JPH07313174A

JPH07313174A - 酵素反応方法

Info

Publication number: JPH07313174A
Application number: JP13494594A
Authority: JP
Inventors: Mamoru Tomita; 守冨田; Seiichi Shimamura; 誠一島村; Makoto Kato; 良加藤; Yoshitaka Tamura; 吉隆田村; Hiroshi Ochi; 浩越智; Kenji Nishi; 賢司西
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 1994-05-25
Filing date: 1994-05-25
Publication date: 1995-12-05

Abstract

(57)【要約】【構成】固定化酵素等を用いて基質を処理する酵素反
応を、少なくとも１ＭＰａの加圧下で行う酵素反応方
法。【効果】酵素反応を加圧下で行うことにより、酵素反
応中の細菌等の微生物の増殖を抑制し、かつこれにより
酵素活性の維持された酵素を反復利用すること、又、固
定化酵素を反応至適温度において活性を低下させずに長
期間連続使用することを可能とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、酵素反応方法に関す
るものであり、詳しくは、酵素反応を加圧条件下で行う
ことにより、酵素反応中の細菌等の微生物の増殖を抑制
し、かつこれにより酵素活性の維持された酵素を反復し
て利用することを特徴とする酵素反応方法に関するもの
である。

【０００２】

【従来の技術】従来、酵素反応に用いられる酵素剤及び
基質（被処理物）に、滅菌処理を行うことは、酵素の失
活、基質の変性等が生じるため不可能な場合が多く、細
菌等の微生物が増殖するおそれがあり、至適温度で長時
間酵素反応を継続させることは困難であった。このた
め、一般には雑菌が生育し難い高温下で比較的短時間反
応させる方法が採用されている。

【０００３】また、酵素反応に用いられる酵素剤は、酵
素反応を行う毎に添加され、反応終了後は加熱処理によ
って失活させるか、又はＵＦ膜等を用いた限外濾過によ
り酵素反応生成物から分離し、廃棄されていた。

【０００４】そこで最近では、酵素を担体に固定化し、
反復使用が可能な固定化酵素が考案され、各種の酵素反
応に広く利用されている。

【０００５】しかし、このような固定化酵素も、長期間
の使用によって細菌等の微生物が増殖し、基質の変敗、
担体への付着等による酵素活性の低下の問題が生じてい
る。

【０００６】このため、固定化酵素を、使用前又は使用
後、殺菌剤又は洗浄剤を用いて処理する方法が各種提案
されている。例えば、固定化酵素をジオクチルエチレン
トリアミン等の置換ジエチレントリアミンの希薄水溶液
と接触させて殺菌する方法（特開昭５６−９２７９１号
公報）、多価アルコールに浸漬して殺菌する方法（特開
昭５９−１７５８７９号公報）、ラウリルベンゼンスル
ホン酸塩とエタノールとを含む混液で処理して洗浄殺菌
する方法（特開昭５９−９８６８９号公報）等が提案さ
れている。

【０００７】また、前記のような化学的処理ではなく、
固定化酵素に紫外線を照射して付着する微生物を殺菌す
る方法（特開平１−２２８４５４号公報）等も提案され
ている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、前記従
来技術における、細菌等の微生物の増殖を抑制するため
の高温下で比較的短時間の酵素反応には、高温による酵
素活性の低下、反応時間の制約により、ある程度以上反
応が進んだ生成物が得られない等の種々の問題が存在す
る。

【０００９】固定化酵素を用いる方法においても、殺菌
剤又は洗浄剤を用いて処理する方法の場合には、その洗
浄殺菌処理に長時間を要すること、殺菌剤又は洗浄剤を
完全に除去する操作が必要なこと、洗浄殺菌効果が必ず
しも充分ではないこと、処理による酵素活性の低下等の
種々の問題が存在する。

【００１０】また、紫外線の照射による方法の場合に
は、固定化酵素に付着した微生物を完全に殺菌すること
は困難であるという問題が存在する。

【００１１】更に、固定化酵素が前記の方法により、仮
に無菌状態になったとしても、酵素反応の基質が、例え
ばホエータンパク質のように加熱滅菌が困難な物質の場
合には、基質からの雑菌混入も生じ、反応系全体の無菌
状態は維持されず、その結果、雑菌の増殖可能な温度で
の長期間の連続使用は困難となる。

