CN107446910A - 一种丝素纤维固定化壳聚糖水解酶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明一种丝素纤维固定化壳聚糖水解酶的制备方法以蚕丝纤维为原料，通过碳酸钠溶液处理，脱去蚕丝纤维表面的丝胶，然后经充分洗涤除去残留的碳酸钠，制备出丝素纤维。利用蛋白质交联剂通过共价键结合方法将壳聚糖水解酶固定化在丝素纤维上。通过本发明将壳聚糖水解酶固定化在丝素纤维上，可以有效提高壳聚糖水解酶的稳定性，尤其是本发明固定化壳聚糖水解酶具有在高离子强度和高粘度的壳聚糖胶体中能保持活性的特性，从而在壳聚糖胶体水解过程中具有更好的稳定性和更长的使用寿命。

Description

一种丝素纤维固定化壳聚糖水解酶的制备方法

技术领域

本发明涉及利用丝素纤维固定化壳聚糖水解酶的制备方法，具体属于食品与医药酶工程技术领域。

背景技术

壳聚糖水解是通过一系列物理、化学或者生物方法使高分子量的壳聚糖水解生成低分子量壳聚糖或者壳寡糖的过程。物理或者化学水解方法简单，反应迅速，操作简便，但是低分子量壳聚糖或者壳寡糖得率不高，所用化学药品浓度高，污染严重。生物法水解主要是酶法水解，与物理或者化学水解相比，最大的优点是反应条件温和，不需要使用大量化学药品，对环境的污染小，最重要的是能够得到高质量的低分子量壳聚糖或者壳寡糖。

但是，目前在食品与医药酶工程领域采用的壳聚糖酶法水解主要存在以下缺点：（1)酶制剂的稳定性差，容易失活；（2)酶制剂的纯度不高，通常仅仅是经过简单处理微生物发酵液，含有大量的杂质；（3)酶的催化活性不高，工艺可控性差。因此，有必要研究固定化酶在壳聚糖酶法水解中的应用，不仅节约酶促反应时间、提高产品品质，而且增强酶制剂的稳定性和耐用性。在固定化酶技术中，载体的选择对固定化酶的活性及使用特性有着至关重要的作用，为了得到具有良好催化性能、载量高、成本低的固定化酶，现有技术利用了价格低廉、易得的材料，如：活性炭、硅藻土、明胶以及海藻酸钙等作为固定化载体，其中，海藻酸钙作为固定化载体的研究比较广泛，但使用这些材料作为固定化酶载体时，由于它们与酶或者底物壳聚糖的相容性及亲和性有限，所得固定化酶的酶的固载量或者表观活力较低。

与活性炭、硅藻土、明胶以及海藻酸钙等相比，丝素可以以丝绵、丝织品等形态被方便地利用，有利于反应结束后固定化酶与产物的固液分离，近些年来也被广泛用作固定化酶的载体。日本专利JP01120287A提供了一种使用丝素蛋白作载体以生产的固定化酶，是将丝素蛋白和酶的混合水溶液在特定条件下冷冻和解冻的产品。在这种条件下冷冻，丝素蛋白分子通过凝集而变得不溶，然后解冻，以得到固定化酶。所述冷冻的优选是在-20 ℃缓慢进行。中国专利CN1128764A提供了一种用于固定酶及生物活性物的再生丝素蛋白及其复合材料，其特征于该基材为由废丝经过再生处理制得的再生丝素蛋白及其高分子复合材料，再生丝素蛋白是将丝织厂的废丝用0.1～3％的NaHCO₃在90～105℃温度下处理20～60分钟， 然后用去离子水清洗，再将其溶解于7～10 M LiBr溶液中，在半透膜袋中透析48～96小时，除去不溶物，即得清晰透明的再生丝素蛋白溶液。复合材料中的高分子材料为聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、海藻酸钠、纤维素及其衍生物。用于固定酶及生物活性物的基材，其特征在于其中的复合材料由如下方法制备：将高分子材料完全溶解于水中，除去不溶物，得到浓度为1～5％的清晰透明的高分子材料溶液，再按1∶0.4～1∶6的比例与浓度为1～3％的再生丝素蛋白溶液完全混合，除去溶剂，即得到复合材料。中国专利CN100427593C提供了一种固定化酶的丝素纳米颗粒及其制备方法，将水溶性丝素溶液与酶混合均匀，再将丝素酶混合液注入到快速搅动的水溶性有机溶剂中，有机溶剂的体积占最终体积的70％以上，所述有机溶剂为丙酮，形成乳白色丝素蛋白为核心，表层包埋并固定酶的球形微粒分散在有机溶剂体系中，得到固定化酶的丝素纳米颗粒混合液或悬浮液，去除其中的有机溶剂，得到固定化酶的丝素纳米颗粒；所述的酶，包括氧化还原酶、水解酶和异构酶当中的一种或者二种以上的混合酶。中国专利CN1834240A提供了一种固定化酶的丝素纳米颗粒及其制备方法，将酶与水溶性的再生丝素溶液充分混合后，注入到高速搅动的过量水溶性有机溶剂中，引起丝素变性和结构β化而形成乳白色结晶性丝素微粒，同时酶被包埋和固定在微粒中。经过滤或离心去除有机溶剂后，制成结晶性的固定化酶丝素纳米颗粒。

