JP2003325172A - ニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍方法 - Google Patents
ニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】活性の高いニトリルヒドラターゼまたはニトリ
ルヒドラターゼの状態が精製酵素、粗精製酵素、酵素を
含む微生物菌体、酵素または酵素を含む微生物の固定化
物、酵素を含む微生物を含む培養液である凍結体の失活
の少ない工業的な解凍方法を提供する。 【解決手段】本発明者らは、活性の高いニトリルヒドラ
ターゼを含む精製酵素、粗精製酵素、酵素を含む微生物
菌体、酵素または酵素を含む微生物の固定化物、酵素を
含む微生物を含む培養液の凍結体であるところの安定な
解凍方法において解凍浴槽温度を５〜２５℃に制御する
ことにより、活性の低下が少なく安定的に凍結体を解凍
する方法を見出した。さらに凍結解凍を促進する為、解
凍時に振とうすることにより、大幅に解凍時間を短縮す
ることが可能となった。
ルヒドラターゼの状態が精製酵素、粗精製酵素、酵素を
含む微生物菌体、酵素または酵素を含む微生物の固定化
物、酵素を含む微生物を含む培養液である凍結体の失活
の少ない工業的な解凍方法を提供する。 【解決手段】本発明者らは、活性の高いニトリルヒドラ
ターゼを含む精製酵素、粗精製酵素、酵素を含む微生物
菌体、酵素または酵素を含む微生物の固定化物、酵素を
含む微生物を含む培養液の凍結体であるところの安定な
解凍方法において解凍浴槽温度を５〜２５℃に制御する
ことにより、活性の低下が少なく安定的に凍結体を解凍
する方法を見出した。さらに凍結解凍を促進する為、解
凍時に振とうすることにより、大幅に解凍時間を短縮す
ることが可能となった。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はアクリルアマイドの
生産等、工業的に有用であるニトリルヒドラターゼ凍結
体の解凍方法に関するものである。
生産等、工業的に有用であるニトリルヒドラターゼ凍結
体の解凍方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、酵素は一般に−２０℃以下の冷凍
庫やディープフリーザーにより凍結保存することが良く
用いられる。また、酵素の凍結保存の形態は一般的に
は、アンプルや培養液もしくは集菌液の状態で凍結され
ている。このように凍結されている酵素は、必要なとき
に解凍して各種酵素反応に用いられる。この解凍におい
て重要なことは速やかに解凍することである解凍に時間
がかかりすぎると酵素へのダメージが大きく、酵素が失
活する。また、解凍時に温度を上げすぎると酵素が失活
する可能性もある。
庫やディープフリーザーにより凍結保存することが良く
用いられる。また、酵素の凍結保存の形態は一般的に
は、アンプルや培養液もしくは集菌液の状態で凍結され
ている。このように凍結されている酵素は、必要なとき
に解凍して各種酵素反応に用いられる。この解凍におい
て重要なことは速やかに解凍することである解凍に時間
がかかりすぎると酵素へのダメージが大きく、酵素が失
活する。また、解凍時に温度を上げすぎると酵素が失活
する可能性もある。
【０００３】また解凍の前後での酵素活性の低下度は２
０％以下が好ましいとされ、さらに好ましくは限りなく
０％に近いことが良いとされる（ここで言う活性とは、
実施例記載の方法で測定したニトリルの水和活性であ
る。）。一般的には、室温で自然解凍する方法がとられ
ているが、酵素を工業的に大量使用する際の解凍方法
は、ほとんど知られていない。
０％以下が好ましいとされ、さらに好ましくは限りなく
０％に近いことが良いとされる（ここで言う活性とは、
実施例記載の方法で測定したニトリルの水和活性であ
る。）。一般的には、室温で自然解凍する方法がとられ
ているが、酵素を工業的に大量使用する際の解凍方法
は、ほとんど知られていない。
【０００４】また、ニトリルヒドラターゼまたはニトリ
ルヒドラターゼの状態が精製酵素、粗精製酵素、酵素を
含む微生物菌体、酵素または酵素を含む微生物の固定化
物、酵素を含む微生物を含む培養液のいずれかである解
