尿素を除去した。このキチンを１
００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に１(W/V)％とな
るように懸濁し、リゾチームを１(W/V)％加えて４０℃
で４２時間反応させた。尚、尿素濃度は０．１Ｍ、０．
２Ｍ、１．０Ｍ、２．０Ｍ、３．０Ｍで行った。

【００５０】変換率を実施例１と同様に測定し、尿素存
在下で酵素分解を行った場合の変換率と比較した（図
４）。

【００５１】その結果、尿素濃度が高い（３Ｍ）場合に
は、尿素を除いて酵素反応を行っても効率よくキチンを
分解することができることがわかった。

【００５２】

【実施例５】キチンを高濃度の尿素で処理した実施例に
ついて説明する。

【００５３】尿素を０〜５Ｍ含む１００ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ６．０）にキチン（Ｓｉｇｍａ社製）を１(W/
V)％になるように加え、室温で２４時間攪拌した後、こ
のキチンを水で洗浄して尿素を除いた。

【００５４】このキチンを１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）に懸濁し、リゾチームを１(W/V)％加え、４
０℃で攪拌しながら反応を行った。

【００５５】９６時間後に、実施例１と同様に反応生成
物を解析し、変換率を図５に示した。

【００５６】この結果から、尿素を除いてから酵素反応
を行う場合は、尿素が高濃度の方がキチンが分解されや
すいことがわかった。

【００５７】

【発明の効果】以上に示したように、キチン含有材料を
尿素及び／又は界面活性剤を含む溶液に晒し、β−１，
４グリコシド分解酵素を作用させることにより、キチン
を効率よく分解することができる。

【００５８】また、キチンを尿素及び／又は界面活性剤
を含む溶液中で加熱することにより、キチンをさらに効
率よく分解することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 キチン分解酵素によるキチンの分解率に及ぼ
す前処理の効果を示すグラフ

【図２】 キチンの分解率と前処理における尿素濃度の
影響を示したグラフ

【図３】 尿素によるキチンの前処理における加熱処理
の効果を示したグラフ

【図４】 酵素反応における尿素の有無が、キチンの分
解率に与える影響を示すグラフ

【図５】 尿素非存在下で酵素反応を行う場合の、前処
理の尿素濃度とキチンの分解率との関係を示したグラフ

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 キチン含有材料を含む溶液に分解酵素を
   存在させ、酵素反応を行うことによりキチン含有材料を
   分解する方法において、キチン含有材料を尿素及び／又
   は界面活性剤を含む溶液に晒す工程と、尿素及び／又は
   界面活性剤存在下あるいは非存在下でキチン含有材料と
   β−１，４グリコシド結合分解酵素を共存させる工程と
   を含むことを特徴とするキチン含有材料の酵素的分解方
   法。
2. 【請求項２】 前記キチン含有材料を尿素及び／又は界
   面活性剤を含む溶液に晒す工程中に、溶液を加熱する操
   作を伴うことを特徴とする請求項１記載のキチン含有材
   料の酵素的分解方法。