RU2597965C2

RU2597965C2 - Способ сохранения фермента

Info

Publication number: RU2597965C2
Application number: RU2014139012/10A
Authority: RU
Inventors: Эми ИСИИ; Масахито ОДА
Original assignee: Мицубиси Рейон Ко., Лтд.
Priority date: 2012-02-28
Filing date: 2013-02-19
Publication date: 2016-09-20
Also published as: WO2013129179A1; KR101736018B1; KR20140121428A; US20150050718A1; CN104145017A; JPWO2013129179A1; KR20160112010A; EP2821483A1; JP5967189B2; US9353348B2; AU2013227585B2; RU2014139012A; EP2821483A4; EP2821483B1; AU2013227585A1; CN104145017B; BR112014020899A2

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ получения нитрилгидратазы, включающий следующие стадии: стадию культивирования микроорганизмов, обладающих активностью нитрилгидратазы, в защищенных от света условиях, стадию разрушения полученных при культивировании микробных клеток с использованием гомогенизатора высокого давления, стадию сохранения полученных, как указано выше, разрушенных микробных клеток при 4-37°С в условиях защиты их от действия света, и стадию получения супернатанта, содержащего нитрилгидратазу. Изобретение относится также к способу сохранения нитрилгидратазы, способу активации нитрилгидратазы и к способу получения активированной нитрилгидратазы. Изобретение позволяет разработать простой способ сохранения фермента из микробных клеток, полученных при культивировании, а также усилить активность фермента в ходе такой консервации. 4 н. и 4 з.п. ф-лы, 6 табл., 3 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0001] Настоящее изобретение относится к способу сохранения фермента из микроорганизмов, обладающих активностью нитрилгидратазы, к способу ее активации и к способу получения активированной нитрилгидратазы.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] Фермент, продуцируемый микроорганизмами, используется во многих областях в качестве катализатора реакции химической конверсии. В частности, при использовании нитрилгидратазы или другого близкого фермента, обладающего способностью гидратировать или гидролизовать нитрильную группу, можно получать с низкими затратами амиды, карбоновые кислоты, α-гидроксикарбоновые кислоты и т.п., нужные для химической промышленности. Кроме того, при использовании этого фермента, обладающего оптически специфичной гидратирующей активностью или оптически специфичной гидролизующей активностью, можно получать оптически активные карбоновые кислоты, аминокислоты, α-гидроксикарбоновые кислоты или т.п., которые нужны в качестве исходного материала при получении фармацевтических средств и агрохимикатов.

[0003] Для реакции химической конверсии, в которой в качестве катализатора используется фермент, полученный из микроорганизмов, важно сохранять в стабильном состоянии полученные при культивировании и собранные микроорганизмы, вплоть до момента их применения. Конкретно, указанное сохранение должно проводиться таким образом, чтобы каталитическая активность фермента не терялась или не снижалась в результате процессов разложения или лизиса, вызванных контаминацией. Соответственно, инактивация, разложение или лизис микробного фермента ингибируется при сохранении микробных клеток, где указанное сохранение в основном осуществляется в присутствии стабилизирующего агента, ингибитора метаболизма или высоких концентраций соли, а указанный фермент затем используется в реакции химической конверсии. В том случае, когда стабилизирующий агент или подобное средство не добавляется, в качестве одного из подходящих вариантов известен способ сохранения путем замораживания, охлаждения или перемешивания в условиях аэрации с целью сохранения активности фермента.

[0004] Для тех случаев, когда микроорганизмы содержат фермент с нитрилгидратазной активностью, известны разные подходы к сохранению фермента, такие как способ сохранения в водном растворе, содержащем высокую концентрацию неорганических солей (Патентный документ 1), способ сохранения путем замораживания (Патентный документ 2), способ, включающий перемешивание в условиях аэрации и при контроле показателя рН (Патентный документ 3) или т.п.

[0005] Известен также способ, включающий выделение твердого материала после разрушения микробных клеток и последующую очистку микробного фермента, где указанный подход предоставляет пользователю более удобные условия в работе с микробным катализатором (Патентный документ 4).

СПИСОК ЦИТИРОВАННЫХ МАТЕРИАЛОВ

ПАТЕНТНЫЕ ДОКУМЕНТЫ

[0006] Патентный документ 1: Патент Японии №3163224

Патентный документ 2: JP 2003-219870 А

Патентный документ 3: JP 2003-144144 А

Патентный документ 4: WO 2011/007725 А

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0007] Однако применяемый в настоящее время способ сохранения, включающий несколько стадий его осуществления, весьма громоздок и экономически не рентабелен. К тому же, учитывая тот факт, что фермент обладает сниженной активностью, этот способ к тому же не рассматривается как удовлетворительный подход для решения задачи сохранения данного фермента. Так, например, способ, основанный на использовании водного раствора, содержащего высокую концентрацию неорганических солей, который описан в Патентном документе 1, включает обязательную промывку на следующей стадии процесса, а это может повлиять на качество продукта, и к тому же производственный процесс становится более сложным за счет добавления новых стадий. Далее, способ замораживания, описанный в Патентном документе 2, осложнен проблемой, которая заключается в том, что обработка, связанная с замораживанием и плавлением, является весьма трудоемкой и ферментативная активность либо также теряется, либо снижается в процессе такой обработки. Способ сохранения, включающий перемешивание в условиях аэрации и при контроле значений рН, описанный в Патентном документе 3, сопряжен с необходимостью применения кислых или щелочных химических средств или устройств или соответствующих мощностей для проведения перемешивания в условиях аэрации. В Патентном документе 4 описан способ разрушения микробных клеток и последующего центрифугирования с целью их выделения после кислотной и тепловой обработки. Однако с точки зрения активности получаемого фермента, которая в этом случае также снижается в ходе разных стадий реакции, этот способ также нуждается в усовершенствовании.

