CN103620030B - 微生物菌体的运输方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供在能够密闭的容器内保存具有腈水合酶活性的微生物菌体的方法、以及使用该容器运输的方法；前述方法的特征在于，使填充有包含前述微生物菌体的悬浮液的前述容器内的气相部分占容器内部总容积的2%以上且20%以下。

Description

微生物菌体的运输方法
技术领域
本发明涉及一种方法，其在将具有腈水合酶活性的微生物菌体填充至密闭容器中运输时，通过使密闭容器内部的气相部分占总容积的20%以下，由此在使腈水合酶活性保持稳定的状态下进行运输。
背景技术
微生物产生的酶作为化学转化反应的催化剂而用于多种场合。尤其是，通过利用具有腈基的水合或水解能力的腈水合酶、腈水解酶等，能够廉价地制造化学工业上重要的酰胺、羧酸、α-羟基羧酸等。进一步，通过利用具有光学特异性水合或光学特异性水解能力的上述酶，制造作为医药、农药的重要制造原料的光学活性羧酸、氨基酸、α-羟基羧酸等也变得可能。
将微生物酶作为催化剂的化学转化反应中，需要将培养以及收集的微生物菌体的酶的活性稳定地维持至使用时为止。即，必须维持酶的活性，以避免由于保管或者运输时杂菌混入、腐败、或者溶菌导致微生物酶的催化能力丧失或者降低。此处，通常通过在稳定剂、代谢抑制剂、高浓度盐类的存在下进行保存，抑制微生物菌体保存时的微生物酶的失活、腐败和溶菌，从而应用于化学转化反应。不添加上述稳定剂等的情况下，边通过冻结、冷藏或者通气搅拌维持酶的活性边进行保管或者运输。
专利文献1（日本特开2004-305066号公报）中公开有通过添加腈类、酰胺类、羧酸类等稳定剂的微生物菌体的保存方法；专利文献2（日本特开2005-295815号公报）中公开有通过添加叠氮化合物等代谢抑制剂的微生物菌体的保存方法；专利文献3（日本特开2001-149065号公报）中公开有通过将微生物菌体的培养液成分添加至悬浮液中的微生物菌体的保存方法。另外，专利文献4（日本专利第3163224号）中公开有通过添加高浓度无机盐类的保存方法。进一步，对于通过冷冻而进行保存的方法，已知有专利文献5（日本特开2003-219870号公报），对于通过通气搅拌而进行保存的方法，已知有专利文献6（日本特开2003-144144号公报）。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2004-305066号公报
专利文献2：日本特开2005-295815号公报
专利文献3：日本特开2001-149065号公报
专利文献4：日本专利第3163224号
专利文献5：日本特开2003-219870号公报
专利文献6：日本特开2003-144144号公报
发明内容
发明要解决的问题
到目前为止已知的保存方法中，使用稳定剂等添加剂的方法由于在后面的工序中需要将添加剂等进行分离，因此有对制品的品质产生影响的担心，且制造方法变得麻烦。以将菌体冷冻的方法保存的微生物菌体的悬浮液存在冷冻、融解操作麻烦等处理性的问题，另外有伴随着该操作酶活性丧失或者降低的担心。另外，从防止杂菌的増殖和菌体细胞的稳定化的观点出发，优选冷藏下保存，但需要保持低温的设备、电力，因此在冷却成本方面的负担重。将微生物菌体保存在高浓度无机盐类水溶液中的方法，需要在使用时将菌体充分地洗涤，存在添加的无机盐类、废水处理花费成本的缺点。也报告有通过通气搅拌等使微生物菌体的酶活性被维持在一定程度，然而根据酶的不同，该效果并不相同，此外通气和搅拌还需要动力，在成本方面的负担也重。因此，在现有技术的基础上，期望进一步稳定地保存具有腈水合酶活性的菌体的方法。
用于解决问题的方案
本发明人等对于将由培养、收集而得到的微生物菌体的悬浮液廉价并且稳定地运输的条件进行深入了研究，结果发现，通过将运输中使用的容器内部的气相设为20%以下，能够稳定地将具有腈水合酶活性的菌体保存和运输，至此完成本发明。
