JP3944716B2 - 微生物菌体の殺菌方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は微生物菌体の殺菌方法に関するものであり、例えばニトリル化合物を水和する能力を持つニトリルヒドラターゼ等の、工業的に有用な酵素を生産する遺伝子組換え微生物菌体の殺菌方法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
近年、微生物菌体を利用した酵素の製造が一般的に行われている。たとえば、ある特定の酵素を触媒として用い、例えばニトリル化合物を原料としてアミド化合物を製造することが実用化されている。
【0003】
しかし、微生物菌体を用いた酵素の製造においては、製造の各工程における菌体の漏洩の恐れがあり、微生物菌体による汚染をひきおこす可能性がある。さらに、微生物菌体に遺伝子組換え体を利用する場合には、死滅化されていない菌体の使用にあたっては、各種ガイドラインに従い、全ての遺伝子組換え微生物菌体を閉鎖設備内で取り扱う必要がある。 また、閉鎖系外で利用する場合、遺伝子組換え微生物菌体は完全に死滅していなければならない。
【0004】
さらにこの微生物菌体を死滅させる時には、その微生物菌体のもつ酵素(例えばニトリルヒドラターゼ)の触媒としての活性を失活させることなく、殺菌することが望ましい。この際に、殺菌されたものの中の生菌数は検出されないことが好ましく、また殺菌工程の前後での酵素活性の低下度は20%以下が好ましいとされ、さらに好ましくは限りなく0%に近いことが良いとされる(ここで言う活性とは、単位微生物菌体重量・単位時間あたりのアミド化合物の生成速度を指す。)。
【0005】
しかしながら現在までのところ、殺菌方法として、装置的な工夫を施した方法としては、磁気的な殺菌方法(特開平3−267194)、マイクロ波による殺菌方法(特開平5−229530)等が知られているが、磁気的、マイクロ波による殺菌方法では大量の液を処理する場合、大掛かりな装置が必要になり、装置自体も高価になる。
【0006】
また、殺菌時に殺菌剤を加える方法として、塩化ベンザルコニウムを加える殺菌方法(特開昭61−152276)、クロルヘキシジンを加える殺菌方法(特開平5−75392)、イソチアン酸アリルを加える殺菌方法(特開平11−322521)等が知られているが、これらの殺菌液を加える方法では、殺菌液が製品中に分散されこれを取り除くのは困難であり、不純物として残ってしまい酵素または殺菌済み微生物菌体を用いる反応生成物中まで残ってしまう可能性が強い。特に酵素反応生成物の重合を伴う反応(ポリ乳酸やポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド等)に用いようとすると、これらの物質が還元剤や酸化剤として作用し重合品品質の悪化や重合条件の大幅な変更が必要になる可能性がある。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は、微生物菌体を閉鎖系外で利用する為、酵素活性を損なうことなく工業的に使用できるような、効率的な微生物菌体の殺菌方法を提供することを課題とするものである。
【0008】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、高濃度に存在する微生物菌体の効率的な殺菌方法に関して鋭意検討を行なってきたところ、該微生物菌体にニトリル類、アミド類またはその塩類を加えること、特にある濃度で加え、ある特定の温度範囲で保持することにより、その触媒能はほとんど失活することなく、効率的に殺菌し得ることを見出し、本発明を完成した。
【0009】
また、本発明において、アミド類を生産する場合には、生産物と同じアミド類もしくは原料ニトリル類を使用することにより不純物がまったく発生しなくなる。
【0010】
すなわち、本発明は、微生物菌体を含む懸濁液を加熱殺菌する際に、ニトリル類、アミド類、その塩類から選ばれた少なくとも1種の化合物を添加する事を特徴とする微生物菌体の殺菌方法を提供することである。
【0011】
【発明の実施の形態】
本発明で述べられている酵素とは、化学品等の製造に有用な物質のことである。具体的に本発明に述べる酵素としては、特に制限されるものではないが、例えばニトリルヒドラターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、トリプトファンシンターゼ等を挙げることができる。
【0012】
本発明の微生物菌体としては、酵素を生産する微生物菌体であれば特に制限はないが、例えばニトリルヒドラターゼを産生する大腸菌を挙げることができる。
【0013】
大腸菌の宿主の具体例としては、Escherichia coli K−12由来W3110株(ATCC27325)、同HB101株(ATCC33694)、同JM109株(ATCC53223)または同WA802株(ATCC33526)株などがあげられる。
【0014】
ニトリルヒドラターゼを産生する遺伝子組換え大腸菌の具体例としては、ニトリルヒドラターゼ遺伝子が大腸菌に導入されているMT−10822株(FERM BP−5785、特開平11−253168参照)等があげられる。
【0015】
