CN1886518A - 酰胺的制备 - Google Patents
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Abstract
一种从相应腈生成酰胺的方法，包括下列步骤，i)提供能够生成腈水合酶生物催化剂的微生物，ii)在生长培养基中培养该微生物，iii)保存该微生物，iv)使所述微生物与所述腈在水性介质中接触从而将腈转化为酰胺，其中所述微生物以非活跃生长游离细胞形式保存在包含水的贮存培养基中。保存的微生物可为完整微生物细胞，其可以是从发酵培养基回收的细胞糊状物的形式；微生物细胞的水性悬浮液形式，用水、生理盐水溶液、生理缓冲溶液和含有至少一种生长培养基组分的水溶液的悬浮介质制备。例如如果保存至少2天，优选3－28天之间，该微生物不表现出显著的活性丧失。
Description
本发明涉及使用能够产生腈水合酶的微生物作为生物催化剂从相应腈制造酰胺的方法。
已经熟知采用生物催化剂例如含有酶的微生物进行化学反应。已知腈水合酶直接催化腈的水合作用而生成相应酰胺。典型的腈水合酶可通过多种微生物产生，例如芽胞杆菌属(Bacillus)、无芽胞杆菌属(Bacteridium)、微球菌属(Micrococcus)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、黄色杆菌属(Xanthobacter)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、气单胞菌属(Aeromonas)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、无色杆菌属(Achromobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、假诺卡菌属(Pseudonocardia)及红球菌属(Rhodococcus)微生物。
已经发现高效产生腈水合酶的紫红红球菌(Rhodococcusrhodochrous)种的多种菌株。EP-0 307 926描述了紫红红球菌，尤其是菌株J1在含有钴离子的培养基中的培养。可使用腈水合酶将腈水合为酰胺，且特别的将3-氰基吡啶转化为尼克酰胺。商业上使用紫红红球菌J1自丙烯腈制造丙烯酰胺单体且Nagasawa和Yamada在Pure Appl.Chem.67：1241-1256(1995)中描述了这种方法。EP-A-0362829描述了包含至少一种脲和钴离子的紫红红球菌物种的细菌培养的方法，用于制备具有腈水合酶活性的紫红红球菌细胞。特别描述的是紫红红球菌J1。
Leonova等，Appl Biochem.Biochem.88：231-241(2000)题目为，“Nitrile Hydratase of Rhodococcus”，描述了在紫红红球菌M8中腈水合酶的生长及合成。在培养基中通过脲诱导这种菌株的腈水合酶合成，脲也用作这种生物生长的氮源。钴也是高腈水合酶活性所必需的。这篇文献大体上着眼于诱导及代谢效应。
Leonova等Appl.Biochem.Biotechnol.88：231-241(2000)也说明了在俄国使用紫红红球菌M8生产商用丙烯酰胺。俄国专利1731814描述了紫红红球菌菌株M8。
在US-A-5827699中描述了不需要诱导物例如脲生产腈水合酶的紫红红球菌菌株M33。此微生物的菌株为紫红红球菌M8的衍生物。
观察到使用生物催化剂的主要缺点是在保存、运输和使用期间用湿微生物材料(wet microbial material)通常缺乏稳定性。即使相对稳定的酶和细菌例如红球菌细胞中的腈水合酶，使用前变质的可能性使工业中需要用一些方法处理生物催化剂细胞悬液，例如通过冰冻或冷冻干燥水混合液或可选择的固定细胞于多聚体基质中。为了达到生物催化剂的最大生产率，在其制备期间和使用前的保存期间保持最大生物催化活性是重要的。在Chaplin和Bucke(1990)的：Enzyme Technology，Cambridge University Press出版，第47页(Enzyme preparation and use)中，认为加热、蛋白酶解、非最适的pH、氧化变性剂及不可逆抑制剂可导致酶失活。许多物质可导致酶催化反应能力的比率降低。这些物质包括非特异性蛋白质变性剂，例如脲。