虽然目前固定化在丝素上的酶的种类很多，但是都是用溶解的丝素与酶混合，然后将负载了酶的丝素再生成为固定化酶。这样的固定化酶是再生丝素蛋白包裹酶，酶难以与高分子量和高粘度的壳聚糖胶体接触并发挥其水解活性，造成表观酶活力低下。

发明内容

因此，针对上述问题，本发明提出一种以丝素纤维为载体的固定化壳聚糖水解酶及其制备方法。所述以丝素纤维为载体的固定化壳聚糖水解酶，以丝素纤维为固定化酶用载体，该载体亲水性好，且有较高的机械强度，空隙多，赋予了纤维对酶有很好的接触机会，能够有效实现酶的固定化，酶以酶聚集体的形式交联在丝素表面，可以在很大程度上提升酶的固载量和活力。本发明以丝素纤维为载体的固定化壳聚糖水解酶的制备方法工艺简单，容易实现工业化生产使用，并且采用本发明固定化壳聚糖水解酶进行壳聚糖水解处理后的产物颜色浅，杂质含量少，水解过程简单易操作，实用性强。

本发明一种丝素纤维固定化壳聚糖水解酶的制备方法包括如下步骤：

步骤1：丝素纤维的制备

将蚕丝纤维浸泡于沸腾的0.5 wt%-1.0 wt%的碳酸钠溶液中60-240 min，充分除去蚕丝纤维表面的丝胶，其后经过滤、纯净水洗涤至洗出液中不含碳酸钠成分时为止，滤饼经烘干得到丝素纤维。

步骤2：壳聚糖水解酶聚集体的制备

壳聚糖水解酶溶于pH值为5.0-8.0、离子强度为0.1-0.5 mol/L的磷酸盐缓冲液，得到浓度为0.5-10 mg/mL的壳聚糖水解酶溶液，然后以孔径为0.22 μm 的除菌过滤器过滤，收集滤过液；其后在滤过液中加入20 wt%-65 wt%的沉淀剂，沉淀0.5-5 h，无需过滤分离，即得壳聚糖水解酶聚集体。

步骤3：丝素纤维固定化壳聚糖水解酶的制备

控制壳聚糖水解酶聚集体与丝素纤维质量比为1:5-1:50，将丝素纤维加入壳聚糖水解酶聚集体中，再加入蛋白质交联剂至终浓度为0.05 wt%-0.5 wt%，维持4-40℃搅拌反应1-18 h，取出丝素纤维并用离子强度为0.1-0.5 mol/L的磷酸盐缓冲液洗去未固定化于丝素纤维的壳聚糖水解酶，经抽滤、冷冻干燥，得到丝素纤维固定化壳聚糖水解酶。

所述的蚕丝纤维是桑蚕生丝、桑蚕熟丝中的一种或两者的混合物或其丝织物。

所述的壳聚糖水解酶是壳聚糖酶、几丁质酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶、半纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、蛋白酶、脂肪酶或淀粉酶。

