JPH01167301A - キチン又はキトサン類の精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はキチン、キトサン類の精製法に関し、更に詳述
すると、キチン、キトサン類の繊維マトリックス中に含
まれるたんばく質をほぼ完全に除去し得る精製法に関す
る。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする問題点〕キチ
ン質は、従来、工業的には甲殻類の甲殻を希塩酸で処理
して無機塩を除去した後、水不溶の懸濁状態で熱希水酸
化ナトリウムで処理してたんばく質等の夾雑物を除去す
る方法により製造されている。また、キチン質の精製法
としては、たんばく質分解酵素を用いてたんばく質を除
去する方法が提案されている（池田、島原：層化５２゜
１９７８）。

しかし、上述した水酸化ナトリウムやたんばく質分解酵
素を用いた従来のキチン質からのたんばく質除去法は、
キチン質を水不溶性のまま懸濁状態で処理を行なうため
、キチン質内部のマトリックス中に取り込まれているた
んばく質を完全に除去することができず、十分な精製を
行なうことができないものであった。

一方、キトサン質は上記方法で得られたキチン質を水不
溶の懸濁状態で濃アルカリ処理により脱アセチル化した
ものであり、従ってなお多くのたんばく質が除去されず
に内部のマトリックス中に取り込まれており、このため
キチン質と同様に水不溶性の懸濁状態で除たんばく処理
を行なうだけではたんばく貿を十分に除去することはで
きながった・ この場合、これまでに報告されているキチン。

キトサン類中のたんばく質量は、水不溶の状態で濃アル
カリ処理することにより抽出された洗液中のたんばく質
を測定していたにすぎず、キチン。

キトサンマトリックス中に強固に閉じ込められて容易に
離脱してこないたんばく質は測定されていない、しかし
、本発明者らの知見によれば、キチン、キトサン類には
強固に結合した繊維マトリックス中にたんばく質が１０
〜２０％程度含まれているものであり、従ってこれまで
の測定値は実際のたんばく質量より１０〜２０％程度低
いものであるが、キチン、キトサン類を医薬、試薬、化
粧品、食品等の分野で用いるには、上記マトリックス中
に存在するたんばく質を分離除去し、不純たんばく質に
由来するキチン、キトサン含有製品の着色、異臭、沈殿
物の発生等の品質劣化を防止することが重要である。

本発明は、上記事情に鑑みなされたもので、キチン、キ
トサン類の繊維マトリックス中に含まれるたんばく質を
も確実に分離し得、キチン、キトサン類からほぼ完全に
たんばく貿を除去することが可能な新規精製法を提供す
ることを目的とする。

〔問題点を解決するための手段及び作用〕即ち、本発明
は上記目的を達成するため、水溶性キチン、キトサン類
に均一溶液系でたんばく質分解酵素又はキチン、キトサ
ン類査解酵素を反応させるようにしたものである。

本発明によれば、キチン、キトサン類を水溶性化し、こ
の水溶性キチン、キトサン類を水系溶媒中に均一に溶解
することにより内部マトリックス中に閉じ込められてい
た不純たんばく質を表面に露出させると共に、この均一
溶液系でキチン、キトサン類にたんばく質分解酵素又は
キチン、キトサン類分解酵素を作用させることにより、
キチン。

キトサン繊維マトリックス中に取り込まれているたんば
く質をもほぼ完全に分離、除去し得る。この場合１本発
明において、たんばく質分解酵素を用いたときは、キチ
ン、キトサン類に含まれるたんばく質が分解、除去され
、キチン、キトサン類分解酵素を用いたときはキチン、
キトサン類との結合性たんばく質が効果的に分離、除去
されるものである。

以下１本発明につき更に詳しく説明する。

本発明のキチン、キトサン類の製造法は、上述したよう
に水溶性キチン、キトサン類に均一溶液系でたんばく質
分解酵素又はキチン、キトサン類分解酵素を反応させる
ものである。

この場合、水溶性キチン、キトサン類の種類に限定はな
く、オリゴマーからポリマーまで種々の分子量のものを
使用できるが、具体的には下記に例示するものを好適に
用いることができる。

