JP2005295815A - ニトリルヒドラターゼの安定化または活性化方法 - Google Patents
ニトリルヒドラターゼの安定化または活性化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005295815A JP2005295815A JP2004112726A JP2004112726A JP2005295815A JP 2005295815 A JP2005295815 A JP 2005295815A JP 2004112726 A JP2004112726 A JP 2004112726A JP 2004112726 A JP2004112726 A JP 2004112726A JP 2005295815 A JP2005295815 A JP 2005295815A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nitrile hydratase
- activity
- hydratase activity
- cells
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
【課題】ニトリルヒドラターゼ遺伝子を形質発現した細胞、または細胞処理液のニトリルヒドラターゼ活性の経時的な低下に対する安定化または活性化により、高活性なアミド化合物生産用菌体触媒を製造する方法を提供する。
【解決手段】ニトリルヒドラターゼ遺伝子を形質発現し、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞、または細胞処理液に特定の代謝阻害剤を接触させることによりニトリルヒドラターゼ活性を安定化、または活性化する。
【選択図】なし
【解決手段】ニトリルヒドラターゼ遺伝子を形質発現し、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞、または細胞処理液に特定の代謝阻害剤を接触させることによりニトリルヒドラターゼ活性を安定化、または活性化する。
【選択図】なし
Description
本発明は、ニトリル化合物からアミド化合物の製造に有用なニトリルヒドラターゼの活性を安定化または活性化する方法に関するものである。
ニトリルヒドラターゼはニトリル化合物からアミド化合物を得る酵素として工業的に利用されている。ニトリルヒドラターゼは該酵素を含有する微生物菌体として使用される例が多い。また、遺伝子工学技術により該酵素を細胞内に高発現した組換え微生物が利用されている。これらの組換え微生物は、適量の酸素、糖、有機物、無機塩などを原料として増殖され、該酵素を細胞内に多量蓄積させる。このようにして得られた細胞はそのまま、または適当な処理を施した後に触媒として用いられるが、処理の過程や反応に使用するまでの保存中にニトリルヒドラターゼ活性が低下してしまうことが問題であった。ニトリルヒドラターゼの活性維持の方法としては、有機溶媒により細胞を処理する方法(特開平5−308980号公報)、アクリル酸により細胞を洗浄する方法(特開2002−281994号公報)、またはニトリル類、アミド類、および有機酸またはその塩類を細胞を含む媒体へ添加する方法(特公平5−43351号公報)などが開示されている。これらの方法は活性低下の抑制に対しては効果を示すものの、一旦低下したニトリルヒドラターゼ活性を優位に向上させることはできず、ニトリルヒドラターゼの活性を安定化または活性化するためのより有効な方法が望まれていた。
本発明の課題はニトリルヒドラターゼ遺伝子が形質転換された細胞または細胞処理液のニトリルヒドラターゼ活性を安定化または活性化することにより、高活性なアミド化合物生産用菌体触媒を提供することにある。
発明者らは上述の課題を解決すべく鋭意検討した結果、ニトリルヒドラターゼの経時的な活性低下の原因の一つは、該酵素を含有する細胞の代謝状態の変化に関連があることを見出し、代謝阻害剤または糖取り込み阻害剤により代謝状態の変化による活性低下を抑制することでニトリルヒドラターゼ活性の安定化または活性化を可能とすることで本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下の[1]〜[16]に記載のとおりである。
[1]ニトリルヒドラターゼ遺伝子が形質転換され、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞またはその処理物の懸濁液に、TCA回路における代謝を阻害する、または電子伝達系における代謝を阻害する代謝阻害剤を添加することを特徴とするニトリルヒドラターゼ活性の安定化方法。
[2]ニトリルヒドラターゼ遺伝子が形質転換され、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞の懸濁液に、該細胞が資化しうる糖の取り込みを阻害する糖取り込み阻害剤を添加することを特徴とするニトリルヒドラターゼ活性の安定化方法。
[3]ニトリルヒドラターゼ遺伝子が形質転換され、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞が、該細胞が資化しうる糖を断続的もしくは連続的に流加する培養条件により得られ
たものである[1]又は[2]に記載のニトリルヒドラターゼ活性の安定化方法。