所述的沉淀剂是无机盐、有机聚合物或有机溶剂。

所述的蛋白质交联剂为谷氨酰胺转氨酶、京尼平、戊二醛、碳二亚氨或异硫氰酸盐。

所述的无机盐是硫酸铵、硫酸钠、氯化铵或氯化钠。

所述的有机聚合物是聚乙二醇或葡聚糖。

所述的有机溶剂是异丙醇、乙醇、丙酮或叔丁醇。

本发明丝素纤维固定化壳聚糖水解酶的活性测定采用DNS法测定还原糖含量，酶活定义为: 50°C，pH5.8条件下，每1min催化水解壳聚糖生成相当于1μmol 氨基葡萄糖的还原糖所需的酶量为1个酶活力单位(U) ，固定化酶催化活力以每克(g)干固定化酶所具有的酶活力单位数（U/g）表示。

本发明的有益效果：

（1）本发明壳聚糖水解酶是以丝素纤维为固定化载体，该载体亲水性好，且有较高的机械强度，空隙多，赋予了纤维对酶聚集体有很好的接触机会，能够有效实现酶聚集体的固定化，提升了酶聚集体的固载量和活力，固定化壳聚糖水解酶具有良好的稳定性和可重复使用性。因此，以丝素纤维为载体的固定化壳聚糖水解酶用于生产低分子量壳聚糖以及壳寡糖，生产条件温和，环保性好，可控性提高，酶制剂带入的杂质减少，可以避免产品质量的波动。

（2）本发明壳聚糖水解酶所用酶包括壳聚糖酶、几丁质酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等具有壳聚糖水解能力的酶。采用丝素纤维为载体，获得的固定化壳聚糖水解酶进行壳聚糖水解处理后，其产物颜色浅，杂质含量少。

（3）本发明壳聚糖水解酶制备方法工艺简单，容易实现，适合工业化生产使用。

（4）本发明固载的酶量及催化活力，相比活性炭、硅藻土、明胶以及海藻酸钙等作为固定化载体有显著的提高。例如，以京尼平作为蛋白质交联剂，壳聚糖酶聚集体在活性炭上的固载量为2%，催化活力为20 U/g；同样以京尼平作为蛋白质交联剂，壳聚糖酶聚集体在丝素纤维上的固载量为9%，催化活力为160 U/g。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整。

实施例1

以谷氨酰胺转胺酶作为蛋白质交联剂的丝素纤维固定化壳聚糖酶交联酶聚集体的制备

（1）丝素纤维的制备：称取18.0 g桑蚕生丝，放入900 mL 1% 碳酸钠溶液，加热至沸腾后，保持小火微沸60 min，取出用流动自来水洗净，完成一次脱胶过程，将一次脱胶丝素放入900 mL 1% 碳酸钠溶液，如前法操作，得二次脱胶丝素，将二次脱胶丝素用流动纯净水淋洗5min，挤干水分，60 ℃烘箱干燥至恒重，得14.7 g桑蚕丝素，即为所需丝素纤维；

（2）壳聚糖酶聚集体的制备：准确称取1g壳聚糖酶溶于100mLpH值为7.0的、离子强度为0.5 mol/L的磷酸盐缓冲液中，配制成壳聚糖酶溶液，然后以孔径为0.22 μm 的除菌过滤器过滤，收集滤过液，其后在滤过液中加入43 g 硫酸铵，沉淀1 h，制备壳聚糖酶聚集体。

（3）丝素纤维固定化壳聚糖酶交联酶聚集体的制备：将10.0 g丝素纤维加入到壳聚糖酶聚集体中，使壳聚糖酶聚集体与丝素纤维质量比为1:10，加入0.3 g谷氨酰胺转胺酶作为蛋白质交联剂，40 ℃搅拌反应1 h，取出丝素纤维并用pH值为7.0的、离子强度为0.5mol/L的磷酸盐缓冲液洗去未固定化于丝素纤维的壳聚糖酶聚集体，抽滤，冷冻干燥，得到10.8 g丝素纤维固定化壳聚糖酶交联酶聚集体。通过固定化前后质量的变化，计算出壳聚糖酶交联酶聚集体在丝素纤维上的固载量为8%，催化活力为120 U/g。

