JP2011041563A - 微生物菌体の保存方法及び微生物菌体の懸濁液 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体を、乾燥菌体質量として4〜20質量%の濃度で分散媒中で保存することを特徴とする微生物菌体の保存方法。
【選択図】なし
Description
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、2009年7 月24日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願(特願2009−173162号)の明細書に記載の内容を包含する。
従って、4質量%以上とすることにより、室温での保存安定性が良くなるが、20質量%を超えると、菌体懸濁液の流動性が低下するために液体としての取り扱いが困難になり、保存・運搬に適さないものとなる。従って、保存時の菌体懸濁液の濃度は、乾燥菌体として4〜20質量%、好ましくは、5〜15質量%、より好ましくは、5〜10質量%である。
ニトリルヒドラターゼ活性は、当該技術分野で公知のいずれかの方法により測定できるが、例えば、保存開始前と保存後の基質(例えば、アクリロニトリル)に対するアクリルアミド生成反応速度を比較すること等により測定することが可能である。
培養
500mlの三角フラスコにグルコース2%、尿素1%、ペプトン0.5%、酵母エキス0.3%、塩化コバルト0.05%を含む培地(pH7.0)100mlを調製し、121℃、20分のオートクレーブにより滅菌した。この培地にニトリルヒドラターゼ活性を有するロドコッカス・ロドクロウスJ−1株(Rhodococcus rhodochrous J-1:FERM BP-1 478)を接種し、30℃、230rpmにて66時間培養した。
培養後の菌体懸濁液約1gをアルミ皿に採り秤量した。また菌体懸濁液を12000rpm、20分で遠心分離し、上清10gを濾過フィルタ(アドバンテック社、細孔径0.45μm)で濾過し、アルミ皿に受け秤量した。それぞれ乾燥器(ヤマト科学製、DN63)にて120℃で3時間乾燥させた後、これらを秤量した。菌体懸濁液及び上清について、乾燥前の質量に対する乾燥後の質量を百分率で示し、乾燥菌体質量を求めた。
培養後の微生物菌体を遠心分離(12000rpm、20分)により沈降後、0.1%アクリル酸ナトリウム水溶液(pH7.0)で再懸濁・再遠心分離を3回繰り返した後、沈降菌体を再度0.1%アクリル酸ナトリウム水溶液(pH7.0)で懸濁し、乾燥菌体質量として8.0%の菌体懸濁液(実施例1)を得た。この菌体懸濁液の一部を0.1%アクリル酸ナトリウム水溶液で希釈し、乾燥菌体質量が3.4%である菌体懸濁液(比較例1)を得た。
ニトリルヒドラターゼ活性は、上記の方法で調製した直後の菌体懸濁液(0日目)と、同様に調製した菌体懸濁液を室温(15〜20℃)で静置することで5日間保存したもの(5日後)を用いて、これらの懸濁液に含まれる菌体によるアクリルアミド生成反応速度から算出した。基質であるアクリロニトリルの水溶液を菌体懸濁液に添加することで反応を開始し、10℃で10分間振盪した後、菌体の濾過分離とリン酸添加により反応を停止させ、ガスクロマトグラフィ(GC−14B、島津製作所)で分析した。分析条件は、Porapack PS(ウォーターズ社)を充填した1mガラスカラムを用い、カラム温度210℃、検出器は230℃のFIDを使用した。
本発明におけるニトリルヒドラターゼの酵素活性は、1分間に菌体1mgが生産するアクリルアミドの量(μmol)として測定し、以下、0日に於ける反応速度を100%とした相対反応速度比を表1に示す。
培養
500mlの三角フラスコの代わりに3Lジャーファーメンター(高杉製作所製)を用いた以外は、実施例1と同様に培養した。
実施例1と同様の方法で菌体懸濁液の乾燥菌体質量を測定した。
培養後の微生物菌体は中空糸膜モジュール(クラレ社、細孔径0.05μm、表面積39000m2)を用いて濃縮後、0.1%アクリル酸ナトリウム水溶液(pH7.0)で洗浄し、乾燥菌体質量が10.0%になるまで再度濃縮を行って、10.0%乾燥菌体質量の菌体懸濁液(実施例2)を調製した。この菌体懸濁液の一部を0.1%アクリル酸水溶液で希釈し、乾燥菌体質量が5.0%(実施例3)、2.5%(比較例2)、0.2%(比較例3)の菌体懸濁液を調製した。
保存時の温度を30℃とした以外は、実施例1と同様に実験を行った。0日に於ける反応速度を100%とした3日後の相対反応速度比を表2に示す。
ロドコッカス ロドクロウス M8株由来ニトリルヒドラターゼを有する形質転換体の作製
(1)ロドコッカス ロドクロウス M8株(以下、M8株という。)からの染色体DNA調製