[4]ニトリルヒドラターゼ遺伝子が形質転換され、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞が、大腸菌K−12株由来である[1]〜[3]のいずれか一項に記載のニトリルヒドラターゼ活性の安定化方法。
[5]代謝阻害剤が無機アジ化化合物である[1]、[3]、および[4]のいずれか一項に記載のニトリルヒドラターゼ活性の安定化方法。
[6]ニトリルヒドラターゼ遺伝子が形質転換され、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞またはその処理物の懸濁液に添加する無機アジ化化合物の濃度が10μM〜10mMの範囲である[5]に記載のニトリルヒドラターゼ活性の安定化方法。
[7]糖取り込み阻害剤がフロレチンである[2]〜[4]のいずれか一項に記載のニトリルヒドラターゼ活性の安定化方法。
[8]ニトリルヒドラターゼ遺伝子が形質転換され、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞の懸濁液に添加するフロレチンの濃度が300μM〜300mMの範囲である[7]に記載のニトリルヒドラターゼ活性の安定化方法。
[9]ニトリルヒドラターゼ遺伝子が配列番号1および配列番号2に示されたアミノ酸配列、または配列番号1および配列番号2に示されたアミノ酸配列のうち、1ないし数個のアミノ酸が欠失、または他のアミノ酸残基に置換され、或いは他のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるニトリルヒドラタ−ゼである[1]〜[8]のいずれか一項に記載のニトリルヒドラターゼ活性の安定化方法。
[10]ニトリルヒドラターゼ遺伝子が形質転換され、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞またはその処理物の懸濁液に、TCA回路における代謝を阻害する、または電子伝達系における代謝を阻害する代謝阻害剤を添加することを特徴とするニトリルヒドラターゼ活性の活性化方法。
[11]ニトリルヒドラターゼ遺伝子が形質転換され、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞が、該細胞が資化しうる糖を断続的もしくは連続的に流加する培養条件により得られたものである[10]に記載のニトリルヒドラターゼ活性の活性化方法。
[12]ニトリルヒドラターゼ遺伝子が形質転換され、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞が、大腸菌K−12株由来である[10]又は[11]に記載のニトリルヒドラターゼ活性の活性化方法。
[13]代謝阻害剤が無機アジ化化合物である[10]〜[12]のいずれか一項に記載のニトリルヒドラターゼ活性の活性化方法。
[14]ニトリルヒドラターゼ遺伝子が形質転換され、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞またはその処理物の懸濁液に添加する無機アジ化化合物の濃度が10μM〜10mMの範囲である[13]に記載のニトリルヒドラターゼ活性の活性化方法。
[15]ニトリルヒドラターゼ遺伝子が配列番号1および配列番号2に示されたアミノ酸配列、または配列番号1および配列番号2に示されたアミノ酸配列のうち、1ないし数個のアミノ酸が欠失、または他のアミノ酸残基に置換され、或いは他のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるニトリルヒドラタ−ゼである[10]〜[14]のいずれか一項に記載のニトリルヒドラターゼ活性の活性化方法。
[16][1]〜[15]のいずれか一項に記載の方法により得られたニトリルヒドラターゼ活性を持つ細胞またはその処理物を用いてニトリル化合物からアミド化合物を製造する方法。
[1]ニトリルヒドラターゼ遺伝子が形質転換され、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞またはその処理物の懸濁液に、TCA回路における代謝を阻害する、または電子伝達系における代謝を阻害する代謝阻害剤を添加することを特徴とするニトリルヒドラターゼ活性の安定化方法。
[2]ニトリルヒドラターゼ遺伝子が形質転換され、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞の懸濁液に、該細胞が資化しうる糖の取り込みを阻害する糖取り込み阻害剤を添加することを特徴とするニトリルヒドラターゼ活性の安定化方法。
[3]ニトリルヒドラターゼ遺伝子が形質転換され、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞が、該細胞が資化しうる糖を断続的もしくは連続的に流加する培養条件により得られ
たものである[1]又は[2]に記載のニトリルヒドラターゼ活性の安定化方法。
[4]ニトリルヒドラターゼ遺伝子が形質転換され、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞が、大腸菌K−12株由来である[1]〜[3]のいずれか一項に記載のニトリルヒドラターゼ活性の安定化方法。
[5]代謝阻害剤が無機アジ化化合物である[1]、[3]、および[4]のいずれか一項に記載のニトリルヒドラターゼ活性の安定化方法。