本発明の微生物菌体は通常、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において、公知の一般的な方法を利用して調製される。例えば、LB培地やM9培地等の通常液体培地に該微生物菌体を植菌した後、適当な培養温度(一般的には30〜50℃であるが、好熱菌の場合は50℃以上でもよい。)で生育させることにより得られる。
【0016】
殺菌処理を実施する場合、ここでの懸濁液とは培養液、培養液から遠心分離等利用し回収した集菌液、さらに適当な緩衝液で洗浄した洗浄菌体、その処理物が挙げられる。処理物とは例えば、細胞膜の透過性向上や遺伝子組換え菌が生産する有用物質の安定性向上等の為に培養液、菌体、洗浄菌体を熱処理、薬剤処理をおこなったもの、破砕菌体処理したもの等が上げられる。さらに、薬剤処理、凍結処理等で部分的に死滅化した懸濁液と本殺菌法を併用することも可能である。
【0017】
本殺菌時の菌体濃度は、特に制限はない。加えるニトリル類としてはアクリロニトリル、メタクリロニトリル等が、加えるアミド類としてはアクリルアミド、メタクリルアミド等が挙げられる。加えるニトリル類、アミド類、またはその塩類の濃度は、0.1重量%〜10.0重量%、より好ましくは、0.1重量%〜5.0重量%が望ましい。この範囲であると、十分な殺菌が行われ、且つ酵素活性も余り低下しない。
【0018】
また、殺菌時の液温度は殺菌を実施する懸濁液で45℃〜60℃が望ましい。この範囲であると、十分な殺菌が行われ、且つ酵素活性も余り低下しない。その際の培養液、菌体等の懸濁液のpHは、遺伝子組換え微生物菌体が生産する酵素の変性、失活等がおこりにくいpHに設定することが望ましい。具体的には、pHは、6.0から8.0が望ましい。この範囲であると、十分な殺菌が行われ、且つ酵素活性も余り低下しない。
【0019】
さらに、殺菌時のホールド時間は、1時間〜4時間が望ましい。この範囲であると、十分な殺菌が行われ、且つ酵素活性も余り低下しない。
【0020】
また、微生物菌体が生産する酵素の変性、失活等が起りにくいよう安定剤、例えば酵素であればその基質、生成物等を添加することも有効である。まれに、一回の殺菌操作で遺伝子組換え菌の完全な死滅化が実施されないことがあるが、その際には本殺菌法を複数回実施すれば完全な死滅化が達成される。
【0021】
本発明で用いられる微生物菌体とは、特定の酵素を生産するように遺伝子組換えした微生物菌体であり、具体例としてニトリルヒドラターゼ活性を有する菌体が挙げられるが、これに限定するものではない。
【0022】
ここでニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体とは、シュードノカルディア・サーモフィラJCM3095由来のニトリルヒドラターゼを酵素として有する菌体が代表例として挙げられ、菌体としては大腸菌の他、枯草菌、酵母や放線菌等が挙げられる。
【0023】
上記した菌体は通常、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において、公知の一般的な方法を利用して調製される。例えば、LB培地やM9培地等の通常液体培地に該微生物菌体を植菌した後、適当な培養温度(一般的には20〜50℃であるが、好熱菌の場合は50℃以上でもよい。)で生育させ、続いて該微生物菌体を遠心分離等によって培養液より分離することにより得られる。
【0024】
本殺菌法を実施する場合の懸濁液として培養液、培養液から遠心分離等利用し回収した集菌液、さらに適当な緩衝液で洗浄した洗浄菌体、その処理物が挙げられる。処理物とは、例えば、細胞膜の透過性向上、遺伝子組換え菌が生産する酵素の安定性向上等の為、培養液、菌体、洗浄菌体に薬剤処理をおこなったもの、破砕菌体処理したもの等が上げられる。さらに、薬剤処理、凍結処理等で部分的に死滅化した処理物と本殺菌方法を併用することも可能である。
【0025】
以下、本発明における殺菌方法を簡単にまとめると、まず、培養槽や反応釜など加熱できる容器の中に入った該懸濁液にニトリル類、アミド類、その塩類などを加える。次に懸濁液を加温して、先述の温度範囲(45〜60℃)に保持する。
【0026】
さらに、本発明では上記の範囲の温度に、先述のように一定時間保持(1時間〜4時間)する。その後、保持時間を過ぎたら速やかに冷却することによって、酵素活性の低下を最小限に留めることが出来る。
【0027】
【実施例】
以下、実施例により本発明の大腸菌の殺菌方法を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【0028】
(実施例1)
本実施例に使用する酵素触媒はニトリルヒドラターゼ遺伝子が大腸菌HB101株に導入され、三井化学株式会社が寄託しているMT−10822株(FERM BP−5785、特開平11−253168参照)を用いた。
【0029】
本菌株の培養は2lのバッフル付三角フラスコに下記の組成の培地500mlを調製し、121℃・20分間のオートクレーブにより滅菌した。
【0030】
【0031】
この培地に終濃度が50μg/mlとなるようにアンピシリンを添加した後、上記菌株を一白金耳植菌し、37℃・130rpmにて20時間培養した。また、この際、培養開始約15時間後にIPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)を終濃度100μmol/lになるよう添加し培養する(以下、培養液と略)。遠心分離(15000G×15分間)により菌体のみを培養液より分離し、分離した液に流動性を持たせるため固形分率が約15重量%となるように集菌時の上澄み液を加えて湿菌体を得た(以下、集菌液と略)。これらの一部をサンプリングし下記方法にて酵素活性測定した。
