RU2188864C2 - Нитрилаза, штамм rhodococcus rhodochrous - продуцент нитрилазы (варианты), способ получения акрилата аммония, способ детектирования нитрила, способ очистки полимера - Google Patents

Нитрилаза, штамм rhodococcus rhodochrous - продуцент нитрилазы (варианты), способ получения акрилата аммония, способ детектирования нитрила, способ очистки полимера Download PDF

Info

Publication number
RU2188864C2
RU2188864C2 RU98113063/13A RU98113063A RU2188864C2 RU 2188864 C2 RU2188864 C2 RU 2188864C2 RU 98113063/13 A RU98113063/13 A RU 98113063/13A RU 98113063 A RU98113063 A RU 98113063A RU 2188864 C2 RU2188864 C2 RU 2188864C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
acrylonitrile
nitrilase
ammonium acrylate
ammonium
nitrile
Prior art date
Application number
RU98113063/13A
Other languages
English (en)
Other versions
RU98113063A (ru
Inventor
Ивон Кристин АРМИТЭЙДЖ
Джонатан ХЬЮС
Нейл Эндрю ВЕБСТЕР
Original Assignee
Циба Спешиалти Кемикал Уотер Тритментс Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Циба Спешиалти Кемикал Уотер Тритментс Лимитед filed Critical Циба Спешиалти Кемикал Уотер Тритментс Лимитед
Publication of RU98113063A publication Critical patent/RU98113063A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2188864C2 publication Critical patent/RU2188864C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/087—Acrylic polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано в ферментативных способах превращения акрилонитрила в аммонийакрилат в водной или парообразной форме и для определения низких уровней содержания нитрила в водной или парообразной форме. Нитрилазы обладают повышенной специфической активностью при экспонировании реакционной среды, в которой их используют, способны превращать низкие концентрации акрилонитрила, а акрилонитрилсодержащий полимер превращать в нетоксичный продукт. Нитрилазы имеют значение Km при рН 7,0 для акрилонитрила от 3,8 до 500 мкМ, значение Ki при рН 7,0 для аммонийакрилата по крайней мере 100 мМ, величина отношения указанного Ki к указанному Km составляет по крайней мере 200, получены культивированием штамма Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757 или NCIMB 40833. 6 с. и 4 з.п. ф-лы, 13 табл.