[6]ニトリルヒドラターゼ遺伝子が形質転換され、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞またはその処理物の懸濁液に添加する無機アジ化化合物の濃度が10μM〜10mMの範囲である[5]に記載のニトリルヒドラターゼ活性の安定化方法。
[7]糖取り込み阻害剤がフロレチンである[2]〜[4]のいずれか一項に記載のニトリルヒドラターゼ活性の安定化方法。
[8]ニトリルヒドラターゼ遺伝子が形質転換され、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞の懸濁液に添加するフロレチンの濃度が300μM〜300mMの範囲である[7]に記載のニトリルヒドラターゼ活性の安定化方法。
[9]ニトリルヒドラターゼ遺伝子が配列番号1および配列番号2に示されたアミノ酸配列、または配列番号1および配列番号2に示されたアミノ酸配列のうち、1ないし数個のアミノ酸が欠失、または他のアミノ酸残基に置換され、或いは他のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるニトリルヒドラタ−ゼである[1]〜[8]のいずれか一項に記載のニトリルヒドラターゼ活性の安定化方法。
[10]ニトリルヒドラターゼ遺伝子が形質転換され、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞またはその処理物の懸濁液に、TCA回路における代謝を阻害する、または電子伝達系における代謝を阻害する代謝阻害剤を添加することを特徴とするニトリルヒドラターゼ活性の活性化方法。
[11]ニトリルヒドラターゼ遺伝子が形質転換され、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞が、該細胞が資化しうる糖を断続的もしくは連続的に流加する培養条件により得られたものである[10]に記載のニトリルヒドラターゼ活性の活性化方法。
[12]ニトリルヒドラターゼ遺伝子が形質転換され、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞が、大腸菌K−12株由来である[10]又は[11]に記載のニトリルヒドラターゼ活性の活性化方法。
[13]代謝阻害剤が無機アジ化化合物である[10]〜[12]のいずれか一項に記載のニトリルヒドラターゼ活性の活性化方法。
[14]ニトリルヒドラターゼ遺伝子が形質転換され、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞またはその処理物の懸濁液に添加する無機アジ化化合物の濃度が10μM〜10mMの範囲である[13]に記載のニトリルヒドラターゼ活性の活性化方法。
[15]ニトリルヒドラターゼ遺伝子が配列番号1および配列番号2に示されたアミノ酸配列、または配列番号1および配列番号2に示されたアミノ酸配列のうち、1ないし数個のアミノ酸が欠失、または他のアミノ酸残基に置換され、或いは他のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるニトリルヒドラタ−ゼである[10]〜[14]のいずれか一項に記載のニトリルヒドラターゼ活性の活性化方法。
[16][1]〜[15]のいずれか一項に記載の方法により得られたニトリルヒドラターゼ活性を持つ細胞またはその処理物を用いてニトリル化合物からアミド化合物を製造する方法。
本発明により、ニトリルヒドラターゼ遺伝子が形質転換され、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞またはその処理物のニトリルヒドラターゼ活性の安定化方法または活性化方法が提供される。この安定化及び活性化の効果は培養終了後の培養液に対してはもちろんのこと、培養液中の菌体を破砕等処理したもの、培養液、菌体、及び菌体の破砕物等の菌体処理物を凍結保存後に解凍したものに対しても同様に発揮される。
以上のことから、本発明によりニトリルヒドラターゼを含有する形質転換細胞のニトリルヒドラターゼ活性を安定化または活性化することにより、高活性なアミド化合物製造用菌体触媒が提供される。このことは菌体触媒を用いたニトリル化合物からアミド化合物の生産に好適である。
本発明におけるニトリルヒドラターゼとは、ニトリル化合物のニトリル基を水和して対応するアミド化合物に変換する酵素をいう。本発明のニトリルヒドラターゼ遺伝子とはニトリル水和活性を示す微生物よりクローニングされたニトリルヒドラターゼ遺伝子であれば特に限定されない。例えばシュードノカルディア・サーモフィラ(Pseudonocardia thermophila)JCM3095、アクロモバクター・キセロシス(Achromobacter xerosis)IFO12668、ロドコッカス ロドクロウス(Phodococcus phodochrous)J1よりクローニングされたニトリルヒドラターゼ遺伝子等を挙げることができる。シュードノカルディア・サーモフィラ(Pseudonocardia thermophila)JCM3095由来のニトリルヒドラターゼのα及びβサブユニットをコードする遺伝子を配列表の配列番号1及び2に記載してある。また、シュードノカルディア・サーモフィラJCM3095よりクローニングされたニトリルヒドラターゼ遺伝子がコードするアミノ酸配列のうち、1ないし数個のアミノ酸が欠失、または他のアミノ酸残基に置換され、或いは他のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列をコードするニトリルヒドラタ−ゼ遺伝子も本発明のニトリルヒドラターゼ遺伝子に含まれる。本発明における宿主は該遺伝子を形質発現可能な宿主であれば特に限定されない。例えば大腸菌K−12株由来の株が好ましく、W3110株(ATCC番号27325)、HB101株(ATCC番号33694)、JM109株(ATCC番号53323)、WA802株(ATCC番号33526)を挙げることができる。本発明における該遺伝子を該遺伝子が形質発現に必要な領域を有するプラスミドベクターに挿入して組換えプラスミドを構築する方法、および組換えプラスミドを所望の宿主に形質転換する方法としては、分子生物学・生物工学・遺伝子工学の分野における公知の一般的な方法を利用すればよい。