【0032】
その後、集菌液にアクリルアミド(以下、AAMと略)を0.1重量%になるように加え、加熱温度50℃、ホールド時間3hで殺菌処理を実施し、殺菌処理後のサンプルをサンプリングしその活性を測定した。
【0033】
次式、活性残存率(%)=(殺菌後の活性/殺菌前の活性)×100にて活性残存率を求めた。
【0034】
生菌数は、市販のマッコンキー寒天培地「ダイゴ」(日本製薬製)に殺菌前と殺菌後の菌体液を適切に希釈し、100μl播き、寒天培地上にコンラージ棒でよく広げた後、30℃で2日間培養して、生育してきたコロニー数を数えて求めた。結果を表1に示す。
(酵素活性測定方法)
サンプリングした菌体液それぞれの、酵素活性を以下の手順で測定する。
各画分液を50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)により適当に希釈し、これに1重量%のアクリロニトリルを添加して10℃で10分間反応させる。反応液にこれと等量の1Mリン酸水溶液を添加して反応を停止させ、生成したアクリルアミド濃度を高速液体クロマトグラフィー(以下、HPLCと略)分析により測定する。HPLCカラムはULTRON 80HG(50×8φmm)を用い、10mMリン酸水溶液を展開液として使用する。アクリルアミドは220nmの吸光度により検出する。
【0035】
(実施例2〜5、比較例1)
集菌液に加えるアクリルアミド濃度を表1のようにかえたこと以外は前記実施例1と同様の方法で殺菌処理を行った後、同様の方法で生菌数と残存活性を測定した。その結果を表1に示す。
【0036】
【表1】
【0037】
なお、アクリルアミドをメタクリルアミド、アクリロニトリル、メタクリロニトリルまたは、その塩類に変えても同様の結果が得られた。
さらに、集菌液を培養液に変えても同様の結果が得られた。
【0038】
(実施例6〜9)
殺菌時の処理温度を変えた事以外は前記実施例3と同様の方法で殺菌処理を行った後、同様の方法で生菌数と残存活性を測定した。その結果を表2に示す。
【0039】
【表2】
【0040】
なお、アクリルアミドをメタクリルアミド、アクリロニトリル、メタクリロニトリルまたは、その塩類に変えても同様の結果が得られた。
さらに、集菌液を培養液に変えても同様の結果が得られた。
【0041】
(実施例10〜12)
集菌液のpHを変えたこと以外は前記実施例3と同様の方法で殺菌処理を行った後、同様の方法で生菌数と残存活性を測定した。
【0042】
なお、集菌液のpHは水酸化ナトリウム溶液もしくは、硫酸を使って調整した。
その結果、表3のような結果が得られた。
【0043】
【表3】
【0044】
なお、アクリルアミドをメタクリルアミド、アクリロニトリル、メタクリロニトリルまたは、その塩類に変えても同様の結果が得られた。
さらに、集菌液を培養液に変えても同様の結果が得られた。
【0045】
(実施例13〜15)
殺菌時のホールド時間を変えた事以外は前記実施例3と同様の方法で殺菌処理を行った後、同様の方法で生菌数と残存活性を測定した。その結果を表4に示す。
【0046】
【表4】
【0047】
なお、アクリルアミドをメタクリルアミド、アクリロニトリル、メタクリロニトリルまたは、その塩類に変えても同様の結果が得られた。
さらに、集菌液を培養液に変えても同様の結果が得られた。
【0048】
【発明の効果】
本発明によれば、遺伝子組換え微生物菌体にアクリルアミド類もしくはニトリル類、その塩類などを加え、一定温、一定時間で殺菌することにより酵素や有用な物質を変性、失活させることなく完全に死滅化することが可能である。
Claims (7)
- ニトリルヒドラターゼを生産する微生物菌体を含む懸濁液を45〜60℃で加熱殺菌する際に、アクリルアミド、メタクリルアミド、アクリロニトリル、メタクリロ二トリルから選ばれた少なくとも1種の化合物を添加することを特徴とする微生物菌体の殺菌方法。
- 微生物菌体が遺伝子組換え微生物であることを特徴とする請求項1記載の微生物菌体の殺菌方法。
- 遺伝子組換え微生物が遺伝子組換え大腸菌であることを特徴とする請求項2に記載の微生物菌体の殺菌方法。
- 遺伝子組換え大腸菌の宿主がEscherichia coli K−12由来W3110株(ATCC27325)、同HB101株(ATCC33694)、同JM109株(ATCC53223)または同WA802株(ATCC33526)株であることを特徴とする請求項3に記載の微生物菌体の殺菌方法。
- 懸濁液中のアクリルアミド、メタクリルアミド、アクリロニトリル、メタクリロ二トリルから選ばれた少なくとも1種の化合物の濃度が0.1〜10.0重量%であることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の微生物菌体の殺菌方法。
- 懸濁液のpHが6.0〜8.0である請求項1〜5のいずれかに記載の微生物菌体の殺菌方法。
- 加熱保持時間が1〜4時間である請求項1〜6のいずれかに記載の微生物菌体の殺菌方法。
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