Description

Изобретение относится к ферментативным способам получения аммонийакрилата и к новым микроорганизмам и ферментам, которые можно использовать в этих способах.
Акриловую кислоту (или ее соли) обычно получают в одну стадию за счет химического превращения из пропиленоксида или в две стадии за счет превращения из акрилонитрила, через промежуточный акриламидсульфат. В результате такого химического превращения можно получить продукт, который содержит нежелательные примеси из-за побочных реакций, включая образование некоторого количества димерной акриловой кислоты, которая имеет тенденцию образовываться, если продукт - акриловая кислота присутствует в высокой концентрации в условиях ее получения.
Использование амидазы для превращения акриламида в акриловую кислоту (в виде аммонийной соли) много раз было описано в литературе.
Главным образом это было связано с превращением остаточной примеси мономера в акриламидном полимере в аммоний-акрилат, но было также предложено, что было бы желательно использовать амидазу для коммерческого получения аммонийакрилата из акриламида.
Способы получения акриламида из акрилонитрила с помощью нитрилгидратазы известны и описаны, например, в ЕР-А-307926 и в Appl. Microbiol. Biotechnol, 1993, 40, pp.189-195. В этой последней статье показано, что нитрилгидратазу можно получить из (наряду с другими) R.rhodochrous J1. В ЕР-А-188316 раскрыто превращение акрилонитрила в акриламид с использованием нитрилгидратазы. Одну нитрилгидратазу получают из Rhodococcus sp.S-6. В WO 95/04828 раскрыты нитрилгидратазы, одна из которых, из Comamonas NI1, проиллюстрирована как превращающая акрилонитрил в акриламид. Такие способы в применении к получению аммонийакрилата должны включать две стадии, а именно получение на первой стадии акриламида и его гидролиз до акриловой кислоты на второй стадии. Использование двухстадийного процесса обычно приводит к образованию двух типов примесей. Это непрореагировавший на первой стадии исходный материал и непрореагировавший продукт первой стадии, который является исходным материалом для второй стадии.
Дальнейшее превращение нитрила в соответствующую кислоту описано в патенте Великобритании 1475540. Такое превращение осуществляют для различных нитрилов, которые включают акрилонитрил, с помощью конкретных штаммов бактерий. Такими служат бактерии рода Bacillus, Bacteridium, Micrococcus или Brevibacterium. Приведены примеры превращений лактонитрила, глицинонитрила, аминопропионитрилгидрохлорида, амино-3-про-пионитрила и α-амино-γ-метилтиобутиронитрила. Авторы считают, что микроорганизмы осуществляют гидролиз за счет продуцирования фермента нитрилгидратазы, которая превращает нитрил в амид, и фермента амидазы, который затем превращает амид в кислоту.
Выло бы желательно получать аммонийакрилат ферментативным, удобным для промышленности способом в одну стадию из акрилонитрилов, используя акрилонитрилазу.
Способы превращения акрилонитрила в аммонийакрилат с использованием нитрилазы были описаны в литературе, например, в ЕР-А-187680, JP-B-63-2596 и в Appl.Microbiol.Biotech-nol., 1990, 34, pp.322-324, где используют нитрилазу, полученную из R. rhodochrous J1 (те же самые микроорганизмы, что описаны в ЕР-А-307926 выше), и в ЕР-А-444640, где также описана нитрилаза из.R.rhodochrous J1, как наиболее предпочтительная.
Использование R. rhodochrous K22 описано в J.Bacteriol., 172, 9, pp. 4807-4815 для способа превращения акрилонитрила в аммонийакрилат.
Нитрилаза из Fusarium oxysporum f.sp. melonis демонстрирует эффективность для вплоть до 60 мМ акрилонитрила для получения акриловой кислоты, см: Biotech.Appl.Biochem., 1989, 11, pp.581-601.
Stevenson et al. в Biotech. and Appl.Biochem., 15, 283-302 (1992) раскрывают исследования на нитрилазе, полученной из Rhodococcus ATCC 39 484. Этот фермент наиболее эффективен для гидролиза ароматических нитрилов и малоактивен либо вовсе не активен для многих алифатических нитрилов, таких как акрилонитрилы. Считают, что для этого фермента оптимальной является величина рН 7,5; он полностью инактивируется вне интервала значений рН 5,0-9,0 и необратимо инактивируется в результате предварительного инкубирования при температуре выше 40oС. Этот фермент также активируется в присутствии субстратов, в частности бензонитрила. Авторы статьи считают, что это связано с агрегацией субъединиц.
К сожалению, ни один из известных способов, в которых используют нитрилазу, коммерчески неудовлетворителен. Так например, способ, раскрытый в Appl. Microbiol. Biotechnol. , 34, 1990, pp.322-324, демонстрирует, что R. rhodochrous Jl требует рН 7,8 для оптимальной активности, претерпевает незначительную инактивацию при температуре в интервале 30-50oС и почти полностью дезактивируется при 60oС, и ингибируется концентрациями акрилонитрила выше 200 мМ, а также ингибируется продуктом (аммонийакрилатом), который образуется. Существует некоторое несоответствие данных в том, что в этой статье указано Km значение для нитрилазы, полученной за счет микроорганизма в отношении к акрилонитрилу, или его Ki значение в отношении к аммонийакрилату, но Km величина для R. rhodochrous K22, как сообщается в J.Bacteriol. ранее, соответствует 1,14 мМ. Величина 17 мМ сообщалась для акрилонитрилазы в Biotech. Appl.Biochem., 1989, 11, pp.581-601, и около 4-6% акриламида, как сообщалось, образуется во время реакции.
Было бы желательно получать аммонийакрилат с хорошим выходом при высокой концентрации в экономном процессе. Было бы желательно получить микроорганизмы и ферменты, которые позволили бы осуществить это.
Была найдена нитрилаза с необычной и весьма желательной активностью. Поэтому эту нитрилазу можно использовать для катализа реакции превращения акрилонитрила в аммонийакрилат, либо в форме целой клетки, либо в форме экстрагированного фермента. Ее можно также использовать для катализа аналогичных реакций других нитрилов, например адипонитрила.
Новая нитрилаза характеризуется тем, что имеет Km для акрилонитрила ниже 500 мкМ. Во всем описании Km относится к Km, измеренному при рН 7,0. Km определяют в условиях, в которых фермент демонстрирует кинетику Michaelis-Menten. В частности, используют условия примера 6 (см. далее). Предпочтительная нитрилаза, на которой авторы проводили начальные эксперименты, имела Km для акрилонитрила 30,6 мкМ в форме целой клетки, и предполагалось, что использование стандартных методик и выбранных процедур, например, описанных для амидазы Silman et al. (1989), J.Gen.Microbiol., 135, 3153-3164 и описанных для лактатдегидрогеназы Wagner (1990) Tibtech., 8, 263-270, приведет к получению нитрилазы с величиной Km вплоть до 60 или 100, или возможно 300 мкМ, и величиной Km менее 9,4 и даже 3,8 мкМ.
Основное преимущество новой нитрилазы с Km ниже 500 мкМ состоит в том, что поэтому она может быть эффективной при очень низких уровнях нитрильного субстрата. Удобно осуществлять фермент-катализуемые реакции, используя концентрации субстрата, которые примерно в 10 раз превышают Km. Так, используя новую нитрилазу настоящего изооретения, оказывается возможным осуществлять превращение акрилонитрила в аммонийакрилат, используя концентрации акрилонитрила 500 мкМ или ниже, даже столь низкие, как 300 мкМ, часто от 40 до 100 мкМ. Это выгодно, так как обеспечивает непрерывное получение аммонийакрилата способом, в котором уровни акрилонитрила составляют 300 част. на млн или менее, в реакторе, и соответственно в аммонийакрилатном продукте. Новую нитрилазу настоящего изобретения можно также использовать в способах, в которых концентрация акрилонитрильного субстрата превышает 300 част. на млн, а также при способах с однократной и ступенчатой загрузкой.
Дальнейшим преимуществом низких значений Km фермента настоящего изобретения является прекрасная способность удаления фермента. Так как нитрилаза активна при очень низких концентрациях акрилонитрила, она может удалять очень малые количества остаточного акрилонитрила из, например, продукта - аммонийакрилата, содержащего остаточный акрилонитрил.
К преимуществам относится также способность работать при очень низких уровнях нитрила, так как акрилонитрил и другие нитрилы обладают тенденцией дезактивировать нитрилазы в случае их высоких концентраций. Известные ферменты с более высокими Km до сих пор были ограничены, так как они требовали определенного минимального уровня нитрила для эффективной активности, но эти уровни столь высоки, что приводят к дезактивации. Нитрилаза настоящего изобретения способна эффективно продуцировать аммонийакрилат или другую соль при концентрациях акрилонитрила или другого нитрила, которые достаточно низки, чтобы избежать значительной дезактивации фермента.
Новая нитрилаза настоящего изобретения отличается тем, что имеет Ki для аммонийакрилата по крайней мере 100 мМ, предпочтительно по крайней мере 150 или 200, более предпочтительно по крайней мере 250 мМ. Во всем рассматриваемом описании Ki относится к Ki, определенном при рН 7,0. Фермент демонстрирует кинетику Michaelis-Menten в условиях измерения. Предпочтительно проводить измерения в условиях, представленных в примере 7 далее. Предпочтительная нитрилаза, на которой проводили начальные эксперименты, имела Ki для аммонийакрилата, которую оценили как 309 мМ. Предусмотрено, что стандартные методики и процедуры отбора, например мутагенез, приведут к получению нитрилазы с Ki для аммонийакрилата вплоть до 300 мМ или даже 800 мМ или больше.
Высокое значение Ki нитрилазы настоящего изобретения выгодно, так как оно позволяет ферменту катализировать реакции акрилонитрила, которые приведут к высоким концентрациям аммонийакрилата (10% вес/об. или более, например от 30 до 40%). В таких реакциях степень ингибирования действия фермента продуктом низка.
Новая нитрилаза настоящего изобретения отличается тем, что имеет отношение (Кi для аммонийакрилата)/(Km для акрилонитрила) по крайней мере 200. Предпочтительно, чтобы отношение составляло по крайней мере 300, более предпочтительно по крайней мере 500 и особенно по крайней мере 1000. Нитрилаза настоящего изобретения может иметь отношение Ki/Km по крайней мере 5000, даже 9000 или больше, а нитрилаза, на которой проводили начальные эксперименты, имела величину этого отношения более чем 10000.