本発明のニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物は常法に従って個々の微生物に適した方法で培養すること可能であるが、炭素源として糖類、特にグルコースを使用することが望ましい。その他に使用する培地成分としては有機窒素源、無機窒素源、無機塩類、および緩衝液成分等が含まれる。炭素源としての糖の供給は一定量を連続的に添加する方法、もしくはニトリルヒドラターゼを含有する微生物の増殖状態に合わせて断続的に添加する方法が好適である。培養時は攪拌または振とうに加え、空気を供給し、増殖に十分な酸素濃度を保つことが望ましい。培地のpHは6.8〜8.0、好ましくは7.2〜7.6とするのがよい。培養温度は30〜37℃がよい。
本発明における細胞処理物とは例えば培養終了後の該細胞破砕物等のニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞構成成分に相当するものを指し、増殖能を失った状態でもよい。
本発明における細胞またはその処理物の懸濁液とは、培養液、培養後の細胞を一度集菌した後任意の水溶液などの任意の媒体に懸濁したもの、上記細胞破砕物を含む液体等を指す。
本発明における細胞またはその処理物の懸濁液とは、培養液、培養後の細胞を一度集菌した後任意の水溶液などの任意の媒体に懸濁したもの、上記細胞破砕物を含む液体等を指す。
ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞は培養終了後、すなわち培養時に必須とした酸素供給が停止した状態でも代謝活性を有しており、溶存する酸素を消費するため、該細胞懸濁液の溶存酸素濃度は速やかに低下する。溶存酸素濃度の低下に伴い該細胞の代謝は好気的代謝から嫌気的代謝へ変化すると考えられる。本発明で示すニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞は嫌気状態の継続により経時的にニトリルヒドラターゼ活性が低下する。本発明で使用する代謝阻害剤は、TCA回路、あるいは電子伝達系の代謝阻害剤であり、
無機アジ化化合物、無機シアン化化合物、オキサル酢酸、硫化ナトリウム、アデノシン三リン酸等を挙げることができる。中でも無機アジ化化合物は多くの酵素の阻害剤として既知であり、代謝阻害剤としても多岐にわたり利用されており、特にアジ化ナトリウムは好適である。作用濃度は10μM〜10mMがよい。糖取り込み阻害剤としては生細胞においてグルコースの取り込みを阻害する作用を有する物質が使用可能であり、フロレチン、フロリジン、コルヒチン、サイトカラシンB等を挙げることができるが、特にフロレチンが好適であり、作用濃度は300μM〜300mMがよい。本発明で使用可能な代謝阻害剤、および糖取り込み阻害剤はニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞から抽出、精製された該酵素に対してはそのニトリルヒドラターゼ活性に何ら影響を及ぼさない。
無機アジ化化合物、無機シアン化化合物、オキサル酢酸、硫化ナトリウム、アデノシン三リン酸等を挙げることができる。中でも無機アジ化化合物は多くの酵素の阻害剤として既知であり、代謝阻害剤としても多岐にわたり利用されており、特にアジ化ナトリウムは好適である。作用濃度は10μM〜10mMがよい。糖取り込み阻害剤としては生細胞においてグルコースの取り込みを阻害する作用を有する物質が使用可能であり、フロレチン、フロリジン、コルヒチン、サイトカラシンB等を挙げることができるが、特にフロレチンが好適であり、作用濃度は300μM〜300mMがよい。本発明で使用可能な代謝阻害剤、および糖取り込み阻害剤はニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞から抽出、精製された該酵素に対してはそのニトリルヒドラターゼ活性に何ら影響を及ぼさない。
本発明においてニトリル化合物の種類は該酵素によってアミド化合物に変換されるものであれば特に限定されない。具体的には炭素数が2〜20程度のニトリル化合物であり、脂肪族ニトリル、芳香族ニトリルなどが含まれる。中でもアクリロニトリル、およびメタクリロニトリル等が好適な例として挙げられる。
ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞の調製
本実施例ではニトリルヒドラターゼ遺伝子を大腸菌K−12株由来HB101株に形質導入した寄託微生物MT−10822(受託番号FERM BP−5785)をニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞として用いた。