实施例2

以京尼平作为蛋白质交联剂的丝素纤维固定化壳聚糖酶交联酶聚集体的制备

（1）丝素纤维的制备：称取18.0 g桑蚕生丝，放入900 mL 1% 碳酸钠溶液，加热至沸腾后，保持小火微沸60 min，取出用流动自来水洗净，完成一次脱胶过程，将一次脱胶丝素放入900 mL 1% 碳酸钠溶液，如前法操作，得二次脱胶丝素，将二次脱胶丝素用流动纯净水淋洗5min，挤干水分，60 ℃烘箱干燥至恒重，得14.7 g桑蚕丝素，即为所需丝素纤维；

（2）壳聚糖酶聚集体的制备：准确称取1g壳聚糖酶溶于100mLpH值为7.0的、离子强度为0.5 mol/L的磷酸盐缓冲液中，配制成壳聚糖酶溶液，然后以孔径为0.22 μm 的除菌过滤器过滤，收集滤过液，其后在滤过液中加入43 g 硫酸铵，沉淀1 h，制备壳聚糖酶聚集体。

（3）丝素纤维固定化壳聚糖酶交联酶聚集体的制备：将10.0 g丝素纤维加入到壳聚糖酶聚集体中，使壳聚糖酶聚集体与丝素纤维质量比为1:10，加入0.2g京尼平作为蛋白质交联剂，25℃搅拌反应2 h，取出丝素纤维并用pH值为7.0的、离子强度为0.5 mol/L的磷酸盐缓冲液洗去未固定化于丝素纤维的壳聚糖酶聚集体，抽滤，冷冻干燥，得到10.9 g丝素纤维固定化壳聚糖酶交联酶聚集体。通过固定化前后质量的变化，计算出壳聚糖酶交联酶聚集体在丝素纤维上的固载量为9%，催化活力为160 U/g。

实施例3

以京尼平作为蛋白质交联剂的丝素纤维固定化半纤维素酶交联酶聚集体的制备

（1）丝素纤维的制备：称取18.0 g白胚双绉，放入900 mL 1% 碳酸钠溶液，加热至沸腾后，保持小火微沸60 min，取出用流动自来水洗净，再用流动纯净水淋洗5min，挤干水分，60℃烘箱干燥至恒重，得16.9 g桑蚕丝素，即为所需丝素纤维；

（2）半纤维素酶聚集体的制备：准确称取1g半纤维素酶溶于100mLpH值为6.0的、离子强度为0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液中，配制成半纤维素酶溶液，然后以0.22 μm 的除菌过滤器过滤，收集滤过液，其后在滤过液中加入39 g 硫酸铵，沉淀2 h，制备半纤维素酶聚集体。

（3）丝素纤维固定化半纤维素酶交联酶聚集体的制备：将10.0 g丝素纤维加入到半纤维素酶聚集体中，使半纤维素酶聚集体与丝素纤维质量比为1:10，加入0.2 g京尼平作为蛋白质交联剂，25℃搅拌反应2 h，取出丝素纤维并用pH值为6.0的、离子强度为0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液洗去未固定化于丝素纤维的半纤维素酶聚集体，抽滤，冷冻干燥，得到10.7 g丝素纤维固定化半纤维素酶交联酶聚集体。通过固定化前后质量的变化，计算出半纤维素

酶交联酶聚集体在丝素纤维上的固载量为7%，催化活力为80 U/g。

实施例4

以京尼平作为蛋白质交联剂的活性炭固定化壳聚糖酶交联酶聚集体的制备

（1）活性炭的活化处理：称取20.0 g活性炭，放入900 mL 1% 盐酸溶液，加热至沸腾后，保持小火微沸30 min，然后以纯净水洗涤至pH 5以上，120 ℃烘箱干燥至恒重，得18.2 g活化处理好的活性炭。

