CN1886502B - 紫红红球菌菌株ncimb41164及其生产腈水合酶的用途 - Google Patents
紫红红球菌菌株ncimb41164及其生产腈水合酶的用途 Download PDFInfo
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Abstract
一种微生物为紫红红球菌NCIMB 41164菌株或其突变体。要求保护一种在含有尿素或尿素衍生物的培养基上培养该微生物的方法。要求保护从该微生物中获得的一种腈水合酶。也要求保护一种从相应腈制备酰胺的方法，其中腈在存在生物催化剂的水性培养基中发生水合反应，生物催化剂选自紫红红球菌NCIMB 41164或其突变体微生物。还要求保护一种保存紫红红球菌NCIMB 41164的方法。
Description
本发明涉及一种微生物及培养和保藏该微生物的方法。本发明也涉及一种新的腈水合酶(nitrile hydratase enzyme)及用该腈水合酶将腈转换成酰胺的方法。
通过使用生物催化剂，例如含有酶的微生物，来进行化学反应是众所周知的。已知腈水合酶催化腈的水合，直接得到相应的酰胺。典型的腈水合酶可由许多种不同的微生物生产，例如芽孢杆菌属(Bacillus)、无芽孢杆菌属(Bacteridium)、细球菌属(Micrococcus)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、黄杆菌属(Xanthobacter)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、克雷柏氏菌属(Klebsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、气单胞菌属(Aeromonas)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、无色杆菌属(Achromobacter)、农杆菌属(Agrobacterium)、假诺卡菌属(Pseudonocardia)和红球菌属(Rhodococcus)的微生物。
许多文献已经对在微生物中合成腈水合酶进行了描述。Arnaud等人(Agric.Chem.41：(11)2183-2191(1977))描述了短杆菌种R312(Brevibacterium sp R312)中被他们称为“乙腈酶(acetonitrilase)”的特性，该酶将乙腈经由酰胺中间体降解为醋酸盐。Asano等人(Agric.Chem.46：(5)(1982))分离了绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)B23，该菌产生的腈水合酶催化丙烯腈转化为丙烯酰胺，生成400g/L的丙烯酰胺。Yamada等人(Agric.Chem.50：(11)2859-2865(1986))题为“绿针假单胞菌B23产生腈水合酶的最适培养条件(Optimum culture conditions for production by Pseudomonaschlororaphis B23 of nitrile hydratase)”的文章考虑了优化菌种生长培养基的培养基组分，包括以合成腈水合酶为目的加入的诱导物。发现甲基丙烯酰胺是该生物体的最佳诱导物。甲基丙烯酰胺在生长开始时就包含在培养物中。
已发现紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)种的不同菌株能够非常高效地生产腈水合酶。
EP-0307926描述了培养紫红红球菌，具体而言是在含有钴离子的培养基中菌株J1。描述了生物学上产生酰胺的方法，其中腈由钴离子存在下培养的紫红红球菌J1所产生的腈水合酶进行水合。描述了使用不同的诱导物(包括丁烯酰胺)来合成腈水合酶。在一个实施方案中，存在底物腈的微生物培养基里产生了酰胺。另一个实施方案中，底物腈加入已经累积了腈水合酶的培养基中来进行水合反应。还描述了分离微生物细胞并在合适的载体上，例如通过固定对其进行支持，并随后用底物接触。腈水合酶可以用来将腈水合为酰胺，具体而言是将3-氰基吡啶转化为烟酰胺。