当該生物は茨城県つくば市東1−1−1 中央第6にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成8年2月7日から上記受託番号にて寄託されている。
本実施例ではニトリルヒドラターゼ遺伝子を大腸菌K−12株由来HB101株に形質導入した寄託微生物MT−10822(受託番号FERM BP−5785)をニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞として用いた。
当該生物は茨城県つくば市東1−1−1 中央第6にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成8年2月7日から上記受託番号にて寄託されている。
高圧蒸気滅菌された0.1g/LのFeSO4、および0.05g/LのCoCl2を含むLB培地に0.1mg/Lとなるようにアンピシリンを添加した培地200mlに上述の菌株を一白菌耳植菌し、33℃にて培養した。菌体の濁度として660nmにおける吸光度が3.0〜6.0の範囲となった時点で、この培養液を高圧蒸気滅菌済みの表1に示す培地5Lに植菌し、33℃にて培養した。培養開始より培養液のpHを監視し、pHが7.45以上となったときに500g/Lのグルコースを30分間で15ml添加した。1.0vvmで空気を培養液内に通気しながら攪拌し、48時間の培養を行って培養液(細胞懸濁液)を得た。
アジ化ナトリウム、およびフロレチンによる活性維持
実施例1で得られた細胞懸濁液400mlを密閉可能な2つの1Lフラスコに移液し、一方にはアジ化ナトリウムを1mMとなるように、他方にはフロレチンを300μMとなるようにそれぞれ添加した。温度を20℃に保ち、400rpmで攪拌しながら窒素を200N−ml/minで通気、排気した。通気開始から0、3、6時間後に予め窒素で置換された密閉可能なガラス容器に該懸濁液の16mgを取り出し、あらかじめ脱酸素した純水で10gに希釈した。この希釈液1gをあらかじめ窒素で置換したガラス容器に取り出し、あらかじめ脱酸素した50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.1)で10gに希釈した。次いで脱酸素したアクリロニトリル3.2mlを添加して20℃に維持しながら15分間反応を行った。10mMリン酸水溶液を80g添加して反応を停止し、HPLC分析により反応液中のアクリルアミド濃度を測定した。HPLC分析におけるカラムとしてYMC−Pack ODS−A(150×6φmm)を使用し、3%アセトニトリルを含む10mMリン酸水溶液を移動層とした。アクリルアミドおよびアクリロニトリルは210nmの吸光度により検出し、濃度を測定した。次に該懸濁液の乾燥菌体重量濃度を求め、単位乾燥菌体重量当たりのアクリルアミド生成量を算出した。その結果、表2に示すように、0時間の生成量を1.00とすると3時間目から6時間目までを通してアクリルアミド生成量が維持されていることから、0時間の活性がそのまま維持され安定化していることがわかった。
実施例1で得られた細胞懸濁液400mlを密閉可能な2つの1Lフラスコに移液し、一方にはアジ化ナトリウムを1mMとなるように、他方にはフロレチンを300μMとなるようにそれぞれ添加した。温度を20℃に保ち、400rpmで攪拌しながら窒素を200N−ml/minで通気、排気した。通気開始から0、3、6時間後に予め窒素で置換された密閉可能なガラス容器に該懸濁液の16mgを取り出し、あらかじめ脱酸素した純水で10gに希釈した。この希釈液1gをあらかじめ窒素で置換したガラス容器に取り出し、あらかじめ脱酸素した50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.1)で10gに希釈した。次いで脱酸素したアクリロニトリル3.2mlを添加して20℃に維持しながら15分間反応を行った。10mMリン酸水溶液を80g添加して反応を停止し、HPLC分析により反応液中のアクリルアミド濃度を測定した。HPLC分析におけるカラムとしてYMC−Pack ODS−A(150×6φmm)を使用し、3%アセトニトリルを含む10mMリン酸水溶液を移動層とした。アクリルアミドおよびアクリロニトリルは210nmの吸光度により検出し、濃度を測定した。次に該懸濁液の乾燥菌体重量濃度を求め、単位乾燥菌体重量当たりのアクリルアミド生成量を算出した。その結果、表2に示すように、0時間の生成量を1.00とすると3時間目から6時間目までを通してアクリルアミド生成量が維持されていることから、0時間の活性がそのまま維持され安定化していることがわかった。
〔比較例1〕
実施例1で得られた細胞懸濁液を密閉可能な1Lフラスコに400ml移液し、温度を20℃に保ち、400rpmで攪拌しながら窒素を200N−ml/minで通気、排気した。通気開始から0、3、6時間後に実施例2と同様にして、該懸濁液の単位乾燥重量当たりのアクリルアミド生成量を求めた。表3に示すように、0時間のアクリルアミド生成量を1.00とするとアクリルアミド生成量が徐々に低下していた。
実施例1で得られた細胞懸濁液を密閉可能な1Lフラスコに400ml移液し、温度を20℃に保ち、400rpmで攪拌しながら窒素を200N−ml/minで通気、排気した。通気開始から0、3、6時間後に実施例2と同様にして、該懸濁液の単位乾燥重量当たりのアクリルアミド生成量を求めた。表3に示すように、0時間のアクリルアミド生成量を1.00とするとアクリルアミド生成量が徐々に低下していた。
