CN102876654A

CN102876654A - 一种桑蚕丝素固定化凝血酶的制备方法

Info

Publication number: CN102876654A
Application number: CN2012103983918A
Authority: CN
Inventors: 方富永; 苗艳丽; 王宏波; 芦志刚; 廖艳; 宋文东
Original assignee: Guangdong Ocean University
Current assignee: Guangdong Ocean University
Priority date: 2012-10-19
Filing date: 2012-10-19
Publication date: 2013-01-16

Abstract

本发明涉及一种桑蚕丝素固定化凝血酶的制备方法，属于医药卫生技术领域，包括三羟甲基磷的制备、丝素脱胶、脱胶丝素的活化、凝血酶的固定四个步骤，具体是：利用阻燃剂四羟甲基氯化磷（THPC）与氢氧化钾（KOH）反应得到三羟甲基磷（THP）；将已除杂的桑蚕茧切碎，加入碳酸钠溶液处理脱胶，用蒸馏水洗去碳酸钠，真空干燥得脱胶丝素；加入三羟甲基磷溶液中交联，分离，取固体部分用磷酸盐缓冲液洗，去除多余的三羟甲基磷，真空干燥得活化丝素；取适量加入凝血酶溶液中以固定凝血酶，完成后用磷酸缓冲液洗去游离的凝血酶，吸干，测定活力回收率。本发明工艺简单易行，生产周期较短，生产过程环保无毒；可为批量制备高纯度水蛭素提供物质基础。

Description

一种桑蚕丝素固定化凝血酶的制备方法

技术领域

本发明涉及一种桑蚕丝素固定化凝血酶的制备方法，具体涉及以交联剂三羟甲基磷（THP）通过共价键将凝血酶固定在活化的桑蚕丝素上制成固定化凝血酶，属于中药制备技术领域。

背景技术

凝血酶即凝血因子，临床上凝血酶主要用于各种原因引起的出血的快速止血。虽然凝血酶具有良好的促凝血性能，但由于其本质是蛋白质，因此易变性失活，稳定性较差，从而使凝血酶的应用受到了极大地限制，需要进行固定化研究。

凝血酶也能直接与血液中的纤维蛋白原结合将其水解生成纤维蛋白，使血液凝固，此乃导致人体内血栓形成、诱发心脑血管疾病发生的重要病理基础。凝血酶的分子表面有一个富含碱性氨基酸的纤维蛋白原识别结合位点，水蛭素是到目前为止发现的最有效的凝血酶抑制剂，其肽链C端含有较多的酸性氨基酸，在一定条件下可以结合在纤维蛋白原识别结合位点上，阻止凝血酶、纤维蛋白原二者结合，有效的抗血液凝固。水蛭素对多种血栓疾病如静脉血栓、弥散性血管内凝血、脑凝血、血栓静脉炎、及冠状动脉血栓都有预防和治疗效果，特别是对外科手术后及深栓治疗后的再栓塞有重要的预防和治疗效果。

要将水蛭素开发成抗凝、溶栓药物，首先要研究开发制备高纯度的水蛭素制备工艺。目前，水蛭素制备常用水或有机溶剂处理水蛭消化液或水蛭匀浆，得到水蛭素粗提液后，再使用离子交换、凝胶层析结合等电聚焦，离子交换结合亲和色谱，DEAE-纤维素层析结合反相液相色谱等方法纯化。这些方法虽然可以获得高纯度的产品，但需要使用昂贵的设备，且产量低，无法推广。《两种反胶束体系的水蛭素萃取效果比较》文中方富永等采用反胶束萃取、双水相萃取等方法制备水蛭素，虽然工艺简单，但产品纯度相对较低。根据水蛭素能与凝血酶专一结合的特异性，可以固定化凝血酶萃取水蛭素粗提液，其原理是：在一定pH值条件下，纤维蛋白原识别结合位点的碱性氨基酸带正电、水蛭素肽链C端的酸性氨基酸带负电，通过静电引力产生离子键，形成凝血酶-水蛭素复合物；分离该复合物并调整pH值，破坏离子键使凝血酶-水蛭素复合物分开。