对于蛋白质稳定性，Willem JH van Berkel，WageningenUniversity，提出了值得考虑的可导致蛋白质失活或解折叠的因素，且这些因素包括蛋白酶、由于氧或氧自由基的存在所致氧化及变性剂例如脲导致的不可逆解折叠。
Chaplin and Bucke(1990)在Enzyme Technology，CambridgeUniversity Press出版，第73页(Enzyme preparation and use)中揭示了关于保存酶活性的关键因素涉及维护酶结构的构象。因此认为重要的是避免共价结构中解折叠、聚集和改变。考虑3种方法达到这一点：(1)使用添加剂；(2)共价修饰的控制使用；和(3)酶的固定化。
EP-B-0-243-967描述了通过向酶的溶液或混悬液加入选自腈、酰胺和有机酸及其盐的稳定化合物，或者通过酶的固定化形式从而保存腈水解酶的腈水合活性。在说明书中该文清楚的叙述了虽然能够产生水合腈例如丙烯腈生成相应酰胺例如丙烯酰胺的腈水解酶的微生物溶液或混悬液只要保存期短可在室温下保存，但是优选在低温下保存，尤其在接近0℃下保存。在EP-A-0 707 061中描述了向含有微生物细胞悬浮液或固定化的微生物细胞的水性培养基中加入浓度在100mM至饱和浓度之间的无机盐维持细胞和酶活性更长一段时间。描述这种技术用来保存具有腈水合酶或腈水解酶活性的微生物细胞。在US-B-6,368,804中描述了向具有腈水解酶活性的微生物细胞水溶液或未固定化的微生物细胞加入碳酸氢盐或碳酸盐。固定化经常涉及将酶固定在基质前自完整细胞分离酶。然而，虽然这种固定化作用对酶提供了非常好的保护，但是自完整细胞抽提酶是一个复杂的步骤，其可以是费时的、昂贵的并可造成酶的损失。另外，整个微生物细胞可被固定。US-A-5,567,608提供了在阳离子共聚物中固定整个细胞生物催化剂的方法，其具有良好的保存稳定性且防止腐败。
紫红红球菌商业上用于制造丙烯酰胺单体，将其固定使(a)允许运输且(b)提高使用中生物催化寿命。在US-A-5,567,608中发明人叙述了在工业规模上常规固定生物催化剂使自生物催化剂容易自反应产物分离，避免从生物催化剂洗脱入产物的杂质，及有助于连续过程和生物催化剂回收再用。然而，固定化是需要额外的移植步骤并可能使用许多其他原料例如海藻酸盐、角叉藻聚糖、丙烯酰胺和其他丙烯酸酯单体，及乙烯醇。因此，这是一种昂贵的处理步骤。
已经提出了其他各种方法，试图降低在化学反应过程中负面影响而使酶失活的有害作用降到最低。
US-A-6,043,061中显示在反应混合物中降低氢氰酸浓度可抑制腈水合酶的失活。
也已经知道为保护长时间保存的酶的活性而冻干生物催化剂。但这又是一种潜在的昂贵的方法，所以其通常在小规模制备生物催化剂中采用。在液氮中或在液氮的气相中深低温保藏也能长期保存微生物细胞但是需要不断供应液氮。
用作生物催化剂的微生物的生长可发生在几天时间内。在这段时间微生物活跃生长且通过给予适当营养素及维持适于生长的温度和pH和如有需要供应氧微生物保持在生长状态。
营养素的耗尽或有毒的代谢产物的蓄积限制微生物的正常生长且降低生长速率。通过给予适当营养素及维持适于生长的温度和pH和如有需要供应氧使微生物维持生长。
有些例子中以完整微生物细胞形式的生物催化剂的生长期已经停止，但是为使其成为活性生物催化剂需要继续的新陈代谢，例如出现用于生物催化剂反应的辅助因子的再生。在这些情况下要给予生物催化剂化合物以维持新陈代谢。
然而，如果例如产生腈水合酶的生物催化剂不继续生长一段时间甚至几天而保存，则正常的要自发酵液分离微生物细胞，无论其是需要作为催化剂的细胞内的酶，还是将酶分泌到发酵培养基内。这样就防止在发酵培养基中微生物生长所致的液体培养基的腐败(putrefaction)且降低可导致所需酶破坏的蛋白酶的活性。因此通常使发酵液自身防腐或分离细胞以防止通过外源生物活性例如微生物污染的生物催化剂的降解。如果不如此操作，生物催化剂的活性预期会在非常短的时间内例如在一天内且必定少于2天就会下降。在生物催化剂保存期间，甚至达一周的时间保护活性的方法通常包括自发酵液分离生物催化剂和/或将生物催化剂固定在适当的基质和/或使用稳定化物质稳定，然后在反应混合物中稳定化物质或者会成为污染物并且可成为进一步的下游问题，或者在作为生物催化剂使用前需要另外的处理步骤自微生物细胞除去。