アジ化ナトリウムによる活性回復、維持
実施例1で得られた細胞懸濁液を遠心分離により菌体を分離し、湿菌体を得た。この湿菌体は一旦、−20℃で凍結し、保管した。融解した湿菌体5.74gを密閉可能なガラス容器に取り出し、純水に懸濁した。1Mアジ化ナトリウム水溶液を終濃度が10μM、100μM、1mM、および10mMとなるように添加し、重量が30gとなるように純水で調製した。一方、アジ化ナトリウムを添加しない懸濁液も同様に調製した。温度を20℃に保ち、スターラーにより攪拌しながら窒素を約100N−ml/minで通気、排気した。通気開始から0、0.5、3時間後にあらかじめ窒素で置換された密閉可能なガラス容器に該懸濁液の22mgを取り出し、あらかじめ脱酸素した純水で10gに希釈した。この希釈液1gをあらかじめ窒素で置換したガラス容器に取り出し、あらかじめ脱酸素した50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.1)で10gに希釈した。脱酸素したアクリロニトリル3.2mlを添加して20℃に維持しながら15分間反応を行った。10mMリン酸水溶液を80g添加して反応を停止し、実施例2と同様にしてHPLC分析により反応液中のアクリルアミド濃度を測定した。次に該湿菌体の乾燥菌体重量濃度を求め、単位乾燥菌体重量当たりのアクリルアミド生成量を算出した。凍結前該湿菌体のアクリルアミド生成量を1とすると、図1に示すように、アジ化ナトリウムの添加によりアクリルアミド生成量が回復、維持された。その効果は濃度依存的であり、100μM以上では3時間で凍結以前と同等なレベルまで回復した。
実施例1で得られた細胞懸濁液を遠心分離により菌体を分離し、湿菌体を得た。この湿菌体は一旦、−20℃で凍結し、保管した。融解した湿菌体5.74gを密閉可能なガラス容器に取り出し、純水に懸濁した。1Mアジ化ナトリウム水溶液を終濃度が10μM、100μM、1mM、および10mMとなるように添加し、重量が30gとなるように純水で調製した。一方、アジ化ナトリウムを添加しない懸濁液も同様に調製した。温度を20℃に保ち、スターラーにより攪拌しながら窒素を約100N−ml/minで通気、排気した。通気開始から0、0.5、3時間後にあらかじめ窒素で置換された密閉可能なガラス容器に該懸濁液の22mgを取り出し、あらかじめ脱酸素した純水で10gに希釈した。この希釈液1gをあらかじめ窒素で置換したガラス容器に取り出し、あらかじめ脱酸素した50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.1)で10gに希釈した。脱酸素したアクリロニトリル3.2mlを添加して20℃に維持しながら15分間反応を行った。10mMリン酸水溶液を80g添加して反応を停止し、実施例2と同様にしてHPLC分析により反応液中のアクリルアミド濃度を測定した。次に該湿菌体の乾燥菌体重量濃度を求め、単位乾燥菌体重量当たりのアクリルアミド生成量を算出した。凍結前該湿菌体のアクリルアミド生成量を1とすると、図1に示すように、アジ化ナトリウムの添加によりアクリルアミド生成量が回復、維持された。その効果は濃度依存的であり、100μM以上では3時間で凍結以前と同等なレベルまで回復した。
本発明によればニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞またはその処理液の懸濁液に無機アジ化化合物、またはフロレチン等の代謝阻害剤または糖取り込み阻害剤を添加することによりニトリルヒドラターゼ活性の低下を抑制し、または回復し、およびまたは維持することが可能となり、これまでと比較してより効率的なニトリル化合物からアミド化合物の生産に好適である。
Claims (16)
- ニトリルヒドラターゼ遺伝子が形質転換され、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞またはその処理物の懸濁液に、TCA回路における代謝を阻害する、または電子伝達系における代謝を阻害する代謝阻害剤を添加することを特徴とするニトリルヒドラターゼ活性の安定化方法。
- ニトリルヒドラターゼ遺伝子が形質転換され、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞の懸濁液に、該細胞が資化しうる糖の取り込みを阻害する糖取り込み阻害剤を添加することを特徴とするニトリルヒドラターゼ活性の安定化方法。
- ニトリルヒドラターゼ遺伝子が形質転換され、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞が、該細胞が資化しうる糖を断続的もしくは連続的に流加する培養条件により得られたものである請求項1又は2に記載のニトリルヒドラターゼ活性の安定化方法。
- ニトリルヒドラターゼ遺伝子が形質転換され、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞が、大腸菌K−12株由来である請求項1〜3のいずれか一項に記載のニトリルヒドラターゼ活性の安定化方法。
- 代謝阻害剤が無機アジ化化合物である請求項1、3、および4のいずれか一項に記載のニトリルヒドラターゼ活性の安定化方法。
- ニトリルヒドラターゼ遺伝子が形質転換され、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞またはその処理物の懸濁液に添加する無機アジ化化合物の濃度が10μM〜10mMの範囲である請求項5に記載のニトリルヒドラターゼ活性の安定化方法。