M8株(SU1731814)は、ロシア菌株センター(Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms :IBFM、Pushchino, 142290, Moscow Region, ロシア)(受託番号:VKPM S−926)から入手することができる。
M8株を100mlのMYK(0.5% ポリペプトン、0.3% バクトイーストエキス、0.3%バクトモルトエキス、0.2% K2HPO4、0.2% KH2PO4)培地(pH7.0)中、30℃にて72時間振盪培養した。培養液を遠心分離し、集菌した菌体をSaline−EDTA溶液(0.1M EDTA、0.15M NaCl(pH8.0))4mlに懸濁した。懸濁液にリゾチーム8mgを加えて37℃で1〜2時間振盪した後、−20℃で凍結した。
次に、当該懸濁液に10mlのTris−SDS液(1%SDS、0.1M NaCl、0.1M Tris−HCl(pH9.0))を穏やかに振盪しながら加えた。さらに、当該懸濁液にプロテイナーゼK(メルク社)(終濃度0.1mg)を加え37℃で1時間振盪した。次に、等量のTE飽和フェノールを加え攪拌後(TE:10mM Tris−HCl、1mM EDTA(pH8.0))遠心した。上層を採取し、2倍量のエタノールを加えて、ガラス棒でDNAを巻きとった。その後、これを順次90%、80%、70%のエタノールで遠心分離しフェノールを取り除いた。
次に、DNAを3mlのTE緩衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼA溶液(100℃、15分間の加熱処理済)を10μg/mlになるよう加え37℃で30分間振盪した。さらに、プロテイナーゼK(メルク社)を加え37℃で30分間振盪した。これに等量のTE飽和フェノールを加えて遠心分離後、上層と下層に分離した。
上層をさらに等量のTE飽和フェノールを加えて遠心分離後、上層と下層に分離した。この操作を再度繰り返した。その後、上層に同量のクロロホルム(4%イソアミルアルコール含有)を加えて遠心分離し、上層を回収した。次いで、上層に2倍量のエタノールを加えガラス棒でDNAを巻きとって回収し、染色体DNAを得た。
(2)PCRを用いたM8株染色体DNAからのニトリルヒドラターゼ遺伝子の調製
M8株由来ニトリルヒドラターゼは非特許文献(Veiko,V.P.et al, Cloning,nucleotide sequence of nitrile hydratase gene from Rhodococcus rhodochrous M8, Biotekhnologiia (Mosc.) 5, 3-5 (1995))に記載されている。M8株由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号2、配列番号4、配列番号6に示す。また、これらのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号1、配列番号3、配列番号5に示す。これらのヌクレオチド配列情報に基づいて、下記のM8−1及びM8−2プライマーを合成し、(1)にて調製した染色体DNAを鋳型としてPCRを行った。
<PCR反応溶液組成>
鋳型DNA(染色体DNA) 200ng
PrimeSTAR Max Premix(宝酒造社製) 25μl
プライマーM8−1 10pmol
プライマーM8−2 10pmol
<プライマー>
M8−1: 5‘-ggtctagaatggatggtatccacgacacaggc-3‘ (配列番号7)
M8−2: 5‘-cccctgcaggtcagtcgatgatggccatcgattc-3‘ (配列番号8)
<反応条件>
(98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃で30秒)×30サイクル
PCR終了後、反応液5μlを0.7%アガロースゲル(同仁化学社製アガロースI使用;アガロース濃度0.7重量%)電気泳動に供し、1.6kbの増幅断片の検出を行った。反応終了液をWizard SV Gel and PCR Clean−Up Syste(プロメガ株式会社)を用いて精製した。
回収したPCR産物はLigation Kit(宝酒造)を用いてベクター(pUC118/HincII部位)に連結し、反応液により大腸菌JM109のコンピテントセルを形質転換した。得られた形質転換体コロニーより数クローンをLB−Amp培地1.5mlに接種し、37℃で12時間振盪培養した。培養後、この培養物を遠心分離により集菌した。QIAprep Spin Miniprep Kit (アマシャムバイオサイエンス社)を用いることにより、集菌した菌体からプラスミドDNAを抽出した。得られたプラスミドDNAに対し、シークエンシングキットとオートシークエンサーCEQ 8000(ベックマンコールター社)を用いて、ニトリルヒドラターゼの塩基配列を確認した。