Преимущество высоких значений указанного отношения состоит в том, что нитрилаза способна катализировать гидролиз при очень низких уровнях нитрила, такого как акрилонитрил, в условиях, в которых существует высокая концентрация соответствующей соли, например аммонийакрилата.
Новая нитрилаза отличается тем, что при значении рН 6,8 имеет специфическую акрилонитрилазную активность, которая составляет по крайней мере 80% и предпочтительно по крайней мере 95% от ее активности при оптимальном значении рН. Оптимальным является такое значение рН, при котором нитрилаза демонстрирует максимальную специфическую акрилонитрилазную активность. Обычно ее оптимальное значение рН находится в интервале 6,5-7, часто около 6,8, и, таким образом, эта нитрилаза обладает тем преимуществом, что ее оптимальная активность соответствует естественному рН аммонийакрилата. Соответственно, отпадает необходимость в буферировании и постоянном контроле и регулировке.
Новая нитрилаза настоящего изобретения отличается тем, что характеризуется повышенной термостабильностью: при 50oС она сохраняет по крайней мере 80% своей акрилонитрилазной активности, определенной при 25oС. Активность определяют, инкубируя клетки в воде при нужной температуре в течение 5 минут, а затем добавляя акрилонитрил при концентрации 50 мМ и регистрируя превращение аммонийакрилата в течение 15 минут. Предпочтительно нитрилаза также сохраняет при 55 и при 60oС по крайней мере 80% своей акрилонитрилазной активности, определенной при 25oC. Активность при 50, 55 и 60oС может быть даже выше, нежели активность при 25oС, например по крайней мере 100%, или даже 200%, или 300% от активности при 25oС.
Новая нитрилаза настоящего изобретения сохраняет по крайней мере 80% своей исходной специфической акрилонитрилазной активности после иммобилизации в шариках сшитого полиакриламида.
Пасту, состоящую из клеток, содержащих нитрилазу, суспендируют в охлажденном буфере и добавляют к смеси акриламидного мономера и метиленбисакриламидного сшивающего агента в охлажденном буфере. Немедленно добавляют водорастворимую компоненту окислительно-восстановительной инициаторной системы. Затем полученную смесь переносят в пластиковый реактор с перемешиванием, содержащий охлажденное минеральное масло и поверхностно-активный агент, и вторую компоненту инициатора окисления-восстановления, растворимую в обоих жидких фазах, добавляют для инициирования полимеризации. После полимеризации клетки оказываются заключенными в шарики из сшитого полимера. Предпочтительно, чтобы нитрилаза была иммобилизована в шариках сшитого полиакриламида в этих условиях, сохраняла по крайней мере 90%, предпочтительно по крайней мере 95%, более предпочтительно практически всю свою акрилонитрилазную специфическую активность в иммобилизованном состоянии, после высушивания до 12% влажности при 60oС и/или при сушке вымораживанием при 0,1 мбар в течение 24 часов. Под "специфической активностью в иммобилизованном состоянии" подразумевают специфическую активность фермента, которую он демонстрирует после иммобилизации в шариках сшитого полиакриламида. Предпочтительно также, чтобы специфическая акрилонитрилазная активность нитрилазы, иммобилизованной в шариках сшитого полиакриламида и необязательно высушенной и хранившейся при 20oС в течение 17 дней, составляла по крайней мере 90%, предпочтительно по крайней мере 95%, более предпочтительно практически всю специфическую активность в иммобилизованном виде.
Таким образом, нитрилаза этого аспекта изобретения оказывается химически и физически высокостабильной. Это делает ее чрезвычайно подходящей для включения в шарики полимерного материала. Известен способ иммобилизации фермента в виде целых клеток в шариках сшитого полимерного материала, в частности полиакриламида, для того, чтобы получить его в удобной для использования форме. Нитрилаза настоящего изобретения не денатурируется (то есть не претерпевает значительного снижения специфической активности) при включении в такую форму. Более того, после включения нитрилазы в шарики сшитого полиакриламида предпочтительно активность фермента в этих шариках заметно не снижается в процессе сушки или хранения этих шариков.
Новая нитрилаза настоящего изобретения отличается тем, что имеет время полураспада, определенное в водном растворе, содержащем 125-175 мМ акрилонитрила и 2,475-2,525 мМ аммонийакрилата, в течение по крайней мере 5 дней, предпочтительно по крайней мере 7 дней, более предпочтительно по крайней мере 7,5 дней. Точное содержание акрилонитрила и аммонийакрилата может меняться во время проведения теста, но оно всегда сохраняется в указанных пределах концентраций. Акрилонитрил за счет нитрилазы постепенно превращается в аммонийакрилат, и, таким образом, концентрация акрилонитрила прогрессивно уменьшается. Когда концентрация достигает нижнего предела в 125 мМ, добавляют дополнительный акрилонитрил для повышения концентрации до верхнего предела в 175 мМ. Аналогично, количества аммонийакрилата могут меняться в заданных пределах, но концентрацию аммонийакрилата необходимо регулировать, чтобы предотвратить превышение специфического максимума концентрации в 2525 мМ. Конкретный микроорганизм, на котором проводились предварительные эксперименты, продуцировал нитрилазу со сроком полураспада в этих условиях 7,6 дней, и авторы считают, что можно получить фермент со сроком полураспада по крайней мере 10-15 дней.
Столь выгодный срок полураспада показывает, что нитрилаза настоящего изобретения обладает высокой стабильностью в отношении денатурирования как субстратом, так и продуктом (акрилонитрил и аммонийакрилат), особенно высокими концентрациями продукта.
Длительный период полураспада фермента акрилонитрилазы этого аспекта изобретения особенно выгоден для длительного коммерческого использования. Порцию фермента можно добавлять в реактор и оставлять там на несколько дней, например на 10 дней или более, или даже вплоть до 20 или 30 дней, без необходимости добавлять дополнительно фермент в реактор для замены денатурированного фермента.
Нитрилазы настоящего изобретения предпочтительно обладают свойством увеличения их специфической активности при экспонировании акрилонитрилу и/или аммонийакрилату. Предпочтительно они демонстрируют возрастание специфической активности по крайней мере в 1,7 раза, предпочтительно по крайней мере в 2-3 раза и обычно не более чем в 10 раз после инкубирования в течение 1-3 часов в присутствии 4-175 мМ водного акрилонитрила и/или 1,2-2,5 М водного аммонийакрилата. Точное содержание акрилонитрила и аммонийакрилата может меняться во время теста, но его всегда поддерживают в указанных пределах концентраций. Акрилонитрил превращается за счет нитрилазы в аммонийакрилат, и концентрация акрилонитрила при этом постепенно снижается. Когда концентрация достигает нижнего предела 125 мМ, добавляют дополнительно акрилонитрил для того, чтобы повысить концентрацию до верхнего предела 175 мМ. Аналогично, количествам аммонийакрилата позволяют меняться в указанных пределах, регулируя концентрацию аммонийакрилата, во избежание превышения концентрацией указанного ранее максимума - 2525 мМ.
Таким образом, улучшенные нитрилазы этого типа обладают таким важным преимуществом, что они повышают активность при экспонировании реакционной среды, в которой их используют.
Хотя в настоящем изобретении предложены новые нитрилазы, обладающие любым из обсуждавшихся ранее свойств, предпочтительно, чтобы нитрилаза настоящего изобретения обладала более чем одним из указанных свойств. В частности, предпочтительно, чтобы нитрилаза настоящего изобретения имела Km для акрилонитрила ниже 500 мкМ, более предпочтительно, чтобы и Ki для аммонийакрилата составляло по крайней мере 100 мМ.
Наиболее предпочтительно, чтобы величина отношения (Ki для аммонийакрилата)/(Km для акрилонитрила) для нитрилазы составляла по крайней мере 200.
Более предпочтительно, чтобы акрилонитрилаза настоящего изобретения имела в дополнение к таким Km, Ki и Km/Ki характеристикам по крайней мере два из других указанных ранее свойств, и более предпочтительно, чтобы она обладала всеми этими свойствами.
Авторы выделили новый микроорганизм, штамм R.rhodochrous, который способен продуцировать нитрилазу, которая обладает всеми перечисленными свойствами. Этот микроорганизм был депонирован в NCIMB 8 августа 1995 г. в соответствии с условиями Будапештского Соглашения под регистрационным номером NCIMB 40757. Авторы также недавно депонировали 11 декабря 1996 г. штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40833. Он также обладает всеми перечисленными свойствами, и его обозначают далее как "недавно депонированный штамм".
Соответственно, в дальнейшем аспекте изобретения предложен микроорганизм Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757 или недавно депонированный NCIMB 40833, или мутанты любого из них, способные продуцировать нитрилазу.
В настоящем изобретении предложен также новый фермент нитрилаза, полученный при культивировании Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757 или недавно депонированного штамма NCIMB 40833.
В результате анализов штамма, депонированного под NCIMB 40757, получены следующие результаты.
Диаминокислота клеточных стенок представляет мезоDAP. Профиль жирных кислот представляет следующие кислоты в указанном количестве (%):
Тетрадекановая - 2,1
Пентадекановая - 2,8
Гексадеценовая - 24,7
Гексадекановая - 25,9
Гептадеценовая - 6,2
Гептадекановая - 3,1
Октадеценовая - 25,0
Октадекановая - 1,9
Туберкулостеариновая - 7,0
Биохимическое тестирование дало следующие результаты:
Разложение:
Аденина - -
Тирозина - +
Мочевины - -
Рост в присутствии:
5% NaCl - +
Азида декстрозы - (+)
Рост на одном из источников углерода:
Инозит - (+)
Мальтоза - +
Маннит - +
Рамноза - -
Сорбит - +
м-Гидроксибензойная кислота - +
Адипат натрия - +
Бензоат натрия - +
Цитрат натрия - +
Лактат натрия - +
Глутамат натрия - -
L-тирозин - +
Глицерин - +
Трегалоза - +
п-Гидроксибензойная кислота - +
D-манноза - +
Ацетамид - +
D-галактоза - (+)