《凝血酶的固定化及其稳定性研究》文中李平等使用戊二醛为交联剂进行过凝血酶的壳聚糖固定化研究；《海藻酸钠-壳聚糖固定化凝血酶微球的制备及稳定性研究》中郎轶咏以海藻酸钠-壳聚糖微球为载体，以物理吸附法对凝血酶进行固定化研究。利用活化丝素为载体，以自制的交联剂THP通过共价键将凝血酶固定在活化的桑蚕丝素（以下简称活化丝素）上制成固定化凝血酶的方法还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种桑蚕丝素固定化凝血酶的制备方法，提供一种工艺简单易行、生产周期较短、固定化效果好制备方法；用该固定化凝血酶萃取水蛭素粗提液，离心回收固定化凝血酶可获得高纯度水蛭素。

为实现上述发明的目的，本发明采取的技术方案如下：

一种桑蚕丝素固定化凝血酶的制备方法，包括以下几个步骤：

（1）THP的制备：利用阻燃剂四羟甲基氯化磷（THPC）与氢氧化钾（KOH）反应得到，具体是：取等摩尔量的THPC与KOH分别溶于90 mL和10 mL水中，剧烈搅拌下将KOH水溶液滴加到THPC水溶液中，滴加完毕反应结束，得THP。

（2）丝素脱胶：将已除杂的桑蚕茧随机切碎，按桑蚕茧质量1 g加50 mL的比例加入质量分数为0.5%的碳酸钠溶液，于100 ℃温度下以300 r·min^-1搅拌25~35min，取出，按碳酸钠溶液3 倍的量加入蒸馏水洗涤3 次，每次25~35 min。重复质量分数为0.5%的碳酸钠溶液处理和蒸馏水洗涤步骤各1 次，于45~55℃真空干燥25~35 min得脱胶丝素。

（3）脱胶丝素的活化：使用THP处理使脱胶丝素通过其-NH₂与与THP的-CH₂OH脱水后结合。按每1 g脱胶丝素用100 mL THP溶液的比例加入后，以300 r·min^-1搅拌，于25~35 ℃交联35~45 min。交联结束后用0.1 mol·L^-1 pH值为7.5~8.0的磷酸盐缓冲液洗10~15min，去除多余的THP，于50℃真空干燥得活化丝素，备用。

（4）凝血酶的固定：向100 mL浓度为15抗凝血酶活力单位(ATU)·mL^-1的凝血酶溶液加入0.1~0.3g活化丝素，于25 ℃以300 r·min^-1搅拌，固定3.5~4.5 h后，用0.1 mol·L^-1 pH值为7.5~8.0磷酸缓冲液洗至洗脱液于280 nm波长处无光吸收，吸干，用生理盐水浸泡，待测定活力回收率。

（5）固定化凝血酶活力回收率的测定：是用凝血酶滴定改进法测定溶液中的水蛭素浓度。因凝血酶与水蛭素按等摩尔结合，所以凝血酶的浓度可以用水蛭素的浓度（ATU·mL^-1）表示。测定固定化凝血酶活力回收率时，将一定质量的固定化凝血酶放入一定体积、浓度已知的水蛭素溶液中于37 ℃下作用1 min后，分离固定化凝血酶，测定溶液中残留的水蛭素浓度，用下述公式计算与固定化凝血酶结合的水蛭素数量（指ATU数量，后同）：