次に、得られたプラスミドDNAを制限酵素XbaIとSse8387Iで切断後、0.7%アガロースゲルにより電気泳動を行い、ニトリルヒドラターゼ遺伝子断片(1.6kb)を回収し、プラスミドpSJ042のXbaI−Sse8387Iサイトに導入した。
得られたプラスミドをpSJ−N01Aと命名した。
尚、pSJ042はロドコッカス菌においてJ1株ニトリルヒドラターゼを発現するプラスミドとして特開2008−154552号公報に示す方法で作製されたものであり、pSJ042の作製に使用したpSJ023は形質転換体ATCC12674/pSJ023(FERM BP−6232)として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に平成9年3月4日付けで寄託されている。
(3)コンピテントセルの作製
ロドコッカス・ロドクロウスATCC 12674株(以下、ATCC 12674株)をMYK培地で対数増殖期前期まで培養し、細胞を遠心分離器により集菌し、氷冷した滅菌水にて3回洗浄し、滅菌水に懸濁し、コンピテントセルを作製した。
(4)M8株由来ニトリルヒドラターゼを有する形質転換体の作製
得られたプラスミドpSJ−N01A 0.1μgとATCC12674株のコンピテントセルの菌体懸濁液各20μlとを混合し、各々氷冷した。キュベットに各混合液を入れ、遺伝子導入装置 Gene Pulser(BIO RAD)により20 KV/cm、200 OHMSで電気パルス処理を行った。電気パルス処理液を氷冷下10分静置し、37℃で10分間ヒートショックを行った。その後、キュベットにMYK培地500μlを加え、30 ℃、5時間静置した後、50μg/mlカナマイシン入りMYK寒天培地に塗布し、30℃、3日間培養した。
得られた形質転換体コロニーに含まれるプラスミドDNAを確認し、この組換え菌をM8株由来ニトリルヒドラターゼを有するロドコッカス属組換え菌(ATCC12674/pSJ−N01A)とした。
実施例1と同様に培養し、組換菌体懸濁液(乾燥菌体2重量%)を得た。
培養後の微生物培養液に、終濃度0.5重量%となるように塩化ベンゼトニウムを加えて攪拌し、4℃で3日間静置し、沈降により菌体と上清を分離した。分離した菌体を50mMのリン酸緩衝液(pH7.0)で懸濁し、遠心分離(12000rpm、20分)により沈降後0.1%アクリル酸水溶液(pH7.0にNaOHで調整)で再懸濁し、乾燥菌体質量として5.4%の菌体懸濁液(実施例4)を得た。この菌体懸濁液の一部を0.1%アクリル酸水溶液(pH7.0にNaOHで調整)で希釈し、乾燥菌体質量が4.0%である菌体懸濁液(実施例5)と1.0%である菌体懸濁液(比較例4)を得た。
ニトリルヒドラターゼ活性は、上記の方法で調製した直後の菌体懸濁液(0日目)と、同様に調製した菌体懸濁液を30℃で静置することで5日間保存したもの(5日後)を用いて、実施例1と同様に測定・算出した。以下、0日に於ける反応速度を100%とした相対反応速度比を表3に示す。
配列番号8:合成DNA
Claims (8)
- ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体を、乾燥菌体質量として4〜20質量%の濃度で分散媒中で保存することを特徴とする微生物菌体の保存方法。
- 前記保存は、35℃以下で且つ凍らない状態で静置保存するものである、請求項1に記載の方法。
- 前記分散媒が有機酸水溶液である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記有機酸がアクリル酸である、請求項3に記載の方法。
- 前記微生物菌体のニトリルヒドラターゼ活性が、保存の前後において実質的に変化しないことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物がロドコッカス(Rhodococcus)属に属する微生物である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物がロドコッカス・ロドクロウスJ−1株(Rhodococcus rhodochrous J-1)(受託番号:FERM BP−1478)又はロドコッカス・ロドクロウスM8株(受託番号:VKPM S−926)である、請求項6に記載の方法。
- ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体を乾燥菌体質量として4〜20質量%の菌体濃度で含む、微生物菌体の懸濁液。
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