凍方法は知られていない。
ルヒドラターゼの状態が精製酵素、粗精製酵素、酵素を
含む微生物菌体、酵素または酵素を含む微生物の固定化
物、酵素を含む微生物を含む培養液のいずれかである解
凍方法は知られていない。
【０００５】最近になって、特開平２００２―６５２５
１に示されているように動物細胞の解凍に定温エアーを
用いる方法や、特開平５−３１６９２６、特開平６−１
７４２３８などのようにマイクロ波などを用いる方法が
とられている。しかし、いずれも工業的な酵素利用を考
えると特殊な装置でかつ大掛かりになり、設備費が高騰
すると考えられる。
１に示されているように動物細胞の解凍に定温エアーを
用いる方法や、特開平５−３１６９２６、特開平６−１
７４２３８などのようにマイクロ波などを用いる方法が
とられている。しかし、いずれも工業的な酵素利用を考
えると特殊な装置でかつ大掛かりになり、設備費が高騰
すると考えられる。
【０００６】さらに、凍結体を解凍する際には、より低
温であることが望ましい一方、温度を下げることによ
り、工業的に酵素を解凍する際の解凍時間が増大し、そ
の解凍施設の製作費用および温度を保持する維持費用
が、温度を下げるとともに飛躍的に増大する。したがっ
て、安定でより高い温度で酵素を解凍することが経済的
により望ましい。
温であることが望ましい一方、温度を下げることによ
り、工業的に酵素を解凍する際の解凍時間が増大し、そ
の解凍施設の製作費用および温度を保持する維持費用
が、温度を下げるとともに飛躍的に増大する。したがっ
て、安定でより高い温度で酵素を解凍することが経済的
により望ましい。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、活性
の高いニトリルヒドラターゼまたはニトリルヒドラター
ゼの状態が精製酵素、粗精製酵素、酵素を含む微生物菌
体、酵素または酵素を含む微生物の固定化物、酵素を含
む微生物を含む培養液である凍結体の失活の少ない工業
的な解凍方法を提供することである。
の高いニトリルヒドラターゼまたはニトリルヒドラター
ゼの状態が精製酵素、粗精製酵素、酵素を含む微生物菌
体、酵素または酵素を含む微生物の固定化物、酵素を含
む微生物を含む培養液である凍結体の失活の少ない工業
的な解凍方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】即ち本発明は、ニトリル
ヒドラターゼ凍結体を解凍する際に、解凍浴槽水温を５
〜２５℃とすることを特徴とするニトリルヒドラターゼ
凍結体の解凍方法に関するものである。解凍時には振と
うしながら、特に往復運動をしながら溶解すると効果的
である。
ヒドラターゼ凍結体を解凍する際に、解凍浴槽水温を５
〜２５℃とすることを特徴とするニトリルヒドラターゼ
凍結体の解凍方法に関するものである。解凍時には振と
うしながら、特に往復運動をしながら溶解すると効果的
である。
【０００９】前記ニトリルヒドラターゼ凍結体は通常、
精製酵素、粗精製酵素、酵素を含む微生物菌体、酵素ま
たは酵素を含む微生物の固定化物、および酵素を含む微
生物を含む培養液からなる群から選ばれる少なくとも１
種の凍結体である。前記微生物は、好ましくは遺伝子組
換え微生物であり、さらには大腸菌であることが好まし
い。
精製酵素、粗精製酵素、酵素を含む微生物菌体、酵素ま
たは酵素を含む微生物の固定化物、および酵素を含む微
生物を含む培養液からなる群から選ばれる少なくとも１
種の凍結体である。前記微生物は、好ましくは遺伝子組
換え微生物であり、さらには大腸菌であることが好まし
い。
【００１０】また本発明は、前記遺伝子組換え大腸菌の
宿主が、Escherichia coli K−１２由来のＷ３１１０株
（ＡＴＣＣ２７３２５）、ＨＢ１０１株（ＡＴＣＣ３３
６９４）、ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５３２２３）および
ＷＡ８０２株（ＡＴＣＣ３３５２６）からなる群から選
ばれる少なくとも1種であることを特徴とするニトリル
ヒドラターゼ凍結体の解凍方法を提供する。
宿主が、Escherichia coli K−１２由来のＷ３１１０株