生物催化剂没有做这种防腐处理，当在室温保存时将失去活性直到不再有效甚至不适于催化反应。
需要提供一种腈生物转化为酰胺的简化方法。另外需要在用来制造酰胺前保存微生物而不显著丧失活性的方法，且避免为达到稳定保存通常采用的另外处理步骤。也需要避免在室温保存时微生物的腐败。
根据本发明，我们提供了一种从相应腈制备酰胺的方法，包括下列步骤，
i)提供一种能够生成腈水合酶生物催化剂的微生物，
ii)在适当的生长培养基中培养该微生物，
iii)贮存该微生物，
iv)使微生物在水性培养基中接触腈并将腈转化为酰胺，
其中微生物作为非活跃生长的游离细胞贮存在包含水的贮存培养基中。
贮存的微生物可作为完整的微生物细胞存在，且可以是从发酵培养基(培养基或生长培养基)回收的细胞糊状物(cell paste)的形式。
进一步的，微生物可自菌种生长培养基回收且然后以微生物细胞水悬浮液保存在悬浮介质(suspending medium)中。例如可以使用适当的悬浮介质例如水、生理盐水溶液、适当的pH缓冲液例如磷酸盐，或者含有发酵培养基的组分和/或微生物生长产物的发酵液制备微生物细胞的水性悬浮液。
优选的，微生物不从最初发酵培养基中回收且不用另外下游处理步骤保存，例如使用例如离心或过滤回收微生物。
微生物细胞可看作非活跃生长培养物。我们以此指其中保存的微生物预期没有促进生长的培养基和贮存条件。例如贮存培养基可为自发酵培养基回收的微生物细胞、水、生理盐水、适当的缓冲液例如磷酸盐缓冲液或任何其他类似缓冲液或生长培养基，通过测定生长速率或生物量浓度或氧消耗量或营养素消耗量或其他在监测微生物生长与代谢中通常使用的测定形式，其中在微生物细胞中新陈代谢基本上为零。
组合物或贮存培养基可包含任何残留发酵液组分。发酵液可包括用作培养微生物任何典型的成分且也包括微生物产生的产物和副产物。发酵液的典型组分包括糖、多糖、蛋白质、肽、氨基酸、氮源、无机盐、维生素、生长调节剂及酶诱导剂。尤其可包括糖中的单糖或二糖；铵盐或其他氮源；无机盐例如磷酸盐、硫酸盐、镁盐、钙盐、钠盐及钾盐；金属化合物；维生素；及复合发酵培养基组分例如玉米浆；蛋白胨；酵母提取物；可用于特定微生物生长需要的有机化合物或无机化合物；特定的酶诱导剂(例如用来诱导一些微生物的腈水合酶的脲)；和有机酸例如柠檬酸盐或丙酮酸盐；及可用来确保微生物成功培养的任何其他有机化合物或无机化合物。
通常如果微生物例如产生腈水合酶的微生物不继续生长而贮存一段时间，甚至几天，正常的应自发酵液分离微生物细胞，无论是需要作为催化剂的细胞还是自细胞或发酵培养基回收的酶。这样是为了防止在发酵液中微生物生长导致液体培养基腐败且降低可导致所需酶破坏的蛋白酶活性。因此通常保存发酵液自身或分离细胞以防止生物催化剂通过外源生物活性例如微生物污染而降解。如果不采用这种方法，生物催化剂活性预期通常可在非常短的时间例如一天内及必定少于两天内降低。
在文中描述的贮存方法应有效的增进稳定性使生物催化剂可容易的使用而活性没有任何显著降低。不需要使用例如固定化作用、添加稳定化合物、冷冻干燥方法达到保存稳定性。不需要分离任何发酵液组分例如脲或脲衍生物，即使已知脲为蛋白质减活化剂，可达到保存稳定性。
组合物或贮存方法中使用的环境可含有氧或可为基本上无氧。无氧，我们指氧的浓度应低于1％溶解氧浓度。可通过任何常规除氧方法自发酵液除去氧。这些方法包括用惰性气体换气一段时间，清除贮存容器中任何顶部空间，在减压下贮存或添加已知除氧剂例如抗坏血酸或肼和酰肼。
预期贮存2天后及尤其数天后腈水合酶活性将丧失一些。甚至在无氧时也有降低。尤其在残留发酵液组分例如脲存在下，0℃以上温度下也会降低。这是因为生物催化剂中蛋白酶可破坏细胞中其他蛋白质，包括腈水合酶。然而，本生物催化剂没有预期缺点因此腈水合酶活性没有显著丧失。