与固定化凝血酶结合的水蛭素数量=固定化作用前溶液中水蛭素数量－固定化作用后溶液中水蛭素数量

固定化凝血酶活力回收率=与固定化凝血酶结合的水蛭素数量÷固定化前溶液中的游离凝血酶数量（用ATU数量表示，后同）×100％

与现有的技术相比，本发明的突出实质性特点和显著的进步是：

（1）工艺简单易行、生产周期较短、固定化效果好。

（2）用该固定化凝血酶萃取水蛭素粗提液，离心回收固定化凝血酶获得水蛭素产品纯度明显提高。据资料介绍，用反胶束萃取和双水相萃取等方法制备的水蛭素纯度（比活力）分别为2389.54、2459.98 ATU·mg^-1和3210.27 ATU·mg^-1，而用本发明制备的4 批水蛭素样品纯度分别为4163. 71、4165. 09、4160. 60、4162. 45 ATU·mg^-1，平均4162. 96 ATU·mg^-1，纯度较前两方法有显著提高。

（3）通常所用的固定化酶交联剂为戊二醛，具有一定毒性，长期接触会损害操作者的健康，本发明使用的试剂及产物均为无毒，符合环保要求。

具体实施方式

下面通过实例对本发明做进一步详细说明，这些实例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例1

1、取等摩尔量的THPC与KOH分别溶于90 mL和10 mL水中，剧烈搅拌下将KOH水溶液滴加到THPC水溶液中，滴加完毕反应结束，得THP。

2、将已除杂的桑蚕茧随机切碎，按桑蚕茧质量1 g加50 mL的比例加入质量分数为0.5%的碳酸钠溶液，于100 ℃温度下以300 r·min^-1搅拌25 min，取出，按碳酸钠溶液3 倍的量加入蒸馏水洗涤3 次，每次25 min。重复质量分数为0.5%的碳酸钠溶液处理和蒸馏水洗涤步骤各1 次，于45℃真空干燥35 min得脱胶丝素。

3、使用交联剂THP处理使脱胶丝素通过其-NH₂与THP的-CH₂OH脱水后结合。按每1 g脱胶丝素用100 mL THP溶液的比例加入后，以300 r·min^-1搅拌，于25 ℃交联45 min。交联结束后用0.1 mol·L^-1 pH值为7.8的磷酸盐缓冲液洗10 min，去除多余的THP，于50 ℃真空干燥得活化丝素，备用。

4、将100 mL浓度为15 ATU·mL^-1的凝血酶溶液加入0.1 g活化丝素，于25 ℃以300 r·min^-1搅拌，固定3.5 h后，用0.1 mol·L^-1 pH值为7.5磷酸缓冲液洗至洗脱液于280 nm波长处无光吸收，吸干，用生理盐水浸泡，待测定活力回收率。

5、用凝血酶滴定改进法测定溶液中的水蛭素浓度。将一定质量的固定化凝血酶放入一定体积、浓度已知的水蛭素溶液中于37 ℃下作用1 min后，分离固定化凝血酶，测定溶液中残留的水蛭素浓度，用下述公式计算与固定化凝血酶结合的水蛭素数量：

固定化凝血酶活力回收率=与固定化凝血酶结合的水蛭素数量÷固定化前溶液中的游离凝血酶数量×100％

6、将已测定、计算活力回收率的固定化凝血酶包装、贴签，得固定化凝血酶产品，于-18℃保存备用。

实施例2

2、将已除杂的桑蚕茧随机切碎，按桑蚕茧质量1 g加50 mL的比例加入质量分数为0.5%的碳酸钠溶液，于100 ℃温度下以300 r·min^-1搅拌35 min，取出，按碳酸钠溶液3 倍的量加入蒸馏水洗涤3 次，每次35 min。重复质量分数为0.5%的碳酸钠溶液处理和蒸馏水洗涤步骤各1 次，于55℃真空干燥25 min得脱胶丝素。

3、使用交联剂THP处理使脱胶丝素通过其-NH₂与THP的-CH₂OH脱水后结合。按每1 g脱胶丝素用100 mL THP溶液的比例加入后，以300 r·min^-1搅拌，于35℃交联35 min。交联结束后用0.1 mol·L^-1 pH值为8.0的磷酸盐缓冲液洗15 min，去除多余的THP，于50 ℃真空干燥得活化丝素，备用。