（ＡＴＣＣ２７３２５）、ＨＢ１０１株（ＡＴＣＣ３３
６９４）、ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５３２２３）および
ＷＡ８０２株（ＡＴＣＣ３３５２６）からなる群から選
ばれる少なくとも1種であることを特徴とするニトリル
ヒドラターゼ凍結体の解凍方法を提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明で述べられているニトリル
ヒドラターゼの状態は精製酵素、粗精製酵素、酵素を含
む微生物菌体、酵素または酵素を含む微生物の固定化
物、酵素を含む微生物を含む培養液である。また、これ
らの状態のニトリルヒドラターゼを凍結保存する前に熱
処理した場合も本発明に含まれる。
ヒドラターゼの状態は精製酵素、粗精製酵素、酵素を含
む微生物菌体、酵素または酵素を含む微生物の固定化
物、酵素を含む微生物を含む培養液である。また、これ
らの状態のニトリルヒドラターゼを凍結保存する前に熱
処理した場合も本発明に含まれる。
【００１２】さらに本発明の微生物は、目的とする酵素
触媒を生産し菌体内に蓄積または菌体外に分泌する性質
を有しており、この微生物には自然界より単離された微
生物も遺伝子組換え微生物も含まれる。
触媒を生産し菌体内に蓄積または菌体外に分泌する性質
を有しており、この微生物には自然界より単離された微
生物も遺伝子組換え微生物も含まれる。
【００１３】ニトリルヒドラターゼを産生する微生物の
具体例としては、シュードノカルディア・サーモフィラ
ＪＣＭ３０９５、アクロモバクター・キセロシス(Achro
mobacter xerosis)ＩＦＯ１２６６８等を挙げることが
できる。また該微生物よりクローニングしたニトリルヒ
ドラターゼ遺伝子を、任意の宿主で発現させた形質転換
体も含まれる。ここでいう任意の宿主としては、大腸菌
（Escherichia coli）の他、枯草菌(Bacillus subtili
s)等のバチルス属、酵母や放線菌等が挙げられる。遺伝
子組換替え大腸菌の宿主としては、例えばEscherichia
coli K-12由来Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ27325）、同ＨＢ
101株（ＡＴＣＣ33694）,同ＪＭ109株（ＡＴＣＣ5322
3）,同ＷＡ802株（ＡＴＣＣ33526）株を挙げることがで
きる。
具体例としては、シュードノカルディア・サーモフィラ
ＪＣＭ３０９５、アクロモバクター・キセロシス(Achro
mobacter xerosis)ＩＦＯ１２６６８等を挙げることが
できる。また該微生物よりクローニングしたニトリルヒ
ドラターゼ遺伝子を、任意の宿主で発現させた形質転換
体も含まれる。ここでいう任意の宿主としては、大腸菌
（Escherichia coli）の他、枯草菌(Bacillus subtili
s)等のバチルス属、酵母や放線菌等が挙げられる。遺伝
子組換替え大腸菌の宿主としては、例えばEscherichia
coli K-12由来Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ27325）、同ＨＢ
101株（ＡＴＣＣ33694）,同ＪＭ109株（ＡＴＣＣ5322
3）,同ＷＡ802株（ＡＴＣＣ33526）株を挙げることがで
きる。
【００１４】また、組換えＤＮＡ技術を用いて該タンパ
ク質の構成アミノ酸の1個または2個以上を他のアミノ酸
で置換、欠失、削除もしくは挿入することにより、薬剤
耐性、温度耐性等を更に向上させた変異型のニトリルヒ
ドラターゼを発現させた形質転換体も本発明の微生物に
含まれる。
ク質の構成アミノ酸の1個または2個以上を他のアミノ酸
で置換、欠失、削除もしくは挿入することにより、薬剤
耐性、温度耐性等を更に向上させた変異型のニトリルヒ
ドラターゼを発現させた形質転換体も本発明の微生物に
含まれる。
【００１５】本発明の微生物は通常、分子生物学、生物
工学、遺伝子工学の分野において、公知の一般的な方法
を利用して調製される。例えば、ＬＢ培地やＭ９培地等
の通常液体培地に該微生物を植菌した後、適当な培養温
度（一般的には３０〜５０℃であるが、好熱菌の場合は