EP-0362829描述了一种培养紫红红球菌种细菌的方法，该方法包括尿素和钴离子中至少一种以制备具有腈水合酶活性的紫红红球菌。具体描述的是用显著增强腈水合酶活性的尿素或者尿素衍生物诱导紫红红球菌J1的腈水合酶。尿素或其衍生物一次性加入培养基中或按顺序加入，并培养30小时或更长时间，例如最高达120小时。
Nagasawa等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.34：783-788(1991))题为“产生含钴离子腈水合酶的紫红红球菌J1的最适培养条件(Optimum culture conditions for production of cobalt-containing nitrilehydratase by Rhodococcus rhodochrous J1)”的文章，描述了将分离出作为乙腈利用菌株的J1，该菌根据所用培养条件合成两种不同的腈水合酶和腈水解酶。用尿素和尿素类似物对一种腈水合酶优化诱导。培养过程开始时加入尿素，并且似乎只在基础培养基营养丰富时才成为有效的诱导物。酶的诱导逐渐开始并在生长时增加直至培养5天后到达最大值。延长培养发现活性下降。
紫红红球菌J1也被用于商业上从丙烯腈制造丙烯酰胺单体，这个过程已经由Nagasawa和Yamada进行了描述(Pure Appl.Chem.67：1241-1256(1995))。
Leonova等人(Biochem.Biotechnol.88：231-241(2000))题为“红球菌属的腈水合酶(Nitrile Hydratase of Rhodococcus)”描述了紫红红球菌M8的生长及其中腈水合酶的合成。该菌的腈水合酶的合成由培养基中的尿素诱导，尿素也被该微生物用作生长的氮源。腈水合酶的高活性也需要钴离子。这篇文献大体上着眼于诱导和代谢效应。
Leonova等人(Appl.Biochem.Biotechnol.88：231-241(2000))也陈述了俄国将紫红红球菌M8用于商业生产丙烯酰胺。俄国专利1731814描述了紫红红球菌M8。
不需要诱导物如尿素就产生腈水合酶的紫红红球菌M33在USA5827699中有描述。该微生物菌株是紫红红球菌M8的衍生菌。
丙烯酰胺单体的生产特别期望通过生物催化途径获得。Yamada和Kobayashi发表的题为“腈水合酶及其丙烯酰胺工业生产应用(Nitrile Hydratase and its Application to Industrial Production ofAcrylamide)”综述(Biosci.Biotech.Biochem.60：(9)1391-1400(1996))中，详细说明了生成丙烯酰胺的生物催化途径的开发。描述了前后三种较好的催化剂及其丙烯酰胺生成的特性，尤其是在一定程度上详细第三代催化剂紫红红球菌J1。
使用生物催化剂的主要缺点是湿微生物材料在保存、运输和使用期间所观察到的稳定性的普遍缺乏。即使相对稳定的酶和细菌如红球菌细胞内的腈水合酶，使用前就变质的可能性导致业内公认需要用某种方法处理生物催化剂细胞悬液，例如通过冷冻或冷冻干燥水性混合物，或者将细胞固定于一些聚合物基质中。为了达到生物催化剂的最大生产能力，在使用前的制备和保存期间保持其最大生物催化活性是很重要的。在Chaplin和Bucke(1990)在剑桥大学出版社(CambridgeUniversity Press)出版的酶工艺学(Enzyme Technology)47页(酶制剂及使用(Enzyme preparation and use))中，可以认识到热、蛋白水解、非最适pH(sub optimal pH)、氧化变性剂及不可逆抑制剂可使酶失活。许多物质可使酶催化反应的能力成比例地降低。这些物质中包括非特异蛋白变性剂如尿素。
Wageningen大学的Willem JH van Berkel的文章“蛋白稳定性(Protein Stability)”中，考虑了可导致失活或解折叠的因素，包括蛋白酶、由于氧或氧自由基的存在而出现的氧化和引起可逆解折叠的变性剂如尿素。
Chaplin和Bucke(1990)在剑桥大学出版社出版的酶工艺学73页(酶制剂及使用)中揭示了关于保存酶活性的关键因素包括维持酶结构的构象。因此认为防止解折叠、聚集和共价结构改变是很重要的。考虑三个途径：(1)使用添加剂；(2)共价修饰的控制使用；(3)酶的固定化来达到这一目的。