【００１２】そこで、この発明の発明者らは、前記従来
技術に鑑みて、前記問題点を解決し、酵素反応中の細菌
等の微生物の増殖を抑制し、かつこれにより酵素活性の
維持された酵素を反復利用すること、又、固定化酵素を
反応至適温度において活性を低下させずに長期間連続使
用することを可能とする、新規な酵素反応方法を開発す
ることを目標として鋭意研究を行った。その結果、従来
技術のように、反応温度を高く設定したり、固定化酵素
に洗浄・殺菌処理を施すのではなく、酵素反応中、酵素
活性を低下させず、かつ細菌等の微生物の増殖を抑制す
ることが可能な、１Ｍｐａ以上１００ＭＰａ以下の圧力
で加圧することにより、所期の目的を達成し得ることを
見い出し、この発明を完成するに至った。

【００１３】すなわち、この発明は、前記従来技術の問
題点を解決し、酵素活性を低下させることなく反応中の
細菌等の微生物の増殖を抑えることが可能な酵素反応方
法を提供することを目的とするものである。

【００１４】

【課題を解決するための手段】前記課題を解決するこの
発明は、酵素を用いて基質を処理する酵素反応方法にお
いて、少なくとも１ＭＰａの加圧下で基質を処理するこ
とを特徴とする酵素反応方法であり、酵素が、固定化酵
素であること及び圧力が、１ＭＰａ以上１００ＭＰａ以
下であることを望ましい態様としてもいる。

【００１５】次にこの発明の構成および好ましい態様に
ついて詳しく説明する。

【００１６】この発明では、公知のプロテアーゼ、ラク
ターゼ等の各種の酵素を適宜使用することができる。

【００１７】この発明に使用される固定化酵素として
は、公知の方法により、酵素を、水に不溶性の担体、例
えば、キトサン、キチン又は樹脂等に吸着・結合させた
もの、ポリアクリルアミドゲル等の高分子に包括させて
固定化させたものを例示することができる。

【００１８】基質は、各種タンパク質、各種多糖類等目
的により適宜使用することができる。この発明の方法に
使用される反応装置は、酵素と基質が接触した状態で所
定の圧力が保持できるものであれば特に制限されるもの
ではなく、バッチ式であっても、連続式であってもよ
い。

【００１９】酵素反応の際の加圧圧力は、通常高圧であ
るほど殺菌効果は大きいが、この発明の方法における加
圧は、殺菌を目的とするものではなく、反応中の微生物
の増殖を抑制すること、すなわち静菌を目的としてお
り、１Ｍｐａ以上１００ＭＰａ以下の圧力で充分な効果
が得られる。なお、前記の加圧下において酵素反応を行
った場合には、耐圧性の弱い微生物であれば、長期間に
わたる加圧により殺菌され、又耐圧性を有する微生物で
あっても、増殖が抑制されれば、この発明における酵素
反応に悪影響を及ぼすことはなく、必ずしも微生物を死
滅させる必要はない。

【００２０】圧力が、１Ｍｐａ未満の場合は、細菌等の
微生物の増殖を抑制することができず、１００ＭＰａを
超える高圧の場合は、酵素活性の低下、又は、基質の変
性等が生じ、更に高圧処理のための設備費及び製造費が
高くなるため、所期の目的を達成できない。

【００２１】この発明は、加圧下で酵素反応を行うこと
により、反応至適温度において活性を低下させずに微生
物の増殖を抑制することを目的としており、大気圧下と
は異なる酵素反応、例えば選択性、反応性の向上等を期
待するものではないが、酵素及び基質の種類、反応の条
件によってはこれらの効果が得られることもある。

【００２２】次に実施例を示してこの発明をさらに詳細
かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定さ
れるものではない。

【００２３】

【実施例】

実施例１樹脂製レトルト袋（東洋製罐社製）に、酵素反応基質と
して５％ホエータンパク質分離物（ＷＰＩ）水溶液１０
０ｍｌ及びプロテアーゼＮ「アマノ」（天野製薬社製）
０．０４５ｇを、空気が入らないように充填して密封
し、加圧装置（三菱重工業社製。ＭＦＰ−７０００）を
用いて１００ＭＰａの加圧条件下で４３℃、６時間１回
目の酵素反応を行った。

【００２４】１回目の酵素反応処理後、反応液をＵＦ膜
を用いて分離し、酵素反応生成物（生成物１）と酵素を
含む残渣部とを得た。回収した酵素を含む残渣部０．９
５ｇ（固形分として）を新たに調製した酵素反応基質
（５％ＷＰＩ水溶液１００ｍｌ）に添加し、１回目の酵
素反応と同様の条件で２回目の酵素反応及び反応液の膜
分離を行い、酵素反応生成物（生成物２）と酵素を含む
残渣部とを得た。