相反我们发现在贮存期间包含腈水合酶的生物催化剂的活性实际上提高了。这样在本发明的另一个方面，根据本发明贮存方法通过将生物催化剂贮存在贮存培养基中，我们提供了一种提高能够产生腈水合酶的生物催化剂的腈水合酶活性的方法。因此，由于其活性增加本方法可产生新型组合物。因此，生物催化剂组合物中，尤其在生物催化剂贮存期间形成的的腈水合酶是新型的的腈水合酶。同样在贮存期间生物催化剂不产生与腐败有关的不良气味。
优选的保存方法使生物催化剂保存至少两天且更优选一周或几周。特别的生物催化剂可保存3-28天，例如3-14天。
通过包括在发酵混合物中脲或脲衍生物可存在于生物催化剂组合物中。在本发明的一种形式中，组合物或含有催化剂的贮存介质可为脱氧的且含有发酵液组分例如脲。生物催化剂是所需的能够产生腈水合酶的微生物。例如其可选自芽胞杆菌属(Bacillus)、无芽胞杆菌属(Bacteridium)、微球菌属(Micrococcus)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、黄色杆菌属(Xanthobacter)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、气单胞菌属(Aeromonas)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、无色杆菌属(Achromobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、假诺卡菌属(Pseudonocardia)及红球菌属(Rhodococcus)微生物。该生物催化剂尤其是红球菌属微生物，优选紫红红球菌种。在我们的指定案例参考号数(reference number)为BT/3-2235/P1的UK专利申请0327907.2中描述并要求保护了一种特别适当的生物催化剂是紫红红球菌粉红色菌株NCIMB 41164。
紫红红球菌菌株NCIMB 41164
1.起源和保藏
我们在Bradford，England，自土壤分离菌株NCIMB 41164，并在2003年3月5日保藏于国立工业和海洋微生物保藏有限公司(National Collection of Industrial and Marine Bacteria)(NCIMB)，在Budapest Treaty下指定其检索号为NCIMB 41164。
2.形态学特征和培养特征
(1)多态生长
(2)运动性：不能游动的
(3)非产芽孢菌
(4)革兰氏染色阳性
(5)需氧
(6)30℃下在营养琼脂上生长48小时内出现淡红色圆形菌落
本发明这个方面的特别优势的特色为不再需要自其培养的发酵混合物分离生物催化剂。由于不需要另外的处理步骤，这点具有重要价值。因此然后保存的组合物可包含发酵混合物。在保存生物催化剂的方法中，我们发现发酵混合物的存在对酶活性没有任何不利影响。然后立即使用发酵液催化反应物，或保存几天或甚至几周并无不利影响，同时也进行几天的生物转化步骤，这样就保证了轻易可得到的生物催化剂的连续供应而不需要另外的处理步骤，从而简化了生物转化步骤且降低了其费用。
生物催化剂可在其凝固点以上温度下方便地保存。典型的生物催化剂可保存在室温下，例如高达30℃或40℃。但是，本方法的优势是生物催化剂可在室温并没有任何特别的监测和控制温度的预防措施下保存。优选生物催化剂在温度为4℃至30℃或40℃之间保存，更优选在5℃至25℃之间，例如10℃至25℃之间且尤其在15℃至25℃之间。
根据本发明，可在含有氧的环境中保存或在无氧环境中保存生物催化剂。在起始腈的转化前可含有或不含有残留的发酵液。这可以是由于保存的微生物有发酵液组分，生物催化剂的保存与其一致。
如上所述，生物催化剂不需要自制备生物催化剂的发酵混合物分离。根据本发明，保存生物催化剂的环境也含有发酵液的组分。因此，含有发酵液组分的生物催化剂组合物可与腈结合，然后腈水合成相应酰胺。我们惊奇的发现，与以前的认识例如在US-A-5,567,608中叙述的优选固定生物催化剂以防止杂质自生物催化剂洗脱入反应产物中相反，在反应混合物中包括发酵液不影响终产物的质量且在我们的共同申请(co-filed)UK申请0327901.5描述了这个方面，案号(case number)为BT/3-22349/P1。