EP-B-0243967描述了通过向酶的溶液或混悬液或酶的固定化形式中添加选自腈、酰胺和有机酸及其盐类的稳定化合物来保存腈水解酶的腈水合活性。本说明书中已阐明，虽然能产生将腈如丙烯腈水合产生相应的酰胺例如丙烯酰胺的腈水合酶的微生物的溶液或混悬液可短期保存于室温，但是优选低温保存尤其是0℃左右的温度。EP-A-0707061中描述了向包含微生物细胞的混悬液或固定化微生物细胞的水性培养基中，添加浓度在100mM到无机盐饱和浓度之间的无机盐，使细胞和酶的活性长时间保持。描述的该技术用来保存具有腈水合酶或腈水解酶活性的微生物细胞。US-B-638804中描述了向具有腈水合酶活性的固定化或者非固定化微生物细胞水溶液中添加碳酸氢盐或碳酸盐。在将酶固定于基质中之前，固定作用常常包括从完整细胞中移出酶。不过，虽然这种固定作用对酶提供了很好的保护，但从完整细胞中提取酶是个很复杂的步骤，这个步骤费时、昂贵还可导致酶的损失。此外，可固定整个微生物细胞。US-A-5567608提供了一个将整个细胞生物催化剂固定于阳离子共聚物中的方法，该方法具有良好的保存稳定性并避免了腐败作用。
将市场上使用的制造丙烯酰胺单体的紫红红球菌J1固定，使得(a)便于运输及(b)提高所用生物催化剂的存活力。在US-A-5567608中，发明人指出工业规模的应用通常将生物催化剂固定化，以使生物催化剂易于从反应产物中分离，避免生物催化剂中的杂质被洗脱到产物中并且利于连续处理和生物催化剂的回收再用。
不过，固定化是一个额外的处理步骤，需要额外的移植步骤并可能使用一定数量的其他原料例如藻酸盐、角叉菜聚糖、丙烯酰胺及其他丙烯酸酯单体和乙烯醇。因此，这是一个昂贵的处理步骤。
已经提出各种使酶失活的有害作用减至最低的其他方法，试图在化学反应过程中减少负面影响。
为了长时间保存酶的活性，冷冻干燥生物催化剂是众所周知的。这可能又是一个昂贵的处理步骤，通常是小规模制备生物催化剂时使用。液氮或液氮的蒸气相中深低温保藏也能长时间保存微生物细胞但是需要不断供应液氮。将复苏的生物量或酶的半纯品或纯品冷冻于-18℃以下也是众所周知的用来长时间保存生物催化活性的方法。
此外，一旦将细胞物质加入反应器且反应正在发生，则将效率损失减至最低是操作效率和方法经济性的关键。另一方面，将微生物细胞固定于一些聚合物基质中是优化这些方法参数的标准程序。
因此需要提供一种方法及生物催化剂来克服这些缺点。
依据本发明我们提供了一种微生物即紫红红球菌NCIMB 41164菌株或其突变体。
发现这个新的微生物易于生产腈水合酶。我们发现这种新的微生物(及由此产生的腈水合酶)可以用于将腈转变为酰胺的方法中。紫红红球菌NCIMB 41164特别有利于将(甲基)丙烯腈转变为(甲基)丙烯酰胺。发现该微生物及酶在持续长时间后保持活性并在某些情况下活性甚至会增高，而且在制备重量比50％以上的丙烯酰胺后还可从反应混合物中回收而活性不减。因此如果需要，它可以直接或再保存一段时间后再使用。
以下是新菌株紫红红球菌NCIMB 41164的详细内容：
1.起源和保藏
紫红红球菌株由我们从英国Bradford的土壤中分离，并按照布达佩斯条约于2003年3月5日保藏于国立工业和海洋微生物保藏有限公司(National Collection of Industrial and Marine Bacteria)，分配的检索号为NCIMB 41164。
2.微生物的分类鉴定
用16S rDNA分析技术进行土壤分离体的鉴定。将土壤分离体的16S rDNA基因序列与核酸序列数据库进行比较。获得的序列与专利数据库(proprietary database)(MicroseqTM)中找到的进行比较并确定了前20个命中结果。将该序列与这个数据库比较，鉴定出最佳匹配，为紫红红球菌，有97.48％的相似性。这是属水平的匹配，但最可能是紫红红球菌的一个菌株。进一步搜索公开的EMBL数据库，鉴定出与该数据库的紫红红球菌最匹配，有99.698％的相似性。
3.形态学与培养特征
(1)多形态生长
(2)运动性：不能游动
(3)无芽孢前体
(4)革兰氏阳性
(5)好氧
(6)在营养琼脂上30℃生长48小时产生淡红色圆形菌落。
4.培养及腈水合酶的合成
本发明的紫红红球菌NCIMB 41164可在任何与本发明目的适合的条件下根据已知方法培养，如前面提到的先有技术所描述。优选在包含尿素或尿素衍生物的培养基中培养微生物。我们发现该微生物可在含有乙腈或丙烯腈作为腈水合酶诱导物的培养基上生长。在尿素或尿素衍生物作为诱导物和氯化钴作为钴离子来源存在下，得到非常高的腈水合酶活性。例如在实验实例中描述的将尿素和钴离子加入培养基。