（１）キチンまたはキトサンを分解して低分子化したキ
チンまたはキトサンの水溶性オリゴマー（但し、グルコ
サミン単位の重合度が１より大きいもの）。

このようなオリゴマーは１通常の低分子化法により得る
ことができ１例えば亜硝酸分解法、ギ酸分解法、塩素分
解法（特開昭５９−４３２８２号）。

酵素或いは微生物分解法などにより得ることができる。

（２）脱アセチル化度が好ましくは４０〜６０％の水溶
性部分脱アセチル化キチン。

例えば、特開昭５３−４７４７９号公報に示された方法
により、キチンの脱アセチル化度を制御することにより
得られる。

（３）キトサンの有機酸又は無機酸の塩で、有機酸の具
体例としては、酢酸、リンゴ醸、クエン酸。

アスコルビン酸等が挙げられ、また、無機酸としては、
塩酸、硫酸、リン酸等が例示される。

（４）キチン又はキトサンに親木基を導入して水溶性と
した誘導体、この具体例としては以下のものが挙げられ
る。

■ポリオキシエチレンーポリオキシプロピレンキチン又
はキトサン 〔式中、ｎ：＞１ Ｒ１ニーＨ，−ＣＯＣＨ，又番８ＥＯ％；−÷ｐｏｑ、
ｕ（但し、ａｘ＝Ｏ〜５．ｍ１＝Ｏ〜５．＠＋ｍ≠０）
Ｒ，ニーＨ又は−（ＥＯ枇・→ＰＯ鷺Ｈ（但し、＊、＝
Ｏ〜５．ｍ、＝ｏ〜５ｔ　＠、＋ｍ、≠０）Ｒ，：　−
Ｈ又は−（ＥＯｉ・−（ｐｏ砒Ｈ（但し、ｍ３＝Ｏ〜５
．ｍ、＝Ｑ〜５．幻十ｍ、≠０）を表わす。ここでＥＯ
はオキシエチレン鎖を。

ＰＯはオキシプロピレン鎖を表わし、また、ＥＯとＰＯ
との結合の順序は問わず１例えば、まず７Ｄ−グルコサ
ミン骨格にＰＯが付加し、次いでＥＯが付加していても
よく、ＥＯとＰＯとがランダムに付加していてもよい、
また、結合している個々のＤ−グルコサミン骨格で、Ｒ
１，Ｒ，、Ｒ，。

ｍ、、ｍ、、ｍ３．　Ｑ、、　Ｑ、、　（１，はツレｆ
し同一テモＪ％なっていてもよい。〕 このポリオキシエチレン・ポリプロピレングリコールキ
チン又はキトサンは、アルカリキチン或いはキトサンに
、クロルヒドロキシエチレン、クロルヒドロキシプロピ
レン、エチレンオキサイド又はプロピレンオキサイドを
常温・常圧下や５０〜６０℃で１〜５ｋｇ／ａＪＧの加
圧下に反応させることにより得ることができる。

■カルボキシメチルキチン又はキトサン〔式中、ｎ：＞
１ Ｒ４ニーＨ又は−ｃ　ＯＣＨ。

Ｒ，ニーＨ，−ＣＨ，Ｃ０ＯＨ，−ＣＨ２ＣＯＯＮａ、
−０Ｍ２ＣＯＯＫ又は−ＣＨ２ＣＯＯＮＨ４ Ｒ，：　−Ｈ，−ＣＨ２ＣＯＯＨ，−ＣＨ２ＣＯＯＮａ
、　−ＣＨ２ＣＯＯＨ又は−ＣＨ，ＧＯＯＮＨ。

を表わす、但しＲ１及びＲ６が共に−Ｈとなることはな
い、また、結合している個々のＤ−グルコサミン骨格で
、　Ｒ４，Ｒ，、Ｒ，はそれぞれ同一でも異なっていて
もよい。〕 このカルボキシメチルキチン又はキトサンは。

アルカリキチン又はキトサンにモノクロル酢酸を常温・
常圧下に反応させることにより得ることができる。

■リン酸化キチン又はキトサン 但し、Ｒ，とＲ３が同時に−Ｈとなることはない。

を表わす。また、結合している個々のＤ−グルコサミン
骨格でＲ？　＋　Ｒｓ　−Ｒｓ　＋　Ｒｘ。はそれぞれ
同一でも異なっていてもよい。〕 このリン酸化キチン又はキトサンは、メタンスルホン酸
中に溶解乃至懸濁させたキチン又はキトサンに対し、１
醸化ニリンを冷却下に反応させることにより得ることが
できる。この方法は、例えば日本化学会第４８秋季年会
講演予稿集■。