即，本发明为在能够密闭的容器内保存具有腈水合酶活性的微生物菌体的方法，其特征在于，使填充有包含前述微生物菌体的悬浮液的前述容器内的气相部分占容器内部总容积的2%以上且20%以下。
另外，本发明为一种使用能够密闭的容器运输具有腈水合酶活性的微生物菌体的方法，其特征在于，使填充有包含前述微生物菌体的悬浮液的前述容器内的气相部分占容器内部总容积的2%以上且20%以下。
本发明的方法中，优选将所述容器内的气相部分的比例设为5%以上且20%以下。另外，前述保存或运输的温度为例如冰点～35℃的温度。进一步，所述菌体悬浮液的分散介质为有机酸水溶液，作为有机酸可列举出例如丙烯酸。
发明的效果
根据本发明，通过按照使容器内部的气相部分为2%以上且20%以下的方式填充菌体悬浮液，由此能够在室温下、无搅拌的情况下在维持腈水合酶等的酶活性的状态下保存和运输大量的菌体。进一步，本发明提供能够将现有的保存方法中必需的劳动力、冷却成本大幅地削减，能够满足工业生产的微生物菌体的保存方法。
具体实施方式
本发明涉及在能够密闭的容器内保存具有腈水合酶活性的微生物菌体的方法、以及使用能够密闭的容器运输微生物菌体的方法。本发明的方法中，按照使容器内的气相部分为容器内部总容积的2%以上且20%以下的方式填充包含前述微生物菌体的悬浮液。
需要说明的是，本说明书中引用的文献以及公开公报、专利公报等专利文献作为参照而引入本说明书中。另外，2011年1月14日申请的、作为本申请优先权基础的日本特愿2011-005780号(JP2011-005780)的权利要求书、说明书、附图以及说明书摘要所公开内容，其整体作为参照而引入本说明书中。
本发明中，具有腈水合酶活性的微生物菌体具有生产目标酶催化剂并在菌体内蓄积或分泌于菌体外的性质。该微生物包含由自然界分离的微生物以及基因重组微生物。作为这样的微生物的代表例，可列举出例如：归属于具有腈水合酶活性的红球菌（Rhodococcus）属、戈登菌（Gordona）属、假单胞菌（Pseudomonas）属、假诺卡氏菌（Pseudonocardia）属、嗜热菌（Geobacillus）属的微生物菌体。进一步可列举出导入这些微生物的腈水合酶基因的重组微生物菌体。其中工业上优选红球菌属、戈兰登属以及导入这些微生物的腈水合酶基因的重组大肠杆菌以及重组红球菌属细菌。例如：作为红球菌属微生物的具体例，可列举出日本特公平6-55148号公报中记载的紫红红球菌J-1株（RhodococcusrhodochrousJ-1）。该株的保藏号为“FERMBP-1478”，于1987年9月18日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心（茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6）（以下，本说明书中相同））。
腈水合酶是指具有水解腈化合物并生成对应的酰胺化合物能力的酶。作为编码腈水解酶的核酸及其序列的例子，可列举出前述专利文献2所述的核酸及其序列。这样的核酸通过通常的分子生物学的手法能够导入至微生物细胞内（关于这些分子学的手法，参照以下：Sambrook,FritschandManiatis,”MolecularCloning:ALaboratoryManual”2ndEdition(1989),ColdSpringHarborLaboratoryPress）。
本发明中，“能够密闭的容器”是指为了供于运输和/或保存，填充微生物悬浮液后能够密闭的容器。只要是运输时内容物不在容器内外进行移动的容器，无论怎样的形式都没有关系，为了用于工业目的，可以使用鼓形罐、储存器（container）、槽车等。对于所述容器的容量虽没有特别的限定，为了用于工业目的，优选200L。对于容器的材质也没有特别的限定，为了用于工业目的，优选为聚乙烯、聚丙烯等塑料容器、铁·不锈钢等金属制的容器。以下，将本发明中使用的容器称为“密闭容器”。
本发明中，将容器内部气相部分的比例设为2%以上且20%以下。“2%以上且20%以下”是指：在密闭容器静置状态下，该容器中不存在菌体液的气相部分的容积比例为总容积的2%以上且20%以下。对于所述气相部分的气体组成，没有特别的限定，出于工业的理由，通常通入空气。另外，气相部分通常在容器内的上部。