期望可培养紫红红球菌NCIMB 41164得出高酶活，例如15℃时约250-300,000μmol min-1/g干生物量。如果尿素或尿素衍生物存在于培养基中，可得到高的腈水合酶活性。它可在培养的一开始就存在或者在生长期间某点加入，但是一般应该在生长平稳期开始前加入。如果尿素或尿素衍生物在微生物生长开始的培养基中没有以任何实质性的量存在而是随后引进的则可优选达到高腈水合酶活性。此时，我们的意思是尿素或尿素衍生物不存在或存在的量少于0.2g/L，优选少于0.1g/L。更优选培养基在微生物生长的至少最开始6个小时基本上无尿素或尿素衍生物(即少于0.2g/L)。如果微生物的生长培养基在加入尿素或尿素衍生物前至少12个小时并在某些情况下至少24小时基本上无尿素或尿素衍生物是尤其优选的，因为微生物在尿素或尿素衍生物不存在下生长速率更高，但是优选在微生物培养48小时前加入。我们已发现这比在培养开始时就加入尿素或尿素衍生物能在较短时间内出现更高腈水合酶活性。
本发明也涉及一种从微生物紫红红球菌NCIMB 41164或其突变体获得的腈水合酶。
本发明的另一个方面是关于从相应腈制备酰胺的方法，其中腈于存在生物催化剂的水性培养基中发生水合反应，所述生物催化剂选自紫红红球菌NCIMB 41164的微生物、其突变体和得自紫红红球菌NCIMB 41164或其突变体的腈水合酶。因此术语“生物催化剂”是指在紫红红球菌NCIMB 41164细胞中合成的腈水合酶并可包括紫红红球菌NCIMB 41164细胞本身。因此，生物催化剂可以以下形式使用：在发酵培养基中的全细胞制品、含水悬浮液、回收的细胞糊状物(paste)、固定化细胞制品、或满足本发明需求的适于将腈转变为酰胺的任何其他形式腈水合酶。
该方法特别适合于从相应腈迅速制备酰胺。特别是可制备高浓度酰胺的水溶液。该方法特别适合于制备丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺。
生物催化剂可作为全细胞催化剂用于从腈产生酰胺。可将其固定例如包埋入凝胶或将其优选作为游离细胞悬液使用。或者，可提取腈水合酶并例如直接用于制备酰胺的过程。
实施该方法的一个优选方案中，生物催化剂被引入适合进行微生物培养的水性培养基。可形成典型的生物催化剂悬液，例如微生物的全细胞。腈，例如丙烯腈或甲基丙烯腈加入含有生物催化剂的水性培养基中，使得(甲基)丙烯腈在水性培养基中的浓度维持在至高达6％重量。更优选将腈例如丙烯腈或甲基丙烯腈加入反应介质中并且使反应持续直到酰胺的浓度，例如丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺的浓度达到所需水平，尤其是重量比介于30％和55％之间。最优选重量比在50％左右。
该紫红红球菌新菌株(NCIMB 41164)能产生高浓度的丙烯酰胺(例如50％丙烯酰胺)水溶液。期望利用分批补料型反应器，将发酵液形式或作为收获生物量的生物催化剂(紫红红球菌NCIMB 41164)加入，以游离细胞方法完成反应。
生物催化剂(紫红红球菌NCIMB 41164)的活性及由此产生的腈水合酶是可以再循环和再利用以将腈进一步水合为相应的酰胺的腈水合酶。
生物催化剂的再循环特别适于任何将(甲基)丙烯腈转化为(甲基)丙烯酰胺的情况。因此在制造丙烯酰胺中，当反应过程完全且已经生产了适当浓度的丙烯酰胺时，催化剂可被移出并再用于生产另一批丙烯酰胺而不损失腈水合酶活性。这甚至可在生物催化剂再使用前于水中保存数天(例如三天)后实现。甚至在更长时间保存后还可能制备第三批丙烯酰胺。
依据本发明的一方面，我们提供了一种含有紫红红球菌NCIMB41164菌株本身或来自其的或其突变体的生物催化剂的水性组合物，且其中生物催化剂是非活跃生长的游离细胞微生物的形式。我们也提供了一种保存生物催化剂即非活跃生长的游离细胞微生物的方法。