(+) слабый позитив
Ферментативные тесты: Rosco discs, 4 часа, 37oС
α-глюкозидаза - -
Цистеинариламидаза - -
Валинариламидаза - -
Нитрилазу, полученную из R.rhodochrous NCIMB 40757 и NCIMB 40833, и все нитрилазы настоящего изобретения можно использовать в процессе превращения нитрила в соответствующую аммонийную соль. Так, в соответствии со следующим аспектом изобретения предложен способ превращения нитрила в водном растворе в соответствующую аммонийную соль в присутствии катализатора гидролиза - нитрилазы настоящего изобретения, предпочтительно нитрилазы, полученной при культивировании R.rhodochrous NCIMB 40757 или NCIMB 40833.
Предпочтительным нитрилом является акрилонитрил, и поэтому соответствующей аммонийной солью является аммонийакрилат, и способ будет обсуждаться далее с точки зрения акрилонитрила и аммонийакрилата. Таким же способом можно превращать другие нитрилы, например адипонитрил, метакрилонитрил, α-аминонитрилы, ацетонитрилы, н-бутиронитрил, изо-бутиронитрил, н-валеронитрил, бензонитрил, цианопиридин, малононитрил, сукцинонитрил, фумаронитрил, хлорацетонитрил и β-гидроксипропионитрил.
Различные уникальные свойства нитрилаз настоящего изобретения позволяют осуществлять способы, в которых непрерывно низкую концентрацию акрилонитрила превращают в непрерывно высокую концентрацию аммонийакрилата.
Так, по способу настоящего изобретения можно превратить водный раствор акрилонитрила при 3,0 мМ или ниже, часто 2,0 мМ или ниже и даже 1,5 мМ или ниже в водный аммонийакрилат при концентрации по крайней мере 5%, часто по крайней мере 8 или 10%. Возможно также превратить водный раствор акрилонитрила при концентрации 3,0 мМ до 6,0 мМ, часто от 4,0 до 5,0 мМ, в водный аммонийакрилат при концентрации по крайней мере 20%, часто по крайней мере 25 или 30% и даже вплоть до 40% или более. Обычно максимальная концентрация аммонийакрилата составляет около 48-50% (вес/объем).
Способы настоящего изобретения обычно осуществляют при температуре от 5 до 70oС, предпочтительно от 20 до 60oС. Величина рН обычно составляет от 3 до 9,5, предпочтительно от 5 до 9, более предпочтительно от 6 до 8.
Если происходят указанные превращения, способ настоящего изобретения можно осуществлять как непрерывный процесс. То есть акрилонитрил непрерывно подается в реактор для поддержания стабильной концентрации акрилонитрила, и реакционный раствор, содержащий стабильную концентрацию аммонийакрилата, непрерывно отводят.
Вода также необходима в качестве реагента. Вода может присутствовать в полном количестве, необходимом с самого начала реакции. В другом варианте ее можно подавать в реактор во время реакции. Так например, акрилонитрил может поступать в виде раствора, обычно в виде насыщенного раствора, т.е. около 7% вес/вес. В другим варианте воду можно подавать отдельно, и акрилонитрил подавать в чистом виде или в виде раствора.
Непрерывные реакции такого типа можно осуществлять, например, в реакторе типа бака при непрерывном перемешивании, в реакторе с псевдоожиженным слоем, в реакторе с насадкой, в проточном реакторе или в реакторе с подачей потока с помощью поршня.
Способы в вышеуказанных условиях можно также осуществлять как процесс со ступенчатой загрузкой. В таком процессе концентрации акрилонитрила дают возможность снизиться в результате превращения в аммонийакрилат до тех пор, пока она не достигнет заранее определенного минимального уровня. В это время к реакционной смеси добавляют еще акрилонитрил для повышения концентрации до заранее определенного максимального уровня. Затем концентрация акрилонитрила снова снижается до заранее определенного минимального уровня, реакционную смесь охлаждают, и в реактор с ферментом добавляют новую порцию акрилонитрила. Как и в случае непрерывного процесса, воду можно добавлять в реактор во время реакции, при необходимости.
В другом варианте нитрилазы настоящего изобретения можно использовать для катализа превращения акрилонитрила в аммонийакрилат порционным способом. То есть в качестве исходного материала используют относительно высокую концентрацию акрилонитрила. Акрилонитрилазе дают возможность превращать этот акрилонитрил в аммонийакрилат без дополнительного добавления исходного материала. Когда конверсия акрилонитрила прекращается, реакционную смесь собирают и используют новую реакционную смесь.
Однако предпочтительными способами настоящего изобретения являются непрерывный способ или способ с порционной подачей сырья. Особенно предпочтительные способы описаны в находящейся на одновременном рассмотрении международной заявке, поданной сегодня (ссылка PRL03626WO), заявляющей приоритет по GB 9525374,6 и GB 9525372,0.
Такие способы включают получение водного раствора, содержащего по крайней мере 30 вес.% (мет)акриловой кислоты или ее соли и ниже 0,2% (мет)акрилонитрила, включая необходимую воду, и (мет)акрилонитрил в количестве, достаточном для обеспечения, после гидролиза, концентрации (мет)акриловой кислоты или ее соли по крайней мере 30 вес.%, и обеспечивающий во время процесса в контакте с (мет)акрилонитрилом фермент, который превращает (мет)акрилонитрил в аммоний(мет)акрилат и который имеет Km для (мет)акрилонитрила менее 500 мкМ и Ki для аммоний(мет)акрилата выше 100000 мкМ, что обеспечивает протекание гидролиза (мет)акрилонитрила до тех пор, пока концентрация (мет)акрилонитрила в растворе не снижается ниже 0,2%, а концентрация аммоний(мет)акрилата не превышает 30%, и выделение раствора с содержанием аммоний(мет)акрилата выше 30%, а акрилонитрила ниже 0,2%. В этих процессах (мет)акрилонитрил может подвергаться химическому гидролизу для получения раствора, содержащего аммоний(мет)акрилат и акрилонитрил, а полученный раствор затем контактируют с указанным ферментом, и гидролизу (мет)акрилонитрила дают протекать до тех пор, пока концентрация реакционного раствора по (мет)акрилонитрилу не спускается ниже 0,2%. В другом варианте практически весь гидролиз (мет)акрилонитрила может быть осуществлен ферментативно с помощью указанного фермента.
Эти способы можно осуществлять как в виде одностадийных, так и двухстадийных процессов. Одностадийный процесс включает получение водного раствора, содержащего по крайней мере 30 вес. % аммоний(мет)акрилата и ниже 0,1% (мет)акрилонитрила, способом, который включает загрузку в реактор во время процесса фермента для превращения (мет)акрилонитрила в аммоний(мет)акрилат, у которого Km для (мет)акрилонитрила ниже 500 мкМ, a Ki для аммоний(мет)акрилата выше 100 мМ, и с водой и с (мет)акрилонитрилом в количестве, достаточном для получения после гидролиза концентрации аммоний(мет)акрилата по крайней мере 30 вес.%, и предоставление возможности гидролизу протекать в реакторе до тех пор, пока раствор в реакторе характеризуется концентрацией (мет)акрилонитрила ниже 0,2% и концентрацией аммоний(мет)акрилата выше 30%, и удаление этого раствора из реактора.
В этом предпочтительном способе конечная концентрация (мет)акрилонитрила, вероятно, ниже 0,1%, более предпочтительно ниже 0,05%. Предпочтительно, чтобы она была ниже 0,03%, более предпочтительно ниже 0,02 или 0,01%.
Конечная концентрация аммоний(мет)акрилата составляет по крайней мере 30 вес. %, часто по крайней мере 35 вес.%, предпочтительно по крайней мере 40 или 45 вес.%. Максимальная концентрация аммоний(мет)акрилата обычно составляет от 48 до 50 вес. %, так как в случае превышения этих пределов аммоний(мет)акрилат приобретает тенденцию осаждаться из раствора.
В предпочтительном способе фермент включен в реакционную смесь так, чтобы обеспечить нужную активность в реакторе. Обычно форма катализатора, который добавляют в реактор, характеризуется активностью от 50 до 100000 нитрилазных единиц на грамм, обычно от 500 до 5000 нитрилазных единиц на грамм, причем одна нитрилазная единица определяется как величина, с помощью которой акрилонитрил превращается в аммонийакрилат со скоростью 1 мкмоль/мин при 30oС, рН 7,0 и 50 мМ акрилонитрила в 50 мМ фосфатном буфере. Катализатор может быть в форме бактериальных клеток или, чаще, иммобилизован в матрице полимерного геля. Катализатор, обладающий определенной активностью, помещают в реактор в количестве от около 1 до 50 вес.% в расчете на вес реакционной смеси.
Наиболее предпочтительно, чтобы фермент был добавлен в реакционную смесь в таком количестве, чтобы обеспечить активность от 3000 до 5000 нитрилазных единиц на литр реакционной смеси.
В предпочтительном способе полное количество необходимого фермента обычно загружают в реактор в начале реакции, то есть перед добавлением (мет)акрилонитрильного реагента. Однако можно также осуществлять предпочтительный способ, добавляя фермент во время реакции либо непрерывно, либо периодически.
Аналогично, воду, которая также является реагентом так же, как и растворителем, можно подавать в реактор в полном объеме в начале реакции. В другом варианте ее можно подавать в реактор непрерывно во время реакции таким же образом и, возможно, вместе с (мет)акриловым реагентом.
Реакцию ведут в водном растворе. Обычно единственными компонентами водного раствора являются вода, фермент (включая бактериальные клетки, полимерную матрицу и т.д.), (мет)акрилонитрил и аммоний(мет)акрилат.
В другом варианте способ настоящего изобретения может быть способом очистки полимера, полученного из мономерной смеси, включающей акрилонитрильный мономер, и который содержит непрореагировавший акрилонитрильный мономер, за счет превращения непрореагировавшего акрилонитрильного мономера в аммонийакрилат в присутствии акрилонитрилазы - катализатора настоящего изобретения. Это можно осуществить в условиях, в которых содержание акрилонитрильного мономера можно понизить до уровней ниже 1000 част. на млн, часто ниже 500 част. на млн, предпочтительно ниже 300 или даже 100 част. на млн, в расчете на вес полимера.
Способ настоящего изобретения может быть способом очистки мономера, содержащего остаточный акрилонитрил, если, например, мономер получен любым способом, например химическим гидролизом акрилонитрила. В таких способах исходный уровень акриламидов может быть вплоть до 5%, но обычно бывает ниже 2%, например от 0,5 до 1%.