５０℃以上でもよい。）で生育させることにより得られ
る。
工学、遺伝子工学の分野において、公知の一般的な方法
を利用して調製される。例えば、ＬＢ培地やＭ９培地等
の通常液体培地に該微生物を植菌した後、適当な培養温
度（一般的には３０〜５０℃であるが、好熱菌の場合は
５０℃以上でもよい。）で生育させることにより得られ
る。
【００１６】本発明による酵素または酵素を含む微生物
の固定化物とは、通常よく知られている、固定化酵素，
固定化微生物の調整方法により調製される酵素または酵
素を含む微生物の固定化物であり、その例としてはポリ
アクリルアミド、アルギン酸、κ―カラギーナンで固定
化した酵素または酵素を含む微生物等が挙げられる。
の固定化物とは、通常よく知られている、固定化酵素，
固定化微生物の調整方法により調製される酵素または酵
素を含む微生物の固定化物であり、その例としてはポリ
アクリルアミド、アルギン酸、κ―カラギーナンで固定
化した酵素または酵素を含む微生物等が挙げられる。
【００１７】本発明の凍結解凍する浴槽温度は、通常は
５０％以上、好ましくは９０％以上容器を漬けた段階
で、解凍浴槽温度を５〜２５℃、より望ましくは１０〜
２０℃であることを特徴とする。また本発明は、安定化
剤を積極的に添加せずとも安定的に解凍する方法ではあ
るが、還元剤、酵素の基質、生成物等の安定化剤を添加
しても良い。ｐＨについては特に制限はないがｐＨ4〜
１０、より望ましくはｐＨ６〜８であれば良い。
５０％以上、好ましくは９０％以上容器を漬けた段階
で、解凍浴槽温度を５〜２５℃、より望ましくは１０〜
２０℃であることを特徴とする。また本発明は、安定化
剤を積極的に添加せずとも安定的に解凍する方法ではあ
るが、還元剤、酵素の基質、生成物等の安定化剤を添加
しても良い。ｐＨについては特に制限はないがｐＨ4〜
１０、より望ましくはｐＨ６〜８であれば良い。
【００１８】本発明の凍結解凍時には、効率的に解凍が
行われるように振とうを加えるのが好ましい。振とう
は、容器を固定した台（ターンテーブル）にモーターを
取り付けたものを用意し、モーターを動かし、ターンテ
ーブルを動かす構造のものである。振とう条件は、往復
運動を伴うものが望ましい。
行われるように振とうを加えるのが好ましい。振とう
は、容器を固定した台（ターンテーブル）にモーターを
取り付けたものを用意し、モーターを動かし、ターンテ
ーブルを動かす構造のものである。振とう条件は、往復
運動を伴うものが望ましい。
【００１９】ここでの往復運動は、振幅７０ｍｍ時に１
往復／分（１分間に1回直線で７０ｍｍ動いて戻ってく
ることを言う）以上であれば良いが、極端に振とう数を
上げると容器の転倒や破損、装置の異常振動等を引き起
こす可能性があるので２００往復／分（振幅７０ｍｍ
時）以下が望ましい。
往復／分（１分間に1回直線で７０ｍｍ動いて戻ってく
ることを言う）以上であれば良いが、極端に振とう数を
上げると容器の転倒や破損、装置の異常振動等を引き起
こす可能性があるので２００往復／分（振幅７０ｍｍ
時）以下が望ましい。
【００２０】また、容器の往復運動の運動距離（振幅）
は、７０ｍｍ程度が好ましいが、これに限定されるもの
ではない。また容器の運動に円もしくは８の字のような
回転運動を加えたものでもかまわない。
は、７０ｍｍ程度が好ましいが、これに限定されるもの
ではない。また容器の運動に円もしくは８の字のような
回転運動を加えたものでもかまわない。
【００２１】
【実施例】以下、実施例により本発明の解凍方法を更に
詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定される
ものではない。
詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定される
ものではない。
【００２２】（実施例１）本実施例に使用する酵素触媒
はニトリルヒドラターゼ遺伝子が大腸菌ＨＢ１０１株に
導入され、三井化学株式会社が寄託しているＭＴ−１０
８２２株（ＦＥＲＭ ＢＰ―５７８５、特開平１１−２
５３１６８号公報参照）を用いた。
はニトリルヒドラターゼ遺伝子が大腸菌ＨＢ１０１株に
導入され、三井化学株式会社が寄託しているＭＴ−１０