用来实现将腈转化为酰胺的生物催化剂的微生物细胞，可被视为非活跃生长培养物。此时，我们是指维持微生物的培养基和保存条件预期是不促进生长的。保存培养基可以是例如可从发酵培养基中回收的紫红红球菌NCIMB 41164细胞。或者细胞可直接用于发酵培养基，或可在适合的悬浮介质中作为含水悬浮液存在，例如水、生理盐水溶液；适合的缓冲溶液例如磷酸盐缓冲液或任何其他相似缓冲液或生长培养基，其中微生物细胞的代谢基本为零，这由测量生长速率、或生物量浓度或耗氧或营养成分消耗来确定，或通过通常用于监测微生物生长和代谢的其他形式的检测来确定。
所述组合物或保存培养基可包含任何残留发酵液组分。发酵液可包括任何用来培养微生物的典型成分，还可包括由微生物产生的产物和副产物。发酵液的典型组分包括糖、多糖、蛋白质、肽、氨基酸、氮源、无机盐、维生素、生长调节剂和酶诱导剂。具体的可包括单糖或双糖作为糖；铵盐或其他氮源；无机盐例如磷酸盐、硫酸盐、镁、钙、钠和钾盐；金属化合物；维生素；及复合发酵培养基组分，例如用于特定微生物生长需求的玉米浆、蛋白胨、酵母提取液、有机或无机化合物；特殊的酶诱导物(例如用来诱导紫红红球菌NCIMB 41164的腈水合酶的尿素)；及有机酸例如柠檬酸或丙酮酸；和任何需要确保紫红红球菌NCIMB 41164成功生长的其他有机或无机化合物。
通常当将一种生物催化剂(例如生产腈水合酶的生物催化剂)无持续生长而保存一段时间，甚至是几天时，那么从发酵液中去除微生物细胞是正常的，不论它是否是所需作为催化剂的细胞，或酶是否从细胞或发酵培养基中回收。这是为了防止微生物在发酵液中生长导致发酵液的腐败并减少可导致所需酶分解的蛋白酶活性。因此保护发酵液本身或去除细胞来防止生物催化剂经外来的生物活性如微生物污染而降解是正常的。并且如果没有实施上述步骤，通常预期生物催化剂活性在一段很短时间内例如一天内减少，并且肯定少于两天。
在生物催化剂保存期间甚至长达一周的时间内保留活性的方法通常包括从发酵液中去除生物催化剂和/或将生物催化剂固定于合适的基质和/或用稳定物稳定，稳定物要么成为反应混合物的污染物且这可能会是下游的难题，要么需要一个额外的处理步骤以便在其作为生物催化剂使用前从微生物细胞悬液中去除稳定化合物或添加物。
当缺乏这种保存处理时，通常情况下保持在环境温度中的生物催化剂趋于损失活性，不再有效催化或甚至不再适合催化反应。
用作生物催化剂的微生物的生长可在几天的时间段内进行。这段时间内微生物活跃生长，也就是说平衡生长，其中生物量一起增长并保持细胞总体化学组成不变。
通常微生物生长受限要么是因为营养衰竭，要么是因为有毒代谢产物的累积和生长速率的降低。生长的维持是通过添加合适的营养和保持正确的生长温度及pH和必需的氧气供给。
这里描述的保存方法有效的促进了稳定性，使得生物催化剂可被迅速使用而无任何显著的活性损失。保存的稳定性不一定需要采取例如固定化、添加稳定化合物或冷冻干燥达到。保存的稳定性可不采取去除任何发酵液成分例如尿素或尿素衍生物来达到，即使尿素是众所周知的蛋白质失活剂。
组合物或保存方法所用的环境可包含氧或基本上无氧的环境。无氧我们是指氧浓度应该低于1％的溶氧浓度。去除发酵液中的氧可通过任一种除氧的常规方法进行。这包括用一种惰性气体冲洗一段时间、除去保存容器顶部的氧气、保存于负压或添加已知的氧净化剂例如抗坏血酸或肼和酰肼。
可预计的是保存两天后并且尤其是数天后腈水合酶活性会有些损失。即使无氧存在也可预见到出现这种情况。可预见到特别是在发酵液残余组分例如尿素存在下和高于0℃的温度下会出现这种情况。这是因为生物催化剂中的蛋白酶预期可能降解细胞内的其他蛋白，包括腈水合酶。并且，可预期尿素或尿素衍生物的存在是有害的，因为尿素是已知的蛋白失活剂。不过，生物催化剂没有经受任何预期的不利条件并因此腈水合酶活性没有遭受显著损失。
相反我们发现在保存期间包含腈水合酶的生物催化剂的活性在某些情况下确实增高了。
因此本发明的另一方面，我们提供了一种增高能形成腈水合酶的生物催化剂的腈水合酶活性的方法，方法为依照本发明的贮存方法保存生物催化剂于保存培养基。因此，该方法凭借其增高的活性可产生新的生物催化剂组合物。所以，生物催化剂组合物的腈水合酶，尤其是生物催化剂保存期间形成的这种酶是新的。并且，保存期间生物催化剂不产生与腐败相关的不良气味。
优选的保存方法使生物催化剂保存至少两天，更优选大于等于一周。具体的生物催化剂可保存三到二十八天，例如三到十四天。
发酵液组分例如尿素的存在对本发明这方面的组合物或保存方法不是必需的。发酵液组分存在时，其可以是尿素或尿素衍生物。尿素衍生物可以是例如尿素的烷基衍生物。