В способе настоящего изобретения и в любых других способах, в которых используют нитрилазу, ее можно использовать в любой удобной форме, например в чистом виде, экстрагированную из культивируемого микроорганизма перед использованием в качестве катализатора. Способ экстракции следует использовать такой, который обеспечил бы сохранение активности и стабильности фермента.
Его можно также использовать в полуочищенном виде, например в виде жидкой культуры или в виде такой фракции бактериальных клеток, как интактные клетки или разрушенные клетки. Его можно использовать в форме неочищенного ферментного раствора. Его можно наносить или иммобилизовать на таком носителе, как сшитая полимерная матрица, например сшитый поливиниловый спирт или сшитый полиакридамид. Его можно использовать в форме ненабухающих частиц со связанным на их поверхности ферментом. Предпочтительно использовать его в виде интактных бактериальных клеток или нанесенным на матрицу сшитого полимера.
Авторами было обнаружено, что для проведения реакции типа периодических загрузок, в частности, выгодно использовать фермент в чистом виде или в полуочищенном виде, например в виде свободных клеток. Использование фермента в таком виде позволяет избежать необходимости иммобилизовать клетки на носителе, но, как было обнаружено, не приводит к уменьшению стабильности при хранении или в реакционной смеси в сколько-нибудь значительной степени.
Для процессов непрерывного типа предпочтительно использовать фермент в иммобилизованном виде, так как это обеспечивает более длительную стабильность в используемом реакторе. В частности, было обнаружено, что в некоторых случаях фермент в иммобилизованном виде является столь же стабильным в реакционной смеси, что и при хранении. При этом также облегчается удаление катализатора из конечного продукта.
Если фермент был иммобилизован, в частности, в виде полимерных шариков, было обнаружено, что получение полимерных шариков большего размера повышает стабильность фермента в процессе полимеризации. В частности, предпочтительны шарики, размер которых больше чем 850 мкм, предпочтительно более 1 мм.
Полимерную матрицу можно получить любым способом, например в виде шариков или суспензионной полимеризацией. Может оказаться полезным добавлять к мономерной смеси повышающий вязкость агент.
Было обнаружено, что стабильность фермента в процессе наивысшая при низком содержании клеток, т.е. вес.% сухих клеток в расчете на вес полимерной матрицы, в частности, ниже 5%, предпочтительно ниже 1%, например около 0,5 вес.%. Однако стабильности можно также достичь, используя низкую температуру полимеризации, например ниже 30 или 20oС, часто ниже 15oС. Такую температуру можно использовать в сочетании с большей дозой клеток, например по крайней мере 4%, предпочтительно по крайней мере 5 вес.%, например около 6,5 или 6,8 вес.%.
Преимущество нитрилаз настоящего изобретения, в частности нитрилазы, полученной из R.rhodochrous NCIMB 40757 и недавно депонированного штамма NCIMB 40833, состоит в их способности превращать низкие концентрации акрилонитрила, например ниже 18,86 мМ (1000 част. на млн), до высоких концентраций аммонийакрилата, например 30, 40% или более. Это означает, что непрерывный или процесс со ступенчатой загрузкой можно вести для получения продукта с высокой концентрацией аммонийакрилата и концентрацией акрилонитрила значительно ниже вышеуказанного уровня (1000 част. на млн), что необходимо с точки зрения токсичности. Таким образом, нетоксичный продукт - аммонийакрилат - можно получать непосредственно, без необходимости дополнительной обработки. Аналогично, можно получать акрилонитрилсодержащий полимер и превращать его в нетоксичный продукт.
Однако в способе настоящего изобретения можно использовать нитрилазу для превращения акрилонитрила в аммонийакрилат для получения продукта с концентрацией акрилонитрила большей, нежели 1000 част. на млн, который можно в дальнейшем обработать для снижения уровня содержания акрилонитрила.
Было обнаружено, что аммонийакрилатный мономер, полученный по способу настоящего изобретения (биоаммонийакрилат), обладает превосходными свойствами, эквивалентными или превосходящими свойства мономеров, полученных альтернативными химическими способами, например из акриловой кислоты, полученной из пропиленоксида. Полимеры, получаемые из мономеров, полученных по способу настоящего изобретения, также обладают превосходными характеристиками. Биоаммонийакрилат, полученный по способу настоящего изобретения, можно превратить в другую химическую форму, например в акриловую кислоту или ее натриевую соль, или соль другого щелочного металла, или в другой родственный акриловый мономер, и использовать в качестве исходного мономера для получения акриловых полимеров. В другом варианте его можно использовать без превращения как аммонийакрилат. Его можно использовать для получения гомополимеров или в сочетании с другими мономерами для получения сополимеров.
Авторы обнаружили, что новые нитрилазы настоящего изобретения могут служить биосенсорами для определения нитрила, в частности акрилонитрила.
Так, в соответствии со способом настоящего изобретения можно определять нитрил за счет:
(a) осуществления контакта нитрила с нитрилазой по способу настоящего изобретения, причем контактирование осуществляют в водной среде
(b) предоставления возможности превращения нитрила в его соответствующую аммонийную соль, и
(c) определения изменения, которое связано с превращением нитрила.
Таким изменением может быть, например, изменение проводимости водной среды. Нитрилы являются неионными соединениями, и поэтому их присутствие нельзя определить, измеряя проводимость. Если они превращаются в ионные соединения, т. е. аммонийные соли, возникающее изменение проводимости можно измерить. В другом варианте изменение концентращии аммонийных ионов можно определить или для определения такого изменения можно использовать систему связанных ферментов.
Биосенсор можно сконструировать любым способом, обычным для сенсоров этого типа. Так, например, можно нанести на электрод нитрилазу.
Фермент в биосенсоре может находиться в водной среде, например в водной жидкости или в содержащем воду геле. В другом варианте нитрил, подлежащий детектированию, может находиться в водной среде. Просто необходимо, чтобы вода присутствовала при контактировании нитрила и нитрилазы с тем, чтобы обеспечить возможность осуществления гидролиза. Нитрил в виде паров можно определять, используя способ настоящего изобретения.
Нитрилазы настоящего изобретения особенно полезны в нитрилазных биосенсорах благодаря, в частности, способности демонстрировать практически линейную реакцию на чрезвычайно низкие концентрации нитрила.
Обычно фермент используют в очищенной, экстрагированной форме. Однако фермент можно использовать в виде целых клеток или в виде фракции бактериальных клеток.
Этот способ можно использовать для детектирования нитрила в любом окружении, например в полимере, который потенциально содержит непрореагировавший акрилонитрильный мономер, в сточных жидкостях, загрязненных нитрилами в скрубберах, и даже в контакте с содержащими акрилонитрил парами. Нитрилазы настоящего изобретения можно также использовать для очистки таких отходов.
Нитрилазы настоящего изобретения можно использовать также для удаления нитрила из паров, например скрубберных паров, в которых нитрил может присутствовать в очень малых количествах. Он может присутствовать в количестве вплоть до 0,3 кг/м3, часто ниже 0,2 кг/м3, например от 0,05 до 0,1 кг/м3. В таком способе нитрилсодержащие пары контактируют с нитрилазой и превращаются в соответствующие аммонийные соли, так что содержание нитрила снижается до величины ниже 5 мг/м3 или даже ниже 2 мг/м3 (2 части на млн). Такое контактирование обычно осуществляют в водной среде, например в водной жидкости, или в содержащем воду геле, или просто используя увлажненный фермент.
Этот способ настоящего изобретения особенно подходит для определения очень низких уровней нитрила на линии уровней, которые нельзя определить другими способами. В способе настоящего изобретения нитрилаза может быть нитрилазой, полученной по способу настоящего изобретения, но предпочтительно, чтобы у этой нитрилазы Km для нитрила составляло 500 мкМ или ниже, предпочтительно 100 мкМ или ниже, более предпочтительно 50 мкМ или ниже. Наиболее предпочтительно, чтобы эта нитрилаза была получена при культивировании R.rhoctochrous NCIMB 40757 или недавно депонированного штамма NCIMB 40833.
Далее приводятся несколько примеров настоящего изобретения.
Пример 1
Исходный изолят штамма Rhodococcus rhodochrous, депонированный в National Collection of Industrial and Marine Bacteria под регистрационным номером NCIMB 40757, содержащий нитрилазный фермент, или в котором нитрилазный фермент можно индуцировать, переносят в колбу Эрленмейера, содержащую жидкую культуральную среду, состав которой представлен в табл.1.
Содержимое колбы Эрленмейера инкубируют при перемешивании в течение 24 часов. Затем клетки выделяют из среды, снова суспендируют в 50 мМ рН 7 натрийфосфатного буфера, а затем выделяют из буфера. Часть клеток хранят замороженными при -20oС, а оставшееся снова суспендируют в 50 мМ при рН 7 натрийфосфатного буфера, содержащего 50 мМ акрилонитрила. Специфическую нитрилазную активность клеток определяют как 1060 мкмолей/минуту/г сухого веса клеток.
Аналогичные результаты получают, используя недавно депонированный штамм NCIMB 40833.
Пример 2
Клетки штамма Rhodococcus rhodochrous, выращенные, как указано в примере 1, иммобилизуют в шариках сшитого полиакриламида следующим образом: пасту, состоящую из клеток, выделенных из культуральной среды, суспендируют в охлажденном буфере и добавляют к смеси акриламидного мономера и метилбисакриламидного (МВА) сшивающего агента также в охлажденном буфере. Водорастворимую компоненту системы окислительно-восстановительного инициатора добавляют немедленно после этого. Затем смесь клетки/мономер/инициатор переносят в полимерный реактор с перемешиванием, содержащий охлажденное минеральное масло и поверхностно-активный агент, и вторую компоненту окислительно-восстановительного инициатора, растворимую в обоих жидких фазах, добавляют для инициирования полимеризации. После полимеризации клетки оказываются заключенными в шарики сшитого полимера.