８２２株（ＦＥＲＭ ＢＰ―５７８５、特開平１１−２
５３１６８号公報参照）を用いた。
【００２３】本菌株の培養は３０Ｌの培養槽に下記の組
成の培地１５．０Ｌを調製し、１２１℃・２０分間の高
圧蒸気により滅菌した。この培地に終濃度が５０μｇ／
ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、上記菌株
を一白金耳植菌し、３７℃・７００ｒｐｍにて２０時間
培養した。また、この際、培養開始約１５時間後にＩＰ
ＴＧ（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）を終濃
度１００μmol/Ｌになるよう添加し培養する。
成の培地１５．０Ｌを調製し、１２１℃・２０分間の高
圧蒸気により滅菌した。この培地に終濃度が５０μｇ／
ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、上記菌株
を一白金耳植菌し、３７℃・７００ｒｐｍにて２０時間
培養した。また、この際、培養開始約１５時間後にＩＰ
ＴＧ（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）を終濃
度１００μmol/Ｌになるよう添加し培養する。
【００２４】
（培地組成） 酵母エキストラクト ５．０ｇ／Ｌ
ポリペプトン １０．０ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ ５．０ｇ／Ｌ
塩化コバルト・六水和物 １０．０ｍｇ／Ｌ
硫酸第二鉄・七水和物 ４０．０ｍｇ／Ｌ
ｐＨ７．５
【００２５】培養終了後、遠心分離（１５０００Ｇ×１
５分間）により菌体のみを培養液より分離し、分離した
液に流動性を持たせるため固形分率が約１５重量％とな
るように集菌時の上澄み液を加えて湿菌体（以下集菌
液）を得た。この一部をサンプリングし下記方法にて酵
素活性測定した。
５分間）により菌体のみを培養液より分離し、分離した
液に流動性を持たせるため固形分率が約１５重量％とな
るように集菌時の上澄み液を加えて湿菌体（以下集菌
液）を得た。この一部をサンプリングし下記方法にて酵
素活性測定した。
【００２６】次に集菌液を２０Ｌのポリプロプレン製の
容器（縦３０×横３０×高さ４５ｃｍ）に１８Ｋｇずつ
充填し、−２５℃の各温度の冷凍庫にて凍結し、完全に
凍結したのを確認した後、各容器を解凍浴槽（縦５０×
横５０×高さ５０ｃｍ）に入れ、恒温水循環装置で解凍
槽内が２５℃の一定水温になるように調節しながら解凍
した。ここでいう解凍終了とは、解凍容器表面の氷の塊
（２ｍｍ）以上が無くなった時を目視で確認して解凍終
了と定義した。
容器（縦３０×横３０×高さ４５ｃｍ）に１８Ｋｇずつ
充填し、−２５℃の各温度の冷凍庫にて凍結し、完全に
凍結したのを確認した後、各容器を解凍浴槽（縦５０×
横５０×高さ５０ｃｍ）に入れ、恒温水循環装置で解凍
槽内が２５℃の一定水温になるように調節しながら解凍
した。ここでいう解凍終了とは、解凍容器表面の氷の塊
（２ｍｍ）以上が無くなった時を目視で確認して解凍終
了と定義した。
【００２７】次に各容器より解凍集菌液のサンプリング
を実施し、その活性を測定した。次式、活性残存率
（％）＝（凍結溶解後の活性／凍結前の活性）×１００
にて活性残存率を求めた。その結果を表１に示す。
を実施し、その活性を測定した。次式、活性残存率
（％）＝（凍結溶解後の活性／凍結前の活性）×１００
にて活性残存率を求めた。その結果を表１に示す。
【００２８】（酵素活性測定方法）サンプリングした菌
体液それぞれの、酵素活性を以下の手順で測定する。各
画分液を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.5）に
より適当に希釈し、これに１重量％のアクリロニトリル
を添加して１０℃で１０分間反応させる。反応液にこれ
と等量の１Ｍリン酸水溶液を添加して反応を停止させ、
生成したアクリルアミド濃度を高速液体クロマトグラフ
ィー（以下、ＨＰＬＣと略）分析により測定する。ＨＰ
ＬＣカラムはＵＬＴＲＯＮ ８０ＨＧ（５０×８φｍ
ｍ）を用い、１０ｍＭリン酸水溶液を展開液として使用