- 糖取り込み阻害剤がフロレチンである請求項2〜4のいずれか一項に記載のニトリルヒドラターゼ活性の安定化方法。
- ニトリルヒドラターゼ遺伝子が形質転換され、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞の懸濁液に添加するフロレチンの濃度が300μM〜300mMの範囲である請求項7に記載のニトリルヒドラターゼ活性の安定化方法。
- ニトリルヒドラターゼ遺伝子が配列番号1および配列番号2に示されたアミノ酸配列、または配列番号1および配列番号2に示されたアミノ酸配列のうち、1ないし数個のアミノ酸が欠失、または他のアミノ酸残基に置換され、或いは他のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるニトリルヒドラタ−ゼである請求項1〜8のいずれか一項に記載のニトリルヒドラターゼ活性の安定化方法。
- ニトリルヒドラターゼ遺伝子が形質転換され、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞またはその処理物の懸濁液に、TCA回路における代謝を阻害する、または電子伝達系における代謝を阻害する代謝阻害剤を添加することを特徴とするニトリルヒドラターゼ活性の活性化方法。
- ニトリルヒドラターゼ遺伝子が形質転換され、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞が、該細胞が資化しうる糖を断続的もしくは連続的に流加する培養条件により得られたものである請求項10に記載のニトリルヒドラターゼ活性の活性化方法。
- ニトリルヒドラターゼ遺伝子が形質転換され、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞が、大腸菌K−12株由来である請求項10又は11に記載のニトリルヒドラターゼ活性
の活性化方法。 - 代謝阻害剤が無機アジ化化合物である請求項10〜12のいずれか一項に記載のニトリルヒドラターゼ活性の活性化方法。
- ニトリルヒドラターゼ遺伝子が形質転換され、ニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞またはその処理物の懸濁液に添加する無機アジ化化合物の濃度が10μM〜10mMの範囲である請求項13に記載のニトリルヒドラターゼ活性の活性化方法。
- ニトリルヒドラターゼ遺伝子が配列番号1および配列番号2に示されたアミノ酸配列、または配列番号1および配列番号2に示されたアミノ酸配列のうち、1ないし数個のアミノ酸が欠失、または他のアミノ酸残基に置換され、或いは他のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるニトリルヒドラタ−ゼである請求項10〜14のいずれか一項に記載のニトリルヒドラターゼ活性の活性化方法。
- 請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法により得られたニトリルヒドラターゼ活性を持つ細胞またはその処理物を用いてニトリル化合物からアミド化合物を製造する方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004112726A JP2005295815A (ja) | 2004-04-07 | 2004-04-07 | ニトリルヒドラターゼの安定化または活性化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004112726A JP2005295815A (ja) | 2004-04-07 | 2004-04-07 | ニトリルヒドラターゼの安定化または活性化方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005295815A true JP2005295815A (ja) | 2005-10-27 |
Family
ID=35328113
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2004112726A Pending JP2005295815A (ja) | 2004-04-07 | 2004-04-07 | ニトリルヒドラターゼの安定化または活性化方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2005295815A (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011041563A (ja) * | 2009-07-24 | 2011-03-03 | Daiyanitorikkusu Kk | 微生物菌体の保存方法及び微生物菌体の懸濁液 |
EP2363473A4 (en) * | 2008-11-14 | 2012-08-08 | Mitsui Chemicals Inc | NITRIL hydratase VARIANT |
US9382560B2 (en) | 2013-02-19 | 2016-07-05 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | Method for producing amide compound |