发酵混合物将包含使微生物生长及持续的主要成分。通常混合物至少含有碳源、氮源和各种营养素。这可包括单糖例如葡萄糖或其他糖或二糖或多糖，铵盐，复合培养基组分例如酵母提取物和蛋白胨、氨基酸、维生素、磷酸盐、钾盐、钠盐、镁盐及钙盐，微量元素例如铁、钴、锰、铜、锌等。这些成分及其他成分可以适于特定微生物的浓度包括在发酵混合物中。已知在生物催化剂生产中发酵可能变化且可在不同培养阶段使用发酵液，因此在以此方法生产后能够保存生物催化剂是重要的。
我们发现在反应延长时间内生物催化剂的活性并未显著降低。因此生物催化剂较少可被替代。优选使用生物催化剂至少2天且超过这个时间基本上不损失活性。
通常使用腈水合酶催化的反应能使腈一步转化为相应的酰胺。当腈是丙烯腈和酰胺是丙烯酰胺时这种方法特别有用。最好是用单批生物催化剂进行该转化步骤数次，经过几天时间移去部分以完成数次腈转化为酰胺的反应。因此，重要的是能够对催化剂无害的尽可能廉价的保存此生物催化剂，同时生物转化步骤同时进行。因此实际上一批生物催化剂可保存用来准备生产几批产物例如丙烯酰胺。此处几批可为5-10批或更多，甚至15-20批。
下列实施例举例说明了本发明。
实施例1
在含有180L培养基的280L发酵罐中培养紫红红球菌NCIMB41164，培养基含有下列组分(g/L)：磷酸氢二钾0.7；磷酸氢钾0.3；葡萄糖1.0；酵母提取物3.0；硫酸镁七水合物0.5；氯化钴六水合物0.01；脲5.0。培养基的pH调整到pH 7.2。培养物生长3天。
25L的发酵液在室温下保存前用氮脱气20分钟，其在约5℃下保存3.5天。收获15小时后在25℃下测定腈水合酶活性且发现其为242,000U/g。3天后在第一次丙烯酰胺生产试验前立即重测NH活性，发现其为293,000U/g。
实施例2
在28℃、180rpm搅拌下、在培养基中，在2L锥形瓶内培养紫红红球菌NCIMB 41164 5天，培养基含有下列组分(g/L)：磷酸氢二钾0.7；磷酸氢钾0.3；葡萄糖10.0；酵母提取物3.0；脲5.0；硫酸镁七水合物0.5；氯化钴六水合物0.01。使用离心法自一半液体培养基收获细菌细胞。液体培养基分为两部分，一半用氮脱氧10分钟。液体培养基脱氧部分和含氧部分均在4℃、15℃及25℃下孵育1周。定时测定各部分的腈水合酶活性。
表1中显示了腈水合酶测定的结果。结果以U/mg细胞干重表示。
表1
| 孵育温度 | 时间(天) | |||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 5 | 7 | |
| 4℃(O2) | 140 | 286 | 232 | 267 | 257 | |
| 4℃(脱气) | 274 | 214 | 293 | |||
| 15℃(O2) | ||||||
| 15℃(脱气) | 140 | 218 | ||||
| 25℃(O2) | 140 | 143 | ||||
| 25℃(脱气) | 154 | 230 |
实施例3
在28℃、180rpm搅拌下、在培养基中，在2L锥形瓶内培养紫红红球菌J1 5天，培养基含有下列组分(g/L)：磷酸氢二钾0.5；磷酸氢钾0.5；葡萄糖20.0；蛋白胨5.0；酵母提取物1.0；脲7.5；硫酸镁七水合物0.5；氯化钴六水合物0.01。使用离心法自一半液体培养基收获细菌细胞。液体培养基分为两部分，一半用氮脱氧10分钟。液体培养基脱氧部分和含氧部分均在4℃、15℃及25℃下孵育1周。定时测定各部分的腈水合酶活性。表2中显示了测定结果。
表2
| 孵育温度 | 时间(天) | |||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 5 | 7 | |
| 4℃(O2) | 78 | 86 | 87 | 78 | ||
| 4℃(脱气) | 92 | 101 | 90 | 73 | ||
| 15℃(O2) | ||||||
| 15℃(脱气) | 78 | 94 | ||||
| 25℃(O2) | 78 | 96 | ||||
| 25℃(脱气) | 90 | 86 | ||||