する。アクリルアミドは２２０ｎｍの吸光度により検出
する。
体液それぞれの、酵素活性を以下の手順で測定する。各
画分液を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.5）に
より適当に希釈し、これに１重量％のアクリロニトリル
を添加して１０℃で１０分間反応させる。反応液にこれ
と等量の１Ｍリン酸水溶液を添加して反応を停止させ、
生成したアクリルアミド濃度を高速液体クロマトグラフ
ィー（以下、ＨＰＬＣと略）分析により測定する。ＨＰ
ＬＣカラムはＵＬＴＲＯＮ ８０ＨＧ（５０×８φｍ
ｍ）を用い、１０ｍＭリン酸水溶液を展開液として使用
する。アクリルアミドは２２０ｎｍの吸光度により検出
する。
【００２９】（実施例２〜５、比較例１〜２）解凍時の
溶解槽温度を変化させながら、振とうさせずに残存活性
と解凍時間を（実施例１）記載の方法で測定した。その
結果を表１に示す。
溶解槽温度を変化させながら、振とうさせずに残存活性
と解凍時間を（実施例１）記載の方法で測定した。その
結果を表１に示す。
【００３０】実施例２ 解凍浴槽温度２０℃
実施例３ 解凍浴槽温度１５℃
実施例４ 解凍浴槽温度１０℃
実施例５ 解凍浴槽温度 ５℃
比較例１ 解凍浴槽温度３０℃
比較例２ 解凍浴槽温度 ０℃
【００３１】
【表１】表１．凍結解凍温度と活性残存率と解凍時間
（１８Ｋｇポリタンク解凍・振とうなし・循環水量２０
Ｌ/分）
Ｌ/分）
【００３２】（実施例６〜１０、比較例３〜４）振とう
させながら（７０rpm、振幅７０ｍｍ）解凍したこと以
外は前記実施例１〜５および比較例１〜２と同様の方法
で解凍を行った後、同様の方法で残存活性と解凍時間を
測定した。その結果を表２に示す。
させながら（７０rpm、振幅７０ｍｍ）解凍したこと以
外は前記実施例１〜５および比較例１〜２と同様の方法
で解凍を行った後、同様の方法で残存活性と解凍時間を
測定した。その結果を表２に示す。
【００３３】
【表２】
表２．凍結解凍温度と活性残存率と解凍時間
（１８Ｋｇポリタンク解凍・振とうあり（７０往復／
分）・循環水量２０Ｌ／分）
分）・循環水量２０Ｌ／分）
【００３４】（実施例１１〜１４）解凍時の振とう数を
表３のように変化させながら（振幅７０ｍｍ）解凍を行
った以外は、実施例７と同様の方法で解凍を行い、解凍
残存活性と解凍時間を測定した。結果を表３に示す。
表３のように変化させながら（振幅７０ｍｍ）解凍を行
った以外は、実施例７と同様の方法で解凍を行い、解凍
残存活性と解凍時間を測定した。結果を表３に示す。
【００３５】
【表３】表３．振とう数と解凍時間の関係
（１８Ｋｇポリタンク解凍・２０℃・循環水量２０Ｌ／
分・振幅７０ｍｍ）
分・振幅７０ｍｍ）
【００３６】
【発明の効果】本発明によれば、産業上有用な活性の高
いニトリルヒドラターゼまたはニトリルヒドラターゼの
状態が精製酵素、粗精製酵素、酵素を含む微生物菌体、
酵素または酵素を含む微生物の固定化物、酵素を含む微
生物を含む培養液であるところの解凍方法、特に凍結解
凍方法を提供することである。本発明はニトリルヒドラ
ターゼの産業上の利用において有用な解凍方法である。
いニトリルヒドラターゼまたはニトリルヒドラターゼの
状態が精製酵素、粗精製酵素、酵素を含む微生物菌体、
酵素または酵素を含む微生物の固定化物、酵素を含む微
生物を含む培養液であるところの解凍方法、特に凍結解
凍方法を提供することである。本発明はニトリルヒドラ
ターゼの産業上の利用において有用な解凍方法である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 有井 輝夫
千葉県茂原市東郷1900 三井化学株式会社
内
Ｆターム(参考） 4B050 CC03 CC10 DD02 EE01 FF20C
LL05
Claims (8)
- 【請求項１】ニトリルヒドラターゼ凍結体を解凍する際
に、解凍浴槽水温を５〜２５℃とすることを特徴とする
ニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍方法。 - 【請求項２】前記解凍浴槽水温が１０〜２０℃であるこ
とを特徴とする、請求項１に記載のニトリルヒドラター