（2）壳聚糖酶聚集体的制备：准确称取1g壳聚糖酶溶于100 mL pH值为7.0的、离子强度为0.5 mol/L的磷酸盐缓冲液中，配制成壳聚糖酶溶液，然后以孔径为0.22 μm 的除菌过滤器过滤，收集滤过液，其后在滤过液中加入43 g 硫酸铵，沉淀1 h，制备壳聚糖酶聚集体。

（3）活性炭固定化壳聚糖酶交联酶聚集体的制备：将10.0 g活化处理好的活性炭加入到壳聚糖酶聚集体中，使壳聚糖酶聚集体与活性炭质量比为1:10，加入0.2g京尼平作为蛋白质交联剂，25℃搅拌反应2 h，取出活性炭并用pH值为6.0的、离子强度为0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液洗去未固定化于活性炭的壳聚糖酶聚集体，抽滤，冷冻干燥，得到10.2 g活性炭固定化壳聚糖酶交联酶聚集体。通过固定化前后质量的变化，计算出壳聚糖酶交联酶聚集体在活性炭上的固载量为2%，催化活力为20U/g。

Claims (8)

1.一种丝素纤维固定化壳聚糖水解酶的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括如下步骤：

步骤1：丝素纤维的制备

将蚕丝纤维浸泡于沸腾的0.5 wt%-1.0 wt%的碳酸钠溶液中60-240 min，充分除去蚕丝纤维表面的丝胶，其后经过滤、纯净水洗涤至洗出液中不含碳酸钠成分时为止，滤饼经烘干得到丝素纤维；

步骤2：壳聚糖水解酶聚集体的制备

壳聚糖水解酶溶于pH值为5.0-8.0、离子强度为0.1-0.5 mol/L的磷酸盐缓冲液，得到浓度为0.5-10 mg/mL的壳聚糖水解酶溶液，然后以孔径为0.22 μm 的除菌过滤器过滤，收集滤过液；其后在滤过液中加入20 wt%-65 wt%的沉淀剂，沉淀0.5-5 h，无需过滤分离，即得壳聚糖水解酶聚集体；

步骤3：丝素纤维固定化壳聚糖水解酶的制备

控制壳聚糖水解酶聚集体与丝素纤维质量比为1:5-1:50，将丝素纤维加入壳聚糖水解酶聚集体中，再加入蛋白质交联剂至终浓度为0.05 wt%-0.5 wt%，维持4-40℃搅拌反应1-18 h，取出丝素纤维并用离子强度为0.1-0.5 mol/L的磷酸盐缓冲液洗去未固定化于丝素纤维的壳聚糖水解酶，经抽滤、冷冻干燥，得到丝素纤维固定化壳聚糖水解酶。

2.根据权利要求1所述的一种丝素纤维固定化壳聚糖水解酶的制备方法，其特征在于：所述的蚕丝纤维是桑蚕生丝、桑蚕熟丝中的一种或两者的混合物或其丝织物。

3.根据权利要求1所述的一种丝素纤维固定化壳聚糖水解酶的制备方法，其特征在于：所述的壳聚糖水解酶是壳聚糖酶、几丁质酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶、半纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、蛋白酶、脂肪酶或淀粉酶。

4.根据权利要求1所述的一种丝素纤维固定化壳聚糖水解酶的制备方法，其特征在于：所述的沉淀剂是无机盐、有机聚合物或有机溶剂。

5.根据权利要求1所述的一种丝素纤维固定化壳聚糖水解酶的制备方法，其特征在于：所述的蛋白质交联剂为谷氨酰胺转氨酶、京尼平、戊二醛、碳二亚氨或异硫氰酸盐。

6.根据权利要求4所述的沉淀剂，其特征在于：所述的无机盐是硫酸铵、硫酸钠、氯化铵或氯化钠。

7.根据权利要求4所述的沉淀剂，其特征在于：所述的有机聚合物是聚乙二醇或葡聚糖。

8.根据权利要求4所述的沉淀剂，其特征在于：所述的有机溶剂是异丙醇、乙醇、丙酮或叔丁醇。