4、将100 mL浓度为15 ATU·mL^-1的凝血酶溶液加入0.3g活化丝素，于25 ℃以300 r·min^-1搅拌，固定4.5 h后，用0.1 mol·L^-1 pH值为7.5磷酸缓冲液洗至洗脱液于280 nm波长处无光吸收，吸干，用生理盐水浸泡，待测定活力回收率。

实施例3

2、将已除杂的桑蚕茧随机切碎，按桑蚕茧质量1 g加50 mL的比例加入质量分数为0.5%的碳酸钠溶液，于100 ℃温度下以300 r·min^-1搅拌30 min，取出，按碳酸钠溶液3 倍的量加入蒸馏水洗涤3 次，每次30 min。重复质量分数为0.5%的碳酸钠溶液处理和蒸馏水洗涤步骤各1 次，于50℃真空干燥30 min得脱胶丝素。

3、使用交联剂THP处理使脱胶丝素通过其-NH₂与THP的-CH₂OH脱水后结合。按每1 g脱胶丝素用100 mL THP溶液的比例加入后，以300 r·min^-1搅拌，于30℃交联40 min。交联结束后用0.1 mol·L^-1 pH值为7.8的磷酸盐缓冲液洗12 min，去除多余的THP，于50 ℃真空干燥得活化丝素，备用。

4、将100 mL浓度为15 ATU·mL^-1的凝血酶溶液加入0.2g活化丝素，于25 ℃以300 r·min^-1搅拌，固定4 h后，用0.1 mol·L^-1 pH值为7.5磷酸缓冲液洗至洗脱液于280 nm波长处无光吸收，吸干，用生理盐水浸泡，待测定活力回收率。

Claims

1.一种桑蚕丝素固定化凝血酶的制备方法，其特征在于：包括以下几个步骤：三羟甲基磷（THP）的制备、丝素脱胶、脱胶丝素的活化、凝血酶的固定，具体方法如下：

（1）THP的制备：取等摩尔量的四羟甲基氯化磷（THPC）与氢氧化钾(KOH)分别溶于90 mL和10 mL水中，剧烈搅拌下将KOH水溶液滴加到THPC水溶液中，滴加完毕反应结束，得THP；

（2）丝素脱胶：将已除杂的桑蚕茧随机切碎，将桑蚕茧加入质量分数为0.5%的碳酸钠溶液，于100 ℃温度下以300 r·min^-1搅拌25~35min，取出，按碳酸钠溶液3倍的量加入蒸馏水洗涤3次，每次25~35 min，重复质量分数为0.5%的碳酸钠溶液处理和蒸馏水洗涤步骤各1次，然后于45~55℃真空干燥25~35min得脱胶丝素；

（3）脱胶丝素的活化：将脱胶丝素加入THP溶液后，以300 r·min^-1搅拌，于25~35℃交联35~45min，交联结束后用0.1 mol·L^-1 pH值为7.5~8.0的磷酸盐缓冲液洗10~15 min，去除多余的THP，于50 ℃真空干燥得活化丝素，备用；

（4）凝血酶的固定：将100 mL浓度为15 抗凝血酶活力单位(ATU)·mL^-1的凝血酶溶液加入0.1~0.3 g活化丝素，于25℃以300 r·min^-1搅拌，固定3.5~4.5 h后，用0.1 mol·L^-1 pH值为7.5~8.0磷酸缓冲液洗至洗脱液于280 nm波长处无光吸收，吸干，用生理盐水浸泡，准备测定活力回收率。

2.根据权利要求1所述的一种桑蚕丝素固定化凝血酶的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述的碳酸钠溶液的加入量为按桑蚕丝质量1 g加50 mL的比例加入质量分数为0.5%的碳酸钠溶液。

3.根据权利要求1所述的一种桑蚕丝素固定化凝血酶的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述的THP的用量为按每1 g脱胶丝素用100 mL THP溶液的比例加入。