从实施例2和实施例3的结果均可发现生物催化剂可在室温下有效保存。另外可发现与保存0天比较，腈水合酶活性升高。这点对紫红红球菌NCIMB 41164是最显著的。
实施例4
紫红红球菌NCIMB 41164的解冻细胞再悬浮于水中。测定超过1周的腈水合酶活性。表3中显示了测定的相对腈水合酶活性。
表3
| 时间(天) | 相对腈水合酶活性(％) | ||
| 4℃ | 15℃ | 25℃ | |
| 0 | 100 | 100 | 100 |
| 1 | 66 | 64 | 66 |
| 2 | 78 | 77 | 76 |
| 5 | 72 | 72 | 74 |
| 7 | 68 | 74 | 73 |
表3中结果显示在1-7天孵育期期间在任何保存温度下活性并未降低。
实施例5
(1)在含有100mL培养基的0.5L带有挡板的锥形瓶中培养紫红红球菌NCIMB 41164，培养基含有下列组分(g/L)：磷酸氢二钾0.7；磷酸氢钾0.3；葡萄糖10.0；酵母提取物3.0；硫酸镁七水合物0.5；脲5.0；氯化钴六水合物0.01；饮用水到1L。培养基的pH调整到pH 7.2。培养物在30℃下培养4天。生长2、3及4天后在25℃下测定腈水合酶活性。
(2)(a)除用二甲基脲代替脲外在(1)中所述的培养基中培养紫红红球菌NCIMB 41164。
(b)除用乙基脲代替脲外在(1)中所述的培养基中培养紫红红球菌NCIMB 41164。
(c)除加入2.5脲和2.5g/l二甲基脲代替5g/l脲外在(1)中所述的培养基中培养紫红红球菌NCIMB 41164。
(d)除加入2.5脲和2.5g/l乙基脲代替5g/l脲外在(1)中所述的培养基中培养紫红红球菌NCIMB 41164。
表4中显示了腈水合酶活性
表4
| 尿素化合物 | 腈水合酶活性(μmol/min/g干细胞) | ||
| 2天 | 3天 | 4天 | |
| 尿素 | 6800 | 34800 | 123200 |
| 二甲基脲 | 14600 | 73800 | 97600 |
| 乙脲 | 14500 | 110100 | 未确定 |
| 尿素+二甲基脲 | 7400 | 27000 | 19400 |
| 尿素+乙脲 | 6000 | 6900 | 73850 |
Claims (10)
1.一种从相应腈制备酰胺的方法，包括下列步骤，
i)提供能够产生腈水合酶生物催化剂的微生物，
ii)在生长培养基中培养该微生物，
iii)保存该微生物，
iv)使所述微生物与所述腈在水性培养基中接触从而将腈转化为酰胺，
其中所述微生物以非活跃生长的游离细胞形式保存在包含水的贮存培养基中。
2.权利要求1的方法，其中所述微生物从生长培养基中以包含完整微生物细胞的水性糊状物的形式回收。
3.权利要求1的方法，其中所述微生物从生长培养基回收且以微生物细胞的水性悬浮液形式保存在选自水、生理盐水溶液、生理缓冲溶液和含有至少一种生长培养基组分的水溶液的悬浮介质中。
4.权利要求1的方法，其中所述微生物保留在生长培养基中。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述酰胺为烯式不饱和酰胺，优选丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述生长培养基的组分包含在含有尿素或尿素衍生物的贮存培养基中。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述微生物在贮存培养基凝固点以上的温度下保存，优选在0℃以上，更优选在4℃-30℃之间。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述微生物保存至少2天，优选3-28天之间。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述微生物为红球菌属微生物，优选紫红红球菌种微生物。
10.权利要求1-98中任一项的方法，其中所述微生物为紫红红球菌NCIMB41164。
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