通常，使用密闭容器保存或运输液体时，可根据状况自由地设定液体的填充率，而本发明中，气相部分相对于容器容积为20%以下。其中，低于2%时，内容物由于温度变化而膨胀、收缩时，有引起容器的变形的担心。因此，运输时密闭容器内部的气相部分相对于容器容积可以设为2～20%、3～20%、4～20%、5～20%等，更优选为3～15%、进一步优选为4～10%。
本发明中，“保存”是指将菌体悬浮液填充于密闭容器内后进行密闭并且静置。另外，运输后至实际上使用为止进行静置也包含于“保存”。保存期间为：填充悬浮液起至运输开始为止的时间（保存1）、以及运输结束起至现场开始使用为止的时间（保存2）。例如：保存1的情况下为1小时～180天，保存2的情况下为1小时～180天，对这些期间没有限定。另外，本发明中，“运输”是指使用密闭容器而移动菌体悬浮液的意思。通常地，在卡车、叉车、槽车、船上堆叠密闭容器而移动。
关于保存中以及运输中的温度，为了抑制菌体以及酶的腐败·分解而更优选低温。具体而言，在冰点～35℃、优选冰点～30℃、更优选冰点～20℃、进一步优选冰点～10℃下进行。此处，“冰点”是指菌体悬浮液的固体状态和液体状态的平衡温度，是根据悬浮液的组成、保存容器内的压力而变化的温度。
本发明中，在前述保存期间后，腈水合酶活性残留运输开始前的90%以上、优选为95%以上、更优选为98%以上、进一步优选为99%以上、最优选为100%。腈水合酶活性的残留率可以通过该技术领域已知的任一种方法而测定，例如：能够通过对保存开始前和保存后的丙烯酰胺相对于底物（例如：丙烯腈）的生成反应速度等进行比较而进行测定。
本发明中，悬浮液的分散介质是指作为保存对象的微生物菌体的悬浮中所使用的溶液。该分散介质优选为有机酸水溶液。该有机酸水溶液的有机酸浓度为任意的，但过低时会导致酶活性的降低，另一方面，过高时在其后的工序中将其除去时操作变得麻烦，因此优选为10～100mmol/L。
本发明中，浸渍液的组成只要是不阻碍酶活性的有机酸水溶液就没有特别的限定。作为有机酸，可以列举出例如：丙烯酸、甲酸、醋酸、丙酸、丁酸、草酸、羧酸；其中，从维持丙烯酰胺的品质的观点出发，优选为丙烯酸。
本发明悬浮液的制备中，具有腈水合酶活性的微生物菌体可以使用该技术领域公知的任一种浓缩方法进行浓缩，优选通过膜分离或离心分离而进行浓缩。使用膜分离进行浓缩时，优选使用具有0.02～0.45μm孔径的膜。这样的膜为市售品，可列举出例如：中空纤维膜组件（KURARAYCO.,LTD，孔径0.05μm、表面积39000m2）等。另外，通过离心分离进行浓缩时，优选使用分离板型连续离心分离机。
以下，通过实施例进一步详细地说明本发明的实施方法，但是这些实施例的目的在于示出本发明，对本发明没有限定作用。以下的实施例以及比较例中的%这一表述，如没有特别的说明则为质量%。
实施例
实施例1以及2、比较例1
培养
将具有腈水合酶活性的紫红红球菌J－1株（RhodococcusrhodochrousJ-1：FERMBP-1478）使用包含葡萄糖2质量%、尿素1质量%、蛋白胨0.5质量%、酵母提取物0.3%、氯化钴0.05质量%的培养基（pH7.0）进行需氧培养。
保存用菌体悬浮液的制备
将培养后的微生物菌体通过离心分离（12000rpm、20分钟）进行回收后，使用0.1%丙烯酸钠水溶液（pH7.0）进行洗涤。向洗涤后的菌体中添加上述水溶液而得到菌体悬浮液(以干燥菌体计为10质量%)。
菌体悬浮液的保存
将通过上述方法制备的菌体悬浮液115mL（实施例1）以及70mL（比较例1）加入至总容积120mL的聚乙烯制容器中并密封，作为运输的模型，在30℃、120rpm下振荡3周。另外，将通过上述方法制备的菌体悬浮液190L（实施例2）加入至容积200L的聚乙烯制鼓形容器中并密封，在室温下静置3个月。
腈水合酶活性的测定