尿素或尿素衍生物可通过包含于发酵混合物中而存在于生物催化剂组合物内。本发明一种形式中的组合物或含有生物催化剂的保存培养基可以是除氧的并包含发酵液组分例如尿素。
本发明该方面一个特别有利的特点是不再需要从发酵混合物中分离培养于其中的生物催化剂。这具有重要价值，因为避免了额外处理步骤的需要。因此组合物也可包含随后保存的发酵混合物。保存生物催化剂的方法中，我们发现这也可在发酵混合物存在下完成而对酶活性不会有任何有害作用。这使得发酵液可立即用于催化反应，或使发酵液保存数天甚至数周后没有受损同时生物转化步骤也可在数天时间后实现，所以确保易于获得的生物催化剂不断供给而不需额外的处理步骤使得生物转化步骤简化并降低了成本。
生物催化剂可方便的保存于高于凝固点的温度。典型的生物催化剂可保存于环境温度，例如高达30或40℃。不过，本发明方法的优点是生物催化剂可保存于环境温度而不用特别警惕温度的检测和控制。优选生物催化剂保存温度在4到30或40℃之间，更优选5到25℃之间，例如介于10到25℃之间尤其是15到25℃之间。
依据本发明的再一方面，我们提供了一种通过用腈水合酶接触相应的腈来生产酰胺的方法，其中生物催化剂是组合物的一部分或以非活跃生长的游离细胞微生物形式保存在保存培养基中，其中组合物或保存培养基包含发酵液并且生物催化剂是(或得自)微生物紫红红球菌NCIMB 41164菌种或其突变体。
因此依据本发明的该方面，生物催化剂可处于含氧环境或无氧环境。腈转换开始前可以包含或不包含残留发酵液组分例如尿素。这可由依据本发明保存方面进行生物催化剂的保存达到或作为依据本发明的组分而提供。
如前所述，不必从制备生物催化剂的发酵混合物中移出生物催化剂。因此在优选的形式中，生物催化剂所在的环境也包含发酵液的组分。所以包含发酵液组分的生物催化剂组合物可以与腈结合并随后水合为相应的酰胺。过去认为例如US-A-5567608声明的阻止杂质从生物催化剂洗脱到反应产物最好是生物催化剂的固定化，相反我们出人意料地发现反应混合物中包含发酵液不影响最终产物的质量并且该方面已经在我们UK申请0327901.5中进行了描述，案号为BT/3-22349/P1。
发酵混合物包含让以下微生物生长持续的必需组分。大体上混合物至少含有碳源、氮源和各种营养。可包括糖例如单糖如葡萄糖或其他糖或者双糖或多糖，铵盐，复合培养基组分例如酵母提取物和蛋白胨、氨基酸、维生素、磷酸盐、钾、钠、镁和钙盐，微量元素例如铁、钴、锰、铜、锌等。这些和其他成分可以适合特定微生物的浓度包含在发酵混合物中。众所周知的是，发酵的生物催化剂产能可能会变化，并且发酵液可用于不同的生长期，所以生产后能用这种方法保存生物催化剂是很重要的。
我们发现生物催化剂的活性在反应了一段较长时间后没有显著降低。因而可较少更换生物催化剂。优选生物催化剂至少用2天并且在此期间基本没有活性损失。
通常用腈水合酶催化的反应能一步将腈转化为相应的酰胺。当腈是丙烯腈而酰胺是丙烯酰胺时这个过程有特别的价值。可期望用单批生物催化剂实现这个转化步骤数次，数天后除去部分以实现数次将腈转化为酰胺的反应。因此，尽可能低成本保存生物催化剂而对催化剂无害同时生物转化步骤同步进行是很重要的。所以实际上可保存单批补料的生物催化剂以随时用于生产数批如丙烯酰胺。数批可以是5到10或更多批，甚至15到20批。
本发明的又一方面，我们发现一种提高微生物生物催化活性的方法。微生物在含有尿素或尿素衍生物的培养基上培养。不过，在微生物生长至少开始6小时后才引入尿素或尿素衍生物。通常至少培养微生物的前6小时培养基基本上无尿素或尿素衍生物并且此后才向培养基中加入尿素和尿素衍生物。正如前面指出的基本不含我们是指培养基含有少于0.2g/L，一般少于0.1g/L且可不含尿素或尿素衍生物。优选培养基至少12小时有时至少24小时基本不含尿素或尿素衍生物。不过，为了使生物催化活性最大化首选在培养48小时内引入尿素或尿素衍生物。
生物催化活性可如这里所述以酶活性的方式进行确定。
优选能产生腈水合酶的微生物。适合的生物催化剂包含这种可用来从相应腈通过腈水合酶催化反应的水合过程制备酰胺的微生物。通过延迟引入尿素或尿素衍生物的微生物培养提供了特别适合该反应的增高的腈水合酶活性。该方法特别适合由(甲基)丙烯腈制备(甲基)丙烯酰胺。这种方法可以如这里所述实现。此外生物催化剂可再循环和再利用。
显然需要红球菌属的微生物，优选紫红红球菌种，尤其是紫红红球菌NCIMB 41164。