Иммобилизованные таким образом клетки переносят в 50 мМ рН 7 натрийфосфатный буфер, содержащий 50 мМ акрилонитрила. Удельную нитрилазную активность клеток определяют как 845 мкмолей/минуту/г сухого веса клеток.
Пример 3
Клетки Rhodococcus rhodochrous, иммобилизованные в шариках сшитого полимера, как указано в примере 2, сушат в лабораторной сушилке с псевдоожиженным слоем при 60oС до 12% влажности. Затем половину высушенных шариков хранят в герметичном контейнере при комнатной температуре. Иммобилизованные клетки переносят в 50 мМ рН 7 натрийфосфатный буфер, содержащий 50 мМ акрилонитрила. Специфическую нитрилазную активность клеток определяют как 1038 мкмолей/минуту/г сухого веса клеток.
Пример 4
Клетки Rbodococcus rhodochrous, иммобилизованные в шариках сшитого полимера, как указано в примере 2, и высушенные в лабораторной сушилке с псевдоожиженным слоем, как указано в примере 3, переносят в сушилку с вымораживанием и хранят при 0,1 мбар в течение 24 часов. Эти шарики хранят в герметичном контейнере при комнатной температуре.
Пример 5
Клетки штамма Rhodococcus rhodochrous, выращенные, как указано в примере 1, суспендируют в чистой воде при 30oС. К суспензии клеток периодически добавляют акрилонитрил до повышения концентрации акрилонитрила до 190 мМ. Образцы отбирают перед каждым добавлением для определения концентрации акрилонитрила, акриламида и аммонийакрилата в клеточной суспензии. В табл.2 представлены начальная, максимальная и конечная специфическая нитрилазная активность, конечная концентрация аммонийакрилата и время, затраченное до достижения этой концентрации.
Для сравнения, в Appl.Microbiol.Biotechnol., Nagasawa et al., (1990) 238 мг сухих Rhodococcus rhodochrous Jl клеток инкубируют при 20oС в 50 мл 50 мМ калийфосфатного буфера (рН 7,8) и 200 мМ акрилонитрила. Их концентрации по акрилонитрилу поддерживают примерно при 200 мМ, периодически добавляя акрилонитрил. Оказывается необходимым поддерживать рН реакционной смеси при рH 7,8, добавляя 6 М КОН раствор. Табл.3 показывает начальную специфическую акрилонитрилазную активность, конечную концентрацию аммонийакрилата и время, необходимое для достижения этой концентрации.
Nagasawa et ai. (1990) заявляют "накопление (акриловой кислоты за счет R. rhodochrous J1) почти то же самое, даже при различных концентрациях добавляемых клеток. Поэтому ограничение накопления (акриловой кислоты за счет R.rhodochrous J1) можно приписать ингибированию продуктом, а не дезактивации фермента". Этот уровень ингибирования продуктом не представлен ферментом из NCIMB 40757.
Пример 6
Клетки штамма Rhodococcus rhodochrous, выращенные, как представлено в примере 1, суспендируют в растворах 50 мМ рН 7 натрийфосфатного буфера при 30oС, содержащего концентрации акрилонитрила, представленные в табл.4. Образцы отбирают через некоторое время для определения концентраций акрилонитрила, акриламида и аммонийакрилата в суспензиях клеток.
Из данных табл.4 можно определить Km нитрилазы этого штамма как 30,6 мкМ для акрилонитрила.
Для сравнения в табл.5 представлены Km для двух других нитрилаз, определенные в литературных ссылках.
Это показывает, что нитрилаза R.rhodochrous NCIMB 40757 обладает гораздо более высокой очищающей способностью, нежели описанные ранее штаммы.
Пример 7
Клетки штамма R. rhodochrous, выращенные по способу примера 1, суспендируют в растворах 1,2 М аммонийакрилата при 30oС, содержащих представленные в табл.6 концентрации акрилонитрила. Образцы отбирают через некоторое время для определения концентраций акрилонитрила, акриламида и аммонийакрилата в клеточных суспензиях.
Из приведенных в табл.6 результатов кажущийся Km нитрилазы этого штамма в 1,2 М аммонийакрилате определяют как 145 мкМ акрилонитрила. Из этого кажущегося значения Km величину Ki этого штамма определяют как 309 мМ аммонийакрилата. Это столь высокое значение показывает низкий уровень ингибирования продуктом, что наблюдается для R.rhodochrous NCIMB 40757 нитрилазы.
Это может бытъ в противоположность ингибированию продуктом, представленному J1 ферментом, что описано в примере 5 ранее.
Пример 8
Клетки штамма Rhodococcus rhodochrous, выращенные по способу примера 1, суспендируют в растворах 50 мМ рН 7 натрийфосфатного буфера при 30oС, содержащего концентрации акрилонитрила, представленные в табл.7. Образцы отбирают через некоторое время для определения концентраций акрилонитрила, акриламида и аммонийакрилата в клеточных суспензиях. Полученные результаты демонстрируют относительно низкие уровни разложения субстрата для R.rhodochrous NCIMB 40757 нитрилазы.
Для сравнения, Nagasawa et al. (1990) утверждает "Была исследована зависимость от концентрации акрилонитрила в реакционной смеси (Rhodococcus rhodochrous J1 клеток, суспендированных в 50 мМ калийфосфатном буфере (рН 7,8)) скорости образования акриловой кислоты (см. табл. 8). Скорость образования была наивысшей при 25-100 мМ акрилонитрила. Однако при концентрациях выше 200 мМ акрилонитрил вызывает заметное ингибирование. Поэтому концентрацию акрилонитрила в реакционной смеси следует поддерживать ниже 200 мМ". Результаты Nagasawa et al. представлены в табл.8.
Пример 9
Клетки штамма Rhodococcus rhodochrous, выращенные по способу примера 1, суспендируют в растворах 50 мМ буфера при 30oС, содержащего 50 мМ акрилонитрила и при значениях рН, представленных в табл.9. Образцы отбирают через некоторое время для определения концентраций акрилонитрила, акриламида и аммонийакрилата в клеточных суспензиях.
Из табл. 9 видно, что максимальная активность R.rhodochrous NCIMB 40757 нитрилазы находится в том же самом интервале значений рН 6-7, который приводит к образованию NH4 + акрилата, что устраняет необходимость в добавлении каустика, по сравнению с вариантом Nagasawa et al. (1990), который утверждал, что оптимум рН (R.rhodochrous J1 клеток, суспендированных в буфере) составляет 7,8.
Пример 10
Клетки штамма Rhodococcus rhodochrous, выращенные по способу примера 1, суспендируют в растворах 50 мМ рН 7 натрийфосфатного буфера при температурах, значения которых представлены в табл.10. Клетки инкубируют при указанных в таблице температурах в течение 5 минут перед добавлением акрилонитрила до достижения концентрации 50 мМ. Образцы отбирают через 15-30 минут для определения концентраций акрилонитрила, акриламида и аммонийакрилата в клеточной суспензии.
Оптимальная активность, по-видимому, достигается при 55oС, и высокая активность сохраняется даже при 60 и 65oС течение 15-30 минут.
Для сравнения, Nagasawa et al. (1990) указывает "исследования термостабильности (Rhodococcus rhodochrous Jl клеток, суспендированных в рН 7,8 50 мМ калиийфосфатном буфере) показывают, что активность стабильна вплоть до 30oС при небольшой инактивации между 30 и 50oС и почти полной дезактивации при 60oС".
Пример 11
a) Клетки Rhodococcus rhodochrous, заключенные в шарики сшитого полимера по способу примера 2,
b) клетки Rhodococcus rhodochrous, заключенные в шарики сшитого полимера по способу примера 2 и высушенные в лабораторной сушилке с псевдоожиженным слоем по способу примера 3,
и с) клетки Rhodococcus rhodochrous, заключенные в шарики сшитого полимера по способу примера 2, высушенные в лабораторной сушилке с псевдоожиженным слоем и дополнительно высушенные в сушилке с вымораживанием по способу примера 4, хранят в герметичных контейнерах при комнатной температуре в течение 17 дней. Затем шарики переносят в 50 мМ рН 7 натрий-фосфатный буфер, содержащий 50 мМ акрилонитрила. Специфическая нитрилазная активность клеток в случае а) составила 1023 мкмоля/минуту/г сухого веса клеток, в случае b) составила 1165 мкмолей/минуту/г сухого веса клеток, и в случае с) составила 1456 мкмолей/минуту/г сухого веса клеток. Это выявляет заметно более высокую устойчивость R. rhodochrous sp. 1290 нитрилазы к иммобилизации в клеточной форме с последующей сушкой.
Пример 12
Клетки Rhodococcus rhodochrous, заключенные в шарики сшитого полимера по способу примера 2, переносят в реактор с фиксированным рабочим объемом и суспендируют при 30oС в аммонийакрилате при концентрациях, представленных в табл. 11. Добавляют акрилонитрил до получения концентраций, представленных в табл.11. Нитрилаза в иммобилизованных клетках катализирует гидролиз акрилонитрила до получения аммонийакрилата. Когда концентрация акрилонитрила в реакторе снижается до низшей концентрации, представленной в табл.11, автоматически добавляют достаточное количество акрилонитрила и воды в реактор для повышения концентрации акрилонитрила до верхнего уровня концентраций, представленного в табл.11. Образцы отбирают перед каждым добавлением для определения концентраций акрилонитрила, акриламида и аммонийакрилата в суспензии. Определяют исходную специфическую нитрилазную активность заключенных в шарики клеток и время, необходимое для снижения активности в два раза; результаты представлены в табл.11.
Пример 13
Клеточный материал удаляют из раствора аммонийакрилата, полученного в примере 5 с помощью центрифугирования и фильтрования, и определяют концентрации акрилонитрила, акриламида и аммонийакрилата. Полученные результаты представлены в табл.12.
Этот пример демонстрирует прекрасную очищающую способность NCIMB 40757 нитрилазы в отношении акрилонитрила и чрезвычайно низкий достижимый уровень акриламидной примеси.
Пример 14
а) Образец аммонийакрилата, проанализированный в примере 13 ранее, и b) образец акриловой кислоты, нейтрализованный аммиаком, используют для получения 20% мономерной смеси с акриламидом до получения полной концентрации мономера 30%. Полимеризации ведут для двух различных уровней окислительно-восстановительного инициатора, измеряют характеристическую вязкость (IV) полученных полимеров; полученные результаты представлены в табл.13.
Пример 15
Полимеры, полученные ранее в примере 14, используют в качестве флоккулянтов в суспензии каолина. Не обнаружено никакой разницы в эффективности полимеров в качестве флоккулянтов.