５７０頁（西則雄ら）に記載されている。

■硫酸化キチン又はキトサン 〔式中、ｎ：）１ −ＮＨ４） −ＮＬ） を表わす。また、結合している個々のＤ−グルコ５サミ
ン骨格で、Ｒ１□、Ｒ工、、Ｒ，、、Ｒ１４は同一であ
っても異なっていてもよい、〕 この硫酸化キチン又はキトサンは、ピリジン中で活性化
したキチン又はキトサンに５Ｏ１−ピリジン錯塩を反応
させることにより得ることができる（参考文献：　Ｍ　
、　Ｌ　、　Ｗｏｌｆｒｏｍ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｔ　
ｈｅＳ　ｕｌｆｏｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｉｔｏｓａ
ｎ、　Ｊ　、　Ａｍ、　Ｓ　ｏｃ、　、　８よ。

１７６４−１７６６（１９５９））。

■Ｎ−グリシジルトリメチルアンモニウムキトサン 〔式中、ｎ：〉１ （Ｘ工はＣＱ又はＢｒ） （ＸＺはＣＱ又はＢｒ） このＮ−グリシジルトリメチルアンモニウムキトサンは
、高濃度アルカリ触媒下でキトサンにグルシジルトリメ
チルアンモニウムクロライドを高温高圧下で付加させる
ことにより得ること力１できる。

■ジヒドロプロピルキチン又はキトサン〔式中、ｎ：〉
■ Ｒ□７：−Ｈ又は−ＣＯＣＨ。

を表わす。但し、Ｒ１，とＲｌｓが同時に−Ｈとなるこ
とはない。〕 このジヒドロキシプロピルキチン又はキトサンは、高温
下でアルカリキチン又はキトサン番こエピクロルヒドリ
ンを開環、付加させること番こより得ることができる。

■Ｎ−２−ヒドロキシプロピルスルホン酸キトサン 拭１・″”　　　　　。

（Ｍｌ、はＮａ、Ｋ又は−ＮＨ４） （Ｍｌ４はＮｏ、　Ｋ又は−ＮＨ，） を表わす。但し、Ｒ２ＯとＲ２１が同時に一■（どなる
ことはない。〕 とのＮ−２−ヒドロキシプロピルスルホン酸キトサンは
、アルカリ触媒下でキトサンにグリシジルスルホン酸を
高温・加圧下で付加させることしこより得ることができ
る。

なお、水溶性キチン、キトサン類を溶解する溶媒として
は、水等の水系溶媒を用いることができる。

また、たんばく質分解酵素の種類に特に制限はないが、
具体的には例えば中性域に最適ｐＨを持つものとしてア
クチナーゼ（純正化学）、トリプシン（和光純薬）、プ
ロテアーゼＮ、プロテアーゼＳ。

プロテアーゼＰ、プロテアーゼＡ、パパインＷ−３０（
天野製薬）、サモアーゼ、プロチンＰＳ−１０（大和化
成）、中性プロテアーゼ（長瀬産業）等。

アルカリ性に最適ｐＨを持つものとしてアルカラーゼ（
ノボ社）、プロレザー（天野製薬）、プロチンＡＳ−１
０（大和製薬）、アルカリプロテアーゼ（長瀬産業）等
、酸性に最適ｐＨを持つものとしてペプシン（シグマ社
）、プロテアーゼＭ、ニューラーゼＦ（天野製薬）、プ
ロチンＦＡ（大和化成）、酸性プロテアーゼ（長瀬産業
）等を好適に使用することができる。

また、キチン、キトサン類分解酵素の種類にも限定はな
いが、具体的にはキチナーゼ（生化学工業、シグマ社）
、リゾチーム、キトサナーゼ（生化学工業）等が好適に
使用される。

なお、たんばく質分解酵素又はキチン、キトサン類分解
酵素はそれぞれ１種を単独で用いτもよく、２種以上を
併用してもよい、また、たんばく質分解酵素とキチン、
キトサン類分解酵素とを併用してもよい。

これら酵素はかならずしも精製された物を使う必要はな
く、該酵素活性を菌体外に放出する細菌等の微生物を水
溶性キチン、キトサン類と反応させることもできる。更
に、用いる酵素、微生物は水不溶性カラム用ゲル担体或
いは膜に固定化し、固定化酵素、微生物膜等として水溶
性キチン、キトサン類と反応させることもできる。