以下实施例提供了如何实现本发明的例证。
实施例1
用富集培养技术从土壤中分离紫红红球菌NCIMB 41164，在含有以下组分(g/L)：KH2PO4，7.0；KH2PO4 3.0；蛋白胨，5.0；酵母提取物，3.0；葡萄糖，5.0；MgSO4，0.5；微量金属溶液，5mL；乙腈20mL的培养基上生长。PH调节至7.2。28℃生长3天后15℃时腈水合酶活性为4000μmol min-1/g干细胞。
实施例2
(1)紫红红球菌NCIMB 41164在含有400mL培养基的2L带挡板的锥形瓶(baffled erlenmeyer flask)中生长，培养基包含以下组分(g/L)：磷酸氢二钾0.7；磷酸氢钾0.3；葡萄糖10.0；蛋白胨，1.0；酵母提取物3.0；七水合硫酸镁0.5；尿素5.0；六水合氯化钴0.01；加水至1L。调节培养基pH至7.2。28℃培养生长5天后15℃时的腈水合酶活性为47900μmol min-1/g
(2)(a)紫红红球菌NCIMB 41164在不含蛋白胨的(1)所述培养基中生长。
(b)紫红红球菌NCIMB 41164在不含蛋白胨也不含尿素的(2a)所述培养基中生长。生物培养24小时然后向培养物加入5g/L尿素再生长5天。
(c)紫红红球菌NCIMB 41164在不含尿素的(2a)所述培养基中生长。生物培养48小时然后向培养物加入5g/L尿素再生长4天。
(d)紫红红球菌NCIMB 41164不含尿素的(2a)所述培养基中生长。生物培养6天。
如上所述在生长开始后的1、2、3和6天取4个培养物样品。测量15℃的腈水合酶活性见表1。
表1
ND未确定
实施例3
(1)紫红红球菌NCIMB 41164在装有180L培养基的280L发酵罐中生长，培养基包含以下组分(g/L)：磷酸氢二钾0.7；磷酸氢钾0.3；葡萄糖2.0；酵母提取物3.0；七水合硫酸镁0.5；六水合氯化钴0.01。调节培养基pH至7.2。30℃培养生长3天。17小时后将尿素加入培养物。周期性测量腈水合酶活性(30℃时)。加入尿素22小时后30℃的活性约176000μmol min-1/g并且再过9小时活性增高至323000μmol min-1/g。
(2)在加有紫红红球菌NCIMB 41164的反应器中装入625克水。混合物加热至25℃。375g丙烯腈以维持2％浓度(重量比)的速率加入反应器中。175分钟后全部丙烯腈转化为丙烯酰胺，终浓度约为50％(重量比)。
(3)2的细胞通过离心回收并重悬于625g水中。该混悬液在再次装入反应器前于4℃保存3天。随后是5中描述的操作并在175分钟后全部丙烯腈转化为丙烯酰胺。
(4)除了再利用前保存2天外3的细胞如上述3进行处理。再合成50％的丙烯酰胺。测量实施例32-4)(5-7各批次产生丙烯酰胺的丙烯酸浓度见表2。
表2：测量各批次产生丙烯酰胺的丙烯酸浓度
| 实施例号 | 丙烯酸浓度(ppm) |
| 3-2 | 5650 |
| 3-3 | 102 |
| 3-4 | 未检测到(＜10ppm) |
实施例4
(1)紫红红球菌NCIMB 41164在装有180L培养基的280L发酵罐中生长，培养基包含以下组分(g/L)：磷酸氢二钾0.7；磷酸氢钾0.3；葡萄糖1.0；酵母提取物3.0；七水合硫酸镁0.5；六水合氯化钴0.01；尿素，5.0。调节培养基pH至7.2。30℃培养生长3天。
保存前用氮气给25L发酵液脱气20分钟，环境温度约5℃保存3天半。收获15小时后测量腈水合酶活性，发现25℃时活性为242000U/g。三天后再次测量NH活性，发现其为293000U/g。
实施例5
紫红红球菌NCIMB 41164在2L锥形烧瓶(Erlenmeyer flask)中28℃，180rpm振荡生长5天，培养基含有以下组分(g/L)：磷酸氢二钾0.7；磷酸氢钾0.3；葡萄糖10.0；酵母提取物3.0；尿素5.0；七水合硫酸镁0.5；六水合氯化钴0.01。调节培养基pH至7.2。培养液分成两部分，一半用氮气除氧。除氧和充氧的两部分培养液都4、15和25℃孵育一周。定时检测各部分的腈水合酶活性。
腈水合酶测定结果见表3。给出结果单位为U/mg干细胞。
表3
从实施例5所示结果可以看出生物催化剂可以有效的保存于环境温度。并且可看出在这种保存情况下相比0天腈水合酶活性有增加。
实施例6