Claims (10)

1. Нитрилаза, полученная культивированием Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757 или Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40833, обладающая значением Км при рН 7,0 для акрилонитрила от 3,8 до 500 мкМ и Кi, при рН 7,0 для акрилата аммония, по крайней мере, 100 мМ, проявляющая максимальную акрилонитрилазную активность при рН 6,5-7,0, сохраняющая при 50oС, по крайней мере, 80% акрилонитрилазной активности при 25oС и имеющая величину отношения (Кi при рН 7,0 для акрилата аммония) / (Км при рН 7,0 для акрилонитрила), по крайней мере, 200.
2. Нитрилаза по п. 1, отличающаяся тем, что обладает значением Км при рН 7,0 для акрилонитрила до 100 мкМ, предпочтительно до 50 мкМ.
3. Нитрилаза по п. 1, отличающаяся тем, что обладает значением Км при рН 7,0 для акрилата аммония, по крайней мере, 250 мкМ.
4. Нитрилаза по п. 1, отличающаяся тем, что имеет величину отношения (Кi при рН 7,0 для акрилата аммония) / (Км при рН 7,0 для акрилонитрила), по крайней мере, 5000.
5. Нитрилаза по п. 1, отличающаяся тем, что имеет при рН 6,8 акрилонитрилазную активность, которая составляет, по крайней мере, 80% ее акрилонитрилазной активности при оптимальном значении рН.
6. Штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757 - продуцент нитрилазы.
7. Штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40833 - продуцент нитрилазы.
8. Способ получения акрилата аммония путем гидролиза акрилонитрила в присутствии катализатора и воды, отличающийся тем, что в качестве катализатора используют нитрилазу по п. 1.
9. Способ детектирования нитрила в присутствии воды, отличающийся тем, что включает: a) осуществление контакта нитрила и нитрилазы по любому из пп. 1-5 в присутствии воды, b) обеспечение превращения нитрила в его соответствующую соль аммония, и c) определение изменения, которое связано с превращением нитрила.
10. Способ очистки полимера, образованного из мономерной смеси, включающей акрилонитрильный мономер, и который содержит непрореагировавший акрилонитрильный мономер, предусматривающий превращение непрореагировавшего акрилонитрильного мономера в акрилат аммония в соответствии со способом по п. 8.
RU98113063/13A 1995-12-12 1996-12-12 Нитрилаза, штамм rhodococcus rhodochrous - продуцент нитрилазы (варианты), способ получения акрилата аммония, способ детектирования нитрила, способ очистки полимера RU2188864C2 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB9525372.0 1995-12-12
GBGB9525372.0A GB9525372D0 (en) 1995-12-12 1995-12-12 Enzymes, their preparation and their use in the production of ammonium acrylate