就腈水合酶活性而言，使用通过上述方法刚刚制备的菌体悬浮液、制备后振荡3周或静置的悬浮液、由这些悬浮液中所包含的菌体的丙烯酰胺生成反应速度而算出。将作为底物的丙烯腈水溶液添加至菌体悬浮液而起始反应，10℃下振荡10分钟后，进行菌体的过滤分离和添加磷酸使反应停止，通过气相色谱（GC-14B，岛津制作所）进行分析。分析条件为：使用填充有PorapackPS（WatersK.K.）的1m玻璃柱，柱温度210℃、检测器使用230℃的FID。以下，将以第0天时的反应速度为1的相对反应速度示于表1中。
[表1]
液量 容器上部的气相部分 第0天 第21天 第90天
实施例1 115mL 4% 1.0 1.0
实施例2 190L 5% 1.0 1.0
比较例1 70ml 42% 1.0 0.9
实施例3、比较例2
具有来源于紫红红球菌M8株的腈水合酶的转化体的制备
（1）紫红红球菌M8株（以下，称为M8株。）的染色体DNA的制备
M8株(SU1731814)可以由俄国菌株中心IBFM（VKPMS-926）得到。
将M8株在100mL的MYK（0.5%多聚蛋白胨、0.3%Bacto酵母提取物、0.3%Bacto麦芽提取物、0.2%K2HPO4、0.2%KH2PO4）培养基(pH7.0)中，30℃下振荡培养72小时。将培养液离心分离，将收集的菌体悬浮于Saline-EDTA溶液（0.1MEDTA、0.15MNaCl(pH8.0)）4mL中。向悬浮液中加入溶菌酶8mg，在37℃下振荡1～2小时后，-20℃下进行冷冻。
接着，对该悬浮液边稳定地振荡边加入10mL的Tris-SDS液（1%SDS、0.1MNaCl、0.1MTris-HCl(pH9.0)）。进一步，向该悬浮液中加入蛋白酶K（MerckJapan）（终浓度0.1mg），在37℃下振荡1小时。接着，加入等量的TE饱和苯酚进行搅拌后（TE：10mMTris-HCl、1mMEDTA(pH8.0)）离心。提取上层，加入2倍量的乙醇，用玻璃棒将DNA卷起。之后，将其依次用90%、80%、70%的乙醇进行离心分离而去除苯酚。
接着，使DNA溶解于3mL的TE缓冲液中，加入10μg/mL的核糖核酸酶A溶液（100℃加热处理15分钟后），在37℃下振荡30分钟。进一步，加入蛋白酶K（MerckJapan），在37℃下振荡30分钟。向其中加入等量的TE饱和苯酚进行离心分离后，分离成为上层和下层。
将上层进一步加入等量的TE饱和苯酚进行离心分离后，分离成为上层和下层。将该操作再次重复。之后，向上层中加入等量的氯仿（含有4%异戊醇）而进行离心分离，回收上层。接着，向上层中加入2倍量的乙醇，用玻璃棒将DNA卷起而进行回收，得到染色体DNA。
（2）使用PCR制备来源于M8株染色体DNA的腈水合酶基因
来源于M8株的腈水合酶如非专利文献（Veiko,V.P.etal,Cloning,nucleotidesequenceofnitrilehydratasegenefromRhodococcusrhodochrousM8,Biotekhnologiia(Mosc.)5,3-5(1995)）所记载，将β亚基、α亚基和激活因子（activator）的碱基序列以及氨基酸序列分别示于序列号1和2、序列号3和4、以及序列号5和6。基于序列信息，合成序列表的序列号7以及8记载的引物，将按照（1）制备的染色体DNA作为模板而进行PCR。
＜PCR反应溶液组成＞
模板DNA（染色体DNA）200ng
PrimeSTARMaxPremix（宝酒造公司制）25μl
引物M8-110pmol
引物M8-210pmol
＜引物＞
M8-1：GGTCTAGAATGGATGGTATCCACGACACAGGC（序列号7）
M8-2：cccctgcaggtcagtcgatgatggccatcgattc（序列号8）
＜反应条件＞
（98℃10秒，55℃5秒，72℃下30秒）×30循环
PCR结束后，将反应液5μl供于0.7%琼脂糖凝胶（使用同仁化学公司制琼脂糖I；琼脂糖浓度0.7重量%）电泳，进行1.6kb的扩增片段的检测。将反应结束液使用WizardSVGelandPCRClean－UpSyste(PromegaKK.)进行精制。