WO2022172880A1 (ja) | 2021-02-10 | 2022-08-18 | 三菱ケミカル株式会社 | アルデヒドによるニトリルヒドラターゼの反応性向上 |
-
2004
- 2004-04-07 JP JP2004112726A patent/JP2005295815A/ja active Pending
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2363473A4 (en) * | 2008-11-14 | 2012-08-08 | Mitsui Chemicals Inc | NITRIL hydratase VARIANT |
US8871484B2 (en) | 2008-11-14 | 2014-10-28 | Mitsui Chemicals, Inc. | Nitrile hydratase variant |
JP2011041563A (ja) * | 2009-07-24 | 2011-03-03 | Daiyanitorikkusu Kk | 微生物菌体の保存方法及び微生物菌体の懸濁液 |
US9382560B2 (en) | 2013-02-19 | 2016-07-05 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | Method for producing amide compound |
WO2022172880A1 (ja) | 2021-02-10 | 2022-08-18 | 三菱ケミカル株式会社 | アルデヒドによるニトリルヒドラターゼの反応性向上 |
KR20230128527A (ko) | 2021-02-10 | 2023-09-05 | 미쯔비시 케미컬 주식회사 | 알데히드에 의한 니트릴히드라타아제의 반응성 향상 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2376218T3 (es) | Cepa de rhodococcus rhodochrous ncimb 41164 y su uso como productor de nitrilo hidratasa. | |
JP4275666B2 (ja) | 微生物による高効率水素製造方法 | |
TWI601819B (zh) | 丙胺酸之需氧性製造方法或因消耗丙胺酸而產生之化合物的需氧性製造方法 | |
JP5680581B2 (ja) | アミドの製造方法 | |
TW200902721A (en) | Method for producing lactic acid | |
Sun et al. | Two-stage semi-continuous 2-keto-gluconic acid (2KGA) production by Pseudomonas plecoglossicida JUIM01 from rice starch hydrolyzate | |
JP5677963B2 (ja) | N−アセチルグルコサミン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物とそれを用いたn−アセチルグルコサミンまたはグルコサミン生産方法 | |
Kim et al. | Development of bioreactor system for L-tyrosine synthesis using thermostable tyrosine phenol-lyase | |
JP2005295815A (ja) | ニトリルヒドラターゼの安定化または活性化方法 | |
JP4745753B2 (ja) | コリネ型細菌を用いる還元条件でのアミノ酸の製造方法 | |
JP4389064B2 (ja) | ニトリルヒドラターゼ活性を維持または向上させる方法 | |
JP3154646B2 (ja) | グリコール酸の微生物学的製造法 | |
KR101214632B1 (ko) | 타우린 생성용 재조합 변이 미생물 및 이를 이용한 타우린의 제조방법 | |
JP2008306928A (ja) | コバルト型ニトリルヒドラターゼ産生微生物の培養方法 | |
JP2007228957A (ja) | 光学純度の高いポリ−γ−グルタミン酸の製造方法 | |
JP2005211041A (ja) | コハク酸の製造方法 | |
JP2006320278A (ja) | コリネ型細菌による高効率なジカルボン酸の製造方法 | |
JP2005211042A (ja) | フマル酸の製造方法 | |
JP2507406B2 (ja) | D−(−)−酒石酸の製造法 | |
WO2022259458A1 (ja) | (s)-3-ハロゲノ-2-メチル-1,2-プロパンジオールを製造する方法 | |
JP5333966B2 (ja) | (s)−3−キヌクリジノールの製造方法 | |
JP2020115838A (ja) | ニトリルヒドラターゼの保存方法 | |
JPS5928485A (ja) | L−システインの製造法 | |
CN1886518A (zh) | 酰胺的制备 | |
JP2014050317A (ja) | 1−ベンジル−4−ヒドロキシ−3−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの製造方法 |