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU98113063A RU98113063A (ru) 2000-05-20
RU2188864C2 true RU2188864C2 (ru) 2002-09-10

Family

ID=10785287

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU98113063/13A RU2188864C2 (ru) 1995-12-12 1996-12-12 Нитрилаза, штамм rhodococcus rhodochrous - продуцент нитрилазы (варианты), способ получения акрилата аммония, способ детектирования нитрила, способ очистки полимера

Country Status (15)

Country Link
US (1) US5998180A (ru)
EP (1) EP0870016B1 (ru)
JP (1) JP3809192B2 (ru)
CN (1) CN1207770A (ru)
AT (1) ATE235546T1 (ru)
AU (1) AU719269B2 (ru)
BR (1) BR9611961A (ru)
CA (1) CA2238443A1 (ru)
DE (1) DE69627021T2 (ru)
DK (1) DK0870016T3 (ru)
ES (1) ES2193280T3 (ru)
GB (1) GB9525372D0 (ru)
PT (1) PT870016E (ru)
RU (1) RU2188864C2 (ru)
WO (1) WO1997021805A1 (ru)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6551804B2 (en) 1999-07-12 2003-04-22 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for preparing 4-cyanopentanoic acid
US7608445B1 (en) 1999-12-29 2009-10-27 Verenium Corporation Nitrilases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US7300775B2 (en) 1999-12-29 2007-11-27 Verenium Corporation Methods for producing α-substituted carboxylic acids using nitrilases and strecker reagents
US7521216B2 (en) 1999-12-29 2009-04-21 Verenium Corporation Nitrilases and methods for making and using them
GB0002464D0 (en) * 2000-02-04 2000-03-22 Ciba Spec Chem Water Treat Ltd Analysis of catalysed reactions by calorimetry
DE10010149A1 (de) * 2000-03-03 2001-09-06 Basf Ag Nitrilase aus Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216
US6455730B1 (en) 2000-08-04 2002-09-24 E. I. Du Pont De Nemours & Company Preparation of dicarboxylic acid monoesters from cyanocarboxylic acid esters
US6562603B2 (en) * 2000-08-04 2003-05-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company 3-hydroxycarboxylic acid production and use in branched polymers
RU2177034C1 (ru) * 2001-04-03 2001-12-20 Закрытое акционерное общество "Биоамид" Штамм бактерий alcaligenes denitrificans-продуцент нитрилазы
US6670158B2 (en) 2002-02-05 2003-12-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for producing methacrylic acid acrylic acid with a combination of enzyme catalysts
US7932064B2 (en) 2002-06-13 2011-04-26 Verenium Corporation Processes for making (R)-ethyl 4-cyano-3-hydroxybutyric acid
US20040109853A1 (en) * 2002-09-09 2004-06-10 Reactive Surfaces, Ltd. Biological active coating components, coatings, and coated surfaces
DE10312296B4 (de) * 2003-03-20 2007-02-15 Forschungszentrum Jülich GmbH Reagenzloser Biosensor zum Nachweis von Nitrilen und Cyaniden
US7198926B2 (en) * 2003-05-08 2007-04-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Preparation of (E)- and (Z)-2-methyl-2-butenoic acids
US8618066B1 (en) 2003-07-03 2013-12-31 Reactive Surfaces, Ltd., Llp Coating compositions having peptidic antimicrobial additives and antimicrobial additives of other configurations
US20050089987A1 (en) * 2003-10-27 2005-04-28 Lonza Ltd. Polyacryamide beads containing encapsulated cells
DK1689875T3 (da) * 2003-12-02 2010-02-01 Ciba Spec Chem Water Treat Ltd Fremstilling af amider
GB0327907D0 (en) * 2003-12-02 2004-01-07 Ciba Spec Chem Water Treat Ltd Microorganism
GB0327901D0 (en) * 2003-12-02 2004-01-07 Ciba Spec Chem Water Treat Ltd Process for producing polymers
GB0416101D0 (en) * 2004-07-19 2004-08-18 Ciba Spec Chem Water Treat Ltd Process for preparing monomers and polymers thereof
US7393903B2 (en) * 2004-08-04 2008-07-01 Guerry Grune Devices and methods for the rapid, reliable detection and determination of acrylamide concentration in food substances and prevention of acrylamide formation in the same
JP4553242B2 (ja) * 2004-08-17 2010-09-29 旭化成ケミカルズ株式会社 生体触媒を用いたカルボン酸（アンモニウム）の製造方法
WO2008106662A2 (en) 2007-03-01 2008-09-04 Verenium Corporation Nitrilases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US7741088B2 (en) * 2007-10-31 2010-06-22 E.I. Dupont De Nemours And Company Immobilized microbial nitrilase for production of glycolic acid
EP2338987A1 (en) * 2009-11-16 2011-06-29 ZYRUS Beteiligungsgesellschaft mbH & Co. Patente I KG Whole cell biocatalyst
WO2012157775A1 (ja) 2011-05-19 2012-11-22 ダイヤニトリックス株式会社 アクリルアミド水溶液の製造方法
JP6098510B2 (ja) * 2011-05-19 2017-03-22 三菱レイヨン株式会社 アクリルアミド水溶液の製造方法
AU2011379783B2 (en) * 2011-10-24 2016-09-22 Dow Global Technologies Llc Method for reducing odoriferous and/or toxic residual monomer in a latex
EP3837376A1 (en) 2018-08-16 2021-06-23 AECI Limited Rhodococcus rhodochrous strain and use thereof in the production of acrylic acid
CN113195727A (zh) * 2018-10-18 2021-07-30 巴斯夫欧洲公司 用于产生丙烯酸或其盐的方法

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2245585B1 (ru) * 1973-09-19 1976-05-14 Anvar
IT1162484B (it) * 1978-03-29 1987-04-01 Nitto Chemical Industry Co Ltd Procedimento pe produrre acrilammide o metacrilammide impiegando microorganismi
JPS6019496A (ja) * 1983-07-12 1985-01-31 Nitto Chem Ind Co Ltd 微生物によるアミド類の製造法
US4629700A (en) * 1983-11-30 1986-12-16 Standard Oil Company (Indiana) Selective conversion of cyano compounds to amides and carboxylic acids
JPS61162193A (ja) * 1985-01-08 1986-07-22 Nitto Chem Ind Co Ltd 微生物によるアミド類の製造法
JPS61162191A (ja) * 1985-01-11 1986-07-22 Nitto Chem Ind Co Ltd 微生物による有機酸類の製造法
JPS632596A (ja) * 1986-06-20 1988-01-07 Mitsubishi Heavy Ind Ltd 超高圧型静水圧加圧装置
DD274631A5 (de) * 1987-09-18 1989-12-27 Kk Verfahren zur biologischen herstellung von amiden
JP3009421B2 (ja) * 1990-02-28 2000-02-14 秀明 山田 有機酸の生物学的製造法
JPH0771459B2 (ja) * 1991-05-15 1995-08-02 三協食品工業株式会社 機能性食品素材とその製造方法
US5629190A (en) * 1992-08-10 1997-05-13 Rhone-Poulenc Chimie Polypeptides possessing a nitrilase activity and method of converting nitriles to carboxylates by means of said polypeptides
FR2708936B1 (fr) * 1993-08-10 1995-11-10 Rhone Poulenc Chimie Enzymes à activité nitrile-hydratase, outils génétiques et micro-organismes hôtes permettant leur obtention et procédé d'hydrolyse mettant en Óoeuvre lesdites enzymes.
JP3437879B2 (ja) * 1994-12-27 2003-08-18 三菱レイヨン株式会社 細菌の培養法
WO1997006248A1 (en) * 1995-08-09 1997-02-20 Allied Colloids Limited Processes for the production of amidase
EP0870051B1 (en) * 1995-12-12 2001-10-31 Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Limited Production of ammonium acrylate

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KABAUCISHI M. et al. Purification and characterization of a novel nitrilase of rhodococcus K22 that acts on aliphatis nitriles. J. Bacteriol. 1990, v. 172, № 9, p. 4807-4815. KORF M.-A. et al. Light-inducel oxidation of iron atoms in a photosensitive nitrile hydratase. FEBS Lett. 1992, 301, p. 177-180. *

Also Published As

Publication number Publication date
AU719269B2 (en) 2000-05-04
BR9611961A (pt) 1999-02-17
EP0870016A1 (en) 1998-10-14
AU1106497A (en) 1997-07-03
ATE235546T1 (de) 2003-04-15
US5998180A (en) 1999-12-07
DE69627021D1 (de) 2003-04-30
DK0870016T3 (da) 2003-06-16
EP0870016B1 (en) 2003-03-26
ES2193280T3 (es) 2003-11-01
CN1207770A (zh) 1999-02-10
WO1997021805A1 (en) 1997-06-19
JP3809192B2 (ja) 2006-08-16
PT870016E (pt) 2003-07-31
DE69627021T2 (de) 2004-03-11
JP2000501610A (ja) 2000-02-15
GB9525372D0 (en) 1996-02-14
CA2238443A1 (en) 1997-06-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2188864C2 (ru) Нитрилаза, штамм rhodococcus rhodochrous - продуцент нитрилазы (варианты), способ получения акрилата аммония, способ детектирования нитрила, способ очистки полимера
CA2676926C (en) Induction of enzymatic activity in nitrile hydratase-producing bacteria
Watanabe et al. Screening, isolation and taxonomical properties of microorganisms having acrylonitrile-hydrating activity
JP4708677B2 (ja) 微生物触媒を用いたアミド化合物の製造方法
NO175489B (no) Fremgangsmåte til fremstilling av et amid
KR100395275B1 (ko) 세포또는고정화세포현탁액의보존방법
JPH0448435B2 (ru)
JPH0543351B2 (ru)
US6900037B2 (en) Method for producing amide compounds
JPH0856684A (ja) 微生物によるアミド化合物の製造法
JP4709186B2 (ja) 微生物触媒を用いたアミド化合物の製造方法
EP0528669A2 (en) Method of producing alpha-hydroxyisobutylamide
AU2012202282B2 (en) Induction and stabilization of enzymatic activity in microorganisms
RU2420581C1 (ru) Способ получения биокатализатора, обладающего активностью в отношении синтеза цефалоспоринов-кислот
AU2015203784A1 (en) Induction and stabilization of enzymatic activity in microorganisms
JP2007295933A (ja) 微生物触媒を用いたアミド化合物の製造方法
CN1886518A (zh) 酰胺的制备

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20071213