ゼ凍結体の解凍方法。 - 【請求項３】ニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍時に振
とうしながら溶解することを特徴とする、請求項１また
は２に記載のニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍方法。 - 【請求項４】振とうが往復運動であることを特徴とす
る、請求項３に記載のニトリルヒドラターゼ凍結体の解
凍方法。 - 【請求項５】前記ニトリルヒドラターゼ凍結体が、精製
酵素、粗精製酵素、酵素を含む微生物菌体、酵素または
酵素を含む微生物の固定化物、および酵素を含む微生物
を含む培養液からなる群から選ばれる少なくとも１種の
凍結体であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれ
かに記載のニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍方法。 - 【請求項６】前記微生物が遺伝子組換え微生物であるこ
とを特徴とする、請求項５に記載のニトリルヒドラター
ゼ凍結体の解凍方法。 - 【請求項７】遺伝子組換え微生物が遺伝子組換え大腸菌
であることを特徴とする、請求項６に記載のニトリルヒ
ドラターゼ凍結体の解凍方法。 - 【請求項８】遺伝子組換え大腸菌の宿主が、Escherichi
a coli K−１２由来のＷ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２
５）、ＨＢ１０１株（ＡＴＣＣ３３６９４）、ＪＭ１０
９株（ＡＴＣＣ５３２２３）およびＷＡ８０２株（ＡＴ
ＣＣ３３５２６）からなる群から選ばれる少なくとも1
種であることを特徴とする、請求項７に記載のニトリル
ヒドラターゼ凍結体の解凍方法。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP2002138141A JP2003325172A (ja) | 2002-05-14 | 2002-05-14 | ニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002138141A JP2003325172A (ja) | 2002-05-14 | 2002-05-14 | ニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003325172A true JP2003325172A (ja) | 2003-11-18 |
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|---|---|---|---|
| JP2002138141A Pending JP2003325172A (ja) | 2002-05-14 | 2002-05-14 | ニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003325172A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012096361A1 (ja) * | 2011-01-14 | 2012-07-19 | ダイヤニトリックス株式会社 | 微生物菌体の輸送方法 |
-
2002
- 2002-05-14 JP JP2002138141A patent/JP2003325172A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012096361A1 (ja) * | 2011-01-14 | 2012-07-19 | ダイヤニトリックス株式会社 | 微生物菌体の輸送方法 |
| CN103620030A (zh) * | 2011-01-14 | 2014-03-05 | 三菱丽阳株式会社 | 微生物菌体的运输方法 |
| JP5880447B2 (ja) * | 2011-01-14 | 2016-03-09 | 三菱レイヨン株式会社 | 微生物菌体の輸送方法 |
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