本発明は水溶性キチン、キトサン類、酵素、水系溶媒の
存在する系で行なうが、水溶性キチン。

キトサン質の量は種々選択され、特に制限されるもので
はないが、好ましくは系中の水分量１ｇに対しＯ，ＯＯ
ｌ　〜Ｉｇ、より好ましくは０．０１〜０．５ｇで反応
を行なう。

また、酵素量も種々選定されるが、系中の水溶性キチン
、キトサン類に対し、好ましくは５〜５００．０００単
位／ｇ、より好ましくは１０〜５０．０００単位／ｇで
反応を行なう。

この場合、これらの酵素の活性単位（Ｕ）は、各酵素の
最適ｐＨにおいて、たんばく質分解酵素の場合には４０
”Ｃでカゼインに作用させ、１．０μｍｏｌ（１８１μ
ｇ）のチロシン（Ｆ　ｏｌｉｎ−Ｃ１ｏｃａｌｔｅｕ試
薬で測定）を１分間に遊離させる酵素量を１単位（Ｕ）
と定義し、キチン、キトサン類分解酵素の場合には２５
℃において４８時間にキチン或いはキトサンから１．の
Ｎ−７セチルグルコサミン或いはグルコサミンを遊離さ
せる酵素量を１単位（Ｕ）と定義する。

本発明によれば、上記反応によって生じた低分子ペプタ
イド、アミノ酸、キチン、キトサン類の結合性たんばく
質、酵素たんばく質等を透析、限外濾過等の適宜手段で
分離除去することにより、精製キチン、キトサン類を採
取することができる。

〔発明の効果〕

以上説明したように、本発明は、キチン、キトサン類に
不純物として含まれるたんばく質をほぼ完全に除去する
ことができるものである。従って、本発明によれば、不
純たんばく質に起因する経時的保存における沈殿物の生
成１着色、微生物の資化による異臭の発生等の品質劣化
が生じにくく、医薬品、食品、雑貨品等の種々の分野で
有効に使用し得る精製度の高いキチン、キトサン類を得
ることができる。

次に、本発明について実施例を挙げて更に詳しく説明す
るが１本発明は以下の実施例に限定されるものではない
。

〔実施例１〕 低分子キトサン（平均分子量４．　ＯＯＯ、塩酸分解品
；たんばく量１０．５％、ローリー法にて牛血清アルブ
ミンを標準として測定）４ｇにイオン交換水１００ｇを
加え、溶解後、アクチナーゼ（純正化学）０．４ｇを添
加混合し、希塩酸でｐＨを７．５に調整し、反応温度４
０℃で１８時間反応を行なった。反応終了後、限外濾過
、透析により酵素たんばく及び低分子ペブタイドを除去
し、次いで凍結乾燥し、精製低分子キトサン３．８ｇを
得た。

このもののたんばく量をローリ−法にて牛血清アルブミ
ンを標準として測定したところ、０．０１％以下であっ
た。また、この精製低分子キトサン１％水溶液を４０℃
で１月間保存したが１着色。

異臭、沈殿物の発生は見られなかった。

〔実施例２〕 エチレングリコールキチン（平均分子量２００００　；
たんばく量８．７％、ローリー法にて牛血清アルブミン
を標準として測定）１０ｇにイオン交換水ＩＱを加え、
溶解後、アルカラーゼ（ノボ社）０．１ｇを添加混合し
、希水酸化ナトリウム溶液でｐＨ９，０に調整し、反応
温度５０℃で１２時間反応を行なった。反応終了後、限
外濾過、電気透析により酸素たんばく及び低分子ペプタ
イドを除去し、次いで凍結乾燥し、精製エチレングリコ
ールキチン９．２ｇを得た。

本物質のたんばく量をローリ−法にて牛血清アルブミン
を標準として測定したところ、０．０１％以下であった
。また、この精製エチレンゲルコールキチンの３％水溶
液を５０℃で１ケ月保存したが、着色、異臭、沈殿物の
発生は見られな力１つだ。

出願人　　ラ　イ　オ　ン　株式会社 代理人　　弁理士　　小　島　隆　司

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、水溶性キチン又はキトサン類に均一溶液系でたんぱ
   く質分解酵素並びにキチン及びキトサン類分解酵素から
   選ばれる１種又は２種以上の酵素を反応させることを特
   徴とするキチン又はキトサン類の精製法。