将回收的PCR产物使用LigationKit(宝酒造)连接至载体（pUC118/HincII位点），通过反应液转化大肠杆菌JM109的感受态细胞。由得到的转化体菌落中接种数个克隆至LB-Amp培养基1.5mL，在37℃下振荡培养12小时。培养后，将该培养物通过离心分离而收集菌体。通过使用QIAprepSpinMiniprepKit(AmershamBioscience公司)，从收集的菌体中提取质粒DNA。对于得到的质粒DNA，使用测序试剂盒和自动测序仪CEQ8000（BeckmanCoulter公司）确认腈水合酶的碱基序列。
接着，将得到的质粒DNA使用制限酶XbaI和Sse8387I切断后，使用0.7%琼脂糖凝胶进行电泳，回收腈水合酶基因片段（1.6kb），并导入至质粒pSJ042的XbaI-Sse8387I位点。
将得到的质粒命名为pSJ-N01A。
需要说明的是，pSJ042作为红球菌中表达J1株腈水合酶的质粒，是采用日本特开2008-154552号公报所示的方法制备的；pSJ042的制备中使用的pSJ023作为转化体ATCC12674/pSJ023（FERMBP-6232）于平成9年（1998年）3月4日保藏在：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心（茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6）。
（3）感受态细胞的制备
将紫红红球菌ATCC12674株（以下，ATCC12674株）在MYK培养基中培养至对数增殖期前期为止，通过离心分离器收集细胞，使用用冰冷却的无菌水洗涤3次，悬浮于无菌水中，制备感受态细胞。
（4）具有来源于M8株的腈水合酶的转化体的制备
将得到的质粒pSJ-N01A0.1μg和ATCC12674株的感受态细胞的菌体悬浮液各20μl混合，分别进行冷却。在比色皿中加入各混合液，使用基因导入装置GenePulser（BIORAD）在20KV/cm、200OHMS下进行电脉冲处理。将电脉冲处理液在冰冷却下静置10分钟，37℃下进行10分钟热冲击。之后，向比色皿中加入MYK培养基500μl，在30℃下静置5小时后，涂布于加入50μg/mL卡那霉素的MYK琼脂培养基，在30℃下培养3天。
确认得到的转化体菌落所含的质粒DNA，将该重组菌作为具有来源于M8株的腈水合酶的红球菌属重组菌（ATCC12674/pSJ-N01A）。
培养
将得到的重组菌使用包含葡萄糖2质量%、尿素1质量%、蛋白胨0.5质量%、酵母提取物0.3%、氯化钴0.05质量%的培养基（pH7.0）进行需氧培养。
保存用菌体悬浮液的制备
将培养后的微生物菌体通过离心分离（12000rpm、20分钟）进行回收后，使用0.1%丙烯酸钠水溶液（pH7.0）进行洗涤。向洗涤后的菌体中添加上述水溶液而得到菌体悬浮液(以干燥菌体计为10质量%)。
菌体悬浮液的保存
将通过上述方法制备的菌体悬浮液100mL（实施例3）以及80mL（比较例2）加入至总容积120mL的聚乙烯制容器中并密封，在30℃、120rpm下振荡3周。
腈水合酶活性的测定
就腈水合酶活性而言，使用通过上述方法刚刚制备的菌体悬浮液、制备后振荡7天以及21天的悬浮液，采用与实施例1相同的方法进行测定。以下，将以第0天时的反应速度为1的相对反应速度示于表2中。
[表2]
液量 容器上部的气相部分 第0天 第7天 第21天
实施例3 100mL 17% 1.0 1.0 1.0
比较例2 80mL 33% 1.0 0.9 0.8
实施例4、比较例3
培养
将具有腈水合酶活性的边缘假单胞菌DSM16275株（PseudomonasmarginalisDSM16275）使用包含甘油0.2质量%、柠檬酸0.05质量%、酵母提取物0.15%、磷酸二氢钾0.3质量%、磷酸氢二钾0.7质量%、硫酸铁0.0004质量%、硫酸锰0.01质量%、甲脲1.25质量%、氯化钴0.001质量%的培养基（pH7.0）进行需氧培养。