解冻后的紫红红球菌NCIMB 41164细胞重悬于水。测量了1周时间的腈水合酶活性。测量的相对腈水合酶活性见表4。
表4
表4结果显示在1到7天孵育期间任何保存温度下活性都没有降低。
实施例7
(1)紫红红球菌NCIMB 41164在含有100mL培养基的0.5L带挡板的锥形烧瓶中生长，培养基含有以下组分(g/L)：磷酸氢二钾0.7；磷酸氢钾0.3；葡萄糖10.0；酵母提取物3.0；七水合硫酸镁0.5；尿素5.0；六水合氯化钴0.01；加水至1L。调节培养基pH至7.2。30℃培养生长4天。生长2、3和4天后测量25℃时的腈水合酶活性。
(2)(a)紫红红球菌NCIMB 41164在(1)所述培养基中生长，只不过尿素由二甲基脲代替。
(b)紫红红球菌NCIMB 41164在(1)所述培养基中生长，只不过尿素由乙脲代替。
(c)紫红红球菌NCIMB 41164在(1)所述培养基中生长，只不过5g/L尿素由2.5g/L尿素和2.5g/L二甲基脲代替。
(d)紫红红球菌NCIMB 41164在(1)所述培养基中生长，只不过5g/L尿素由2.5g/L二甲基脲和2.5g/L乙脲代替。
腈水合酶活性见表5。
表5
Claims (23)
1.一种微生物，所述微生物为紫红红球菌(Rhodococcusrhodochrous)NCIMB 41164菌株。
2.一种培养紫红红球菌NCIMB 41164菌株微生物的方法，所述方法为在包含尿素或其烷基衍生物的培养基中培养所述微生物，其中尿素或其烷基衍生物在微生物生长开始后至少6小时且在培养48小时内加入培养基中。
3.权利要求2的方法，其中微生物培养的至少最初6小时中培养基包含的尿素或其烷基衍生物少于0.2g/L，并且尿素或其烷基衍生物随后才被加入培养基中。
4.权利要求2或3的方法，其中微生物培养的至少最初12小时中培养基包含的尿素或其烷基衍生物少于0.2g/L，并且尿素或其烷基衍生物随后才被加入培养基中。
5.一种从相应腈制备酰胺的方法，其中所述腈在生物催化剂存在下在水性培养基中发生水合反应，所述生物催化剂为紫红红球菌NCIMB 41164菌株微生物。
6.权利要求5的方法，其中所述酰胺是(甲基)丙烯酰胺。
7.权利要求6的方法，其中所述生物催化剂加入水性培养基中，且(甲基)丙烯腈加入水性培养基中，使得(甲基)丙烯腈在水性培养基中的浓度维持在至高达6％重量。
8.权利要求7的方法，其中所述反应持续到丙烯酰胺的浓度在30％重量和55％重量之间。
9.权利要求5-8中任一项的方法，其中将所述生物催化剂循环并重复使用。
10.一种提高权利要求1的微生物的生物催化活性的方法，其中所述微生物在含有尿素或其烷基衍生物的培养基中培养，其中尿素或其烷基衍生物在微生物生长开始后至少6小时且在培养48小时内被加入培养基中。
11.权利要求10的方法，其中所述微生物培养的至少最初6小时中培养基包含的尿素或其烷基衍生物少于0.2g/L，并且尿素或其烷基衍生物随后才被加入培养基中。
12.权利要求10或11的方法，其中微生物培养的至少最初12小时中培养基包含的尿素或其烷基衍生物少于0.2g/L，并且尿素或其烷基衍生物随后才被加入培养基中。
13.一种水性组合物，所述组合物包含生物催化剂，所述生物催化剂是紫红红球菌NCIMB 41164菌株，且所述生物催化剂是非活跃生长的游离细胞微生物形式。
14.一种保存生物催化剂的方法，其中所述生物催化剂是紫红红球菌NCIMB 41164菌株，所述方法为以非活跃生长的游离细胞微生物形式在水性保存培养基中保存。
15.权利要求14的方法，其中所述生物催化剂保存于高于其凝固点的温度。
16.权利要求15的方法，其中所述生物催化剂保存于高于0℃的温度。
17.权利要求15的方法，其中所述生物催化剂保存于4℃和30℃之间的温度。
18.权利要求14或15的方法，其中所述生物催化剂保存至少2天时间。
19.权利要求18的方法，其中所述生物催化剂保存3到28天。
20.权利要求18的方法，其中所述生物催化剂保存5到14天。
21.一种组合物，所述组合物包含由权利要求14-20中任一项的方法得到的生物催化剂。
22.一种制备酰胺的方法，其包括让相应腈与权利要求13的组合物接触。
23.权利要求22的方法，其中所述酰胺是(甲基)丙烯酰胺。
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