【００２５】試験例１実施例１で得られた生成物１及び生成物２の分解率は、
フォルモル（Formol）滴定法（米国薬局方：United Sta
tes Pharmaceperial Convention XXI 1985）により測定
したアルファ・アミノ酸態窒素の値およびケルダ−ル法
（日本分析化学会編、分析化学実験ハンドブック、第６
０１ペ−ジ、丸善、昭和６２年）により測定した全窒素
の値を用いて、次式分解率（％）＝（アルファ・アミノ酸態窒素／全窒素）
×１００により計算した結果、それぞれ２０．４１％及び１９．
４２％であった。また、ポリ・ヒドロキシエチル・アス
パルタミド（Poly Hydroxyethyl Aspartamide ）カラム
（ポリ・エル・シ−（Poly LC ）社製）を用いて、高速
液体クロマトグラフィ−法（宇井信生等編、「タンパク
質・ペプチドの高速液体クロマトグラフィ−」、化学増
刊第１０２号、第２４１ペ−ジ、株式会社化学同人、１
９８４年）により測定した分子量分布もほぼ一致してい
た。

【００２６】酵素添加前のＷＰＩ水溶液中及び生成物１
中の生菌数を常法により測定した結果は、それぞれ、２
×１０⁴個／ｍｌ、１×１０²個／ｍｌであり、生菌数
の減少が認められた。

【００２７】これらの結果は、この発明の酵素反応方法
によれば、酵素がその酵素活性を維持した状態で反復利
用することが可能なこと、及び酵素反応中の細菌等の微
生物の増殖が抑制可能なことを示している。

【００２８】実施例２樹脂製レトルト袋（東洋製罐社製）に、酵素反応基質と
して５％ホエータンパク質分離物（ＷＰＩ）水溶液１０
０ｍｌ及び物理的吸着法によりプロテアーゼＮ「アマ
ノ」（天野製薬社製）を固定化したキトパール（富士紡
績社製）５．０ｇを、空気が入らないように充填して密
封し、加圧装置（三菱重工業製、ＭＦＰ−７０００）を
用いて１０ＭＰａの加圧条件下で４４℃、６時間１回目
の酵素反応を行った。

【００２９】１回目の酵素反応処理後、反応液を濾過分
別し、固定化酵素と酵素反応生成物（生成物１）とを得
た。回収した固定化酵素４．８ｇを新たに調製した酵素
反応基質（５％ＷＰＩ水溶液１００ｍｌ）に添加し、１
回目の酵素反応と同様の条件で２回目の酵素反応及び反
応液の濾過分別を行い、固定化酵素と酵素反応生成物
（生成物２）とを得た。

【００３０】試験例２実施例２で得られた生成物１及び生成物２の分解率は、
試験例１と同様の方法により測定し、計算した結果、そ
れぞれ２３．７５％及び２２．６８％であり、固定化酵
素の繰り返し使用による酵素活性の低下は見られなかっ
た。

【００３１】酵素添加前のＷＰＩ水溶液中及び生成物１
中の生菌数を常法により測定した結果は、それぞれ、１
×１０³個／ｍｌ、１×１０²個／ｍｌであり、生菌数
の減少が認められた。

【００３２】これらの結果は、この発明の酵素反応方法
によれば、固定化酵素を反応至適温度において活性を低
下させずに長期間連続使用することが可能なこと、及び
酵素反応中の細菌等の微生物の増殖が抑制可能なことを
示している。

【００３３】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明
は、酵素反応を加圧条件下で行うことを特徴とした酵素
反応方法に係るものであり、この発明によって奏せられ
る効果は次のとおりである。（１）酵素活性を低下させることなく微生物の増殖を抑
制する。（２）酵素の反復利用又は長期間連続使用を可能とす
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者田村吉隆神奈川県座間市東原５−１−83 森永乳業株式会社栄養科学研究所内 (72)発明者越智浩神奈川県座間市東原５−１−83 森永乳業株式会社栄養科学研究所内 (72)発明者西賢司神奈川県座間市東原５−１−83 森永乳業株式会社食品総合研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】酵素を用いて基質を処理する酵素反応方
法において、少なくとも１ＭＰａの加圧下で基質を処理
することを特徴とする酵素反応方法。
【請求項２】酵素が、固定化酵素である請求項１に記
載の酵素反応方法。
【請求項３】圧力が、１ＭＰａ以上１００ＭＰａ以下
である請求項１又は請求項２記載の酵素反応方法。