保存用菌体悬浮液的制备
将培养后的微生物菌体通过离心分离（12000rpm、20分钟）进行回收后，使用0.1%丙烯酸钠水溶液（pH7.0）进行洗涤。向洗涤后的菌体中添加上述水溶液而得到菌体悬浮液(以干燥菌体计为10质量%)。
将通过上述方法制备的菌体悬浮液100mL（实施例4）以及80mL（比较例3）加入至总容积120mL的聚乙烯制容器中并密封，在30℃下以120rpm振荡1周。
腈水合酶活性的测定
就腈水合酶活性而言，使用通过上述方法刚刚制备的菌体悬浮液、制备后振荡7天的悬浮液，采用与实施例1相同的方法进行测定。以下，将以第0天时的反应速度为1的相对反应速度示于表3中。
[表3]
液量 容器上部的气相部分 第0天 第7天
实施例4 100mL 17% 1.0 1.0
比较例3 80mL 33% 1.0 0.8
由上述实施例1、2、3以及4的结果可知，使用本发明的运输方法运输具有腈水合酶活性的微生物菌体时，微生物菌体以将腈水合酶活性维持在与保存前相同程度的状态得到保存。
产业上的可利用性
本发明提供能够满足工业生产的微生物菌体的保存方法。根据本发明，能够在室温下、无搅拌的情况下在维持腈水合酶等的酶活性的状态下保存和运输大量的菌体，能够将现有的保存方法中需要的劳动力、冷却成本大幅地削减，因此本发明的方法是极其有用的。
保藏号
紫红红球菌J-1株（RhodococcusrhodochrousJ-1）：以保藏号（accessionnumber）“FERMBP－1478”于1987年9月18日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心（茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6）。
边缘假单胞菌DSM16275株（PseudomonasmarginalisDSM16275）：以保藏号“DSM16275”于2004年3月4日保藏于德国微生物菌种保藏中心（DSMZ，DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen，）。
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序列号7：合成DNA
序列号8：合成DNA
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Claims (5)

1.一种在能够密闭的容器内保存具有腈水合酶活性的微生物菌体的方法，其特征在于，使填充有包含所述微生物菌体和有机酸的悬浮液的所述容器内的气相部分占容器内部总容积的2％以上且20％以下，
所述悬浮液的分散介质为有机酸水溶液，所述有机酸水溶液的有机酸浓度为10～100mmol/L，
所述微生物菌体为选自红球菌属、戈登菌属、假单胞菌属、假诺卡氏菌属、嗜热菌属的至少一种。
2.一种使用能够密闭的容器运输具有腈水合酶活性的微生物菌体的方法，其特征在于，使填充有包含所述微生物菌体和有机酸的悬浮液的所述容器内的气相部分占容器内部总容积的2％以上且20％以下，
所述悬浮液的分散介质为有机酸水溶液，所述有机酸水溶液的有机酸浓度为10～100mmol/L，
所述微生物菌体为选自红球菌属、戈登菌属、假单胞菌属、假诺卡氏菌属、嗜热菌属的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述容器内的气相部分的比例为5％以上且20％以下。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述保存或运输的温度为冰点～35℃的温度。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述有机酸为丙烯酸。
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