Целью настоящего изобретения является разработка способа сохранения фермента из микробных клеток, получаемых в результате процесса культивирования, который бы характеризовался меньшими затратами при большем удобстве его осуществления, в сравнении со способами, известными в данной области.

[0008] Авторы настоящего исследования провели интенсивные исследования для решения указанных выше проблем. В итоге, было показано, что при разрушении микробных клеток после культивирования микроорганизмов с нитрилгидратазной активностью, в защищенных от света условиях, с использованием гомогенизатора высокого давления, и их последующем сохранении в защищенных от света условиях, с невысоким затратами и легко может быть получен фермент из микробных клеток и, к тому же, указанная ферментативная активность даже усиливается при таком сохранении. Конкретно, настоящее изобретение относится к способу сохранения фермента из микробных клеток, который решает указанную выше проблему.

Конкретно, настоящее изобретение относится к недорогому и простому способу сохранения фермента из микробных клеток, получаемых в результате культивирования, и усиления активности фермента в ходе такого сохранения, в сравнении со способом, известным на данном уровне развития техники. Объектом настоящего изобретения является способ сохранения фермента с нитрилгидратазной активностью, который отличается тем, что микробы, обладающие нитрилгидратазной активностью, культивируют в защищенных от света условиях, и затем полученные микробные клетки разрушают гомогенизатором высокого давления, также в защищенных от света условиях.

[0009] Способ, который более предпочтителен в качестве способа по настоящему изобретению, относится к аспекту, согласно которому суспензию разрушенных микробных клеток сохраняют с использованием определенной методики; а также используют определенные микроорганизмы с нитрилгидратазной активностью.

[0010] Согласно другому аспекту настоящего изобретения, существенно отметить следующее: суспензию разрушенных микробных клеток консервируют при температуре от 4 до 37°С; суспензию разрушенных микробных клеток консервируют в течение периода времени от 4 до 24 часов; и используют микроорганизмы из рода Rhodococcus или рода Pseudonocardia.

[0011] Настоящее изобретение также относится к способу активации фермента с нитрилгидратазной активностью и к способу получения активированной нитрилгидратазы, который отличается тем, что микробные клетки, полученные при культивировании микроорганизмов с нитрилгидратазной активностью в защищенных от света условиях, далее обрабатывают гомогенизатором высокого давления, также в защищенных от света условиях.

[0012] Согласно настоящему изобретению, при разрушении микробных клеток, полученных при их культивировании в защищенных от света условиях и при их последующем суспендировании в диспергирующей среде с использованием гомогенизатора высокого давления, также в защищенных от света условиях, удается поддерживать состояние, при котором сохраняется активность фермента, такого как нитрилгидратаза, а именно: указанный фермент сохраняется, без разложения или ухудшения его качеств, даже в том случае, когда не проводится аэрация или перемешивание, или не проводится коррекция значения рН, или тепловая обработка. Кроме того, согласно настоящему изобретению, активность фермента может быть усилена в процессе такого сохранения. Иными словами, трудовые или финансовые издержки, которые на достигнутом уровне техники рассматривались как неизбежные для достижения сохранения, могут быть значительно сокращены, так что в итоге обеспечивается подходящий для промышленного использования способ сохранения микробного фермента.

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0013] Ниже приводится подробное описание настоящего изобретения. Однако следует отметить, что приведенные здесь варианты осуществления настоящего изобретения даны лишь в качестве примера с целью дополнительного пояснения настоящего изобретения, и они ни в коей мере не ограничивают область настоящего изобретения. Соответственно, настоящее изобретение, при условии соответствия указанной выше тематике, составляющей цель настоящего изобретения, может быть осуществлено в самых разных формах.

[0014] В настоящем изобретении, микроорганизмы, обладающие нитрилгидратазной активностью, характеризуются способностью продуцировать желательный ферментный катализатор и накапливать его в микробной клетке или секретировать за пределы микробной клетки. Примеры таких микроорганизмов включают как природные микроорганизмы, встречающиеся в естественном состоянии, так и микроорганизмы, которые были получены рекомбинантными методами. Репрезентативные примеры соответствующих микроорганизмов, обладающих нитрилгидратазной активностью, включают микроорганизмы из рода Rhodococcus, из рода Gordona, из рода Pseudomonas, из рода Pseudonocardia и из рода Geobacillus. Кроме того, в их числе можно отметить микроорганизмы полученные методами рекомбинантной технологии, которые содержат нитрилгидратазный ген из указанных выше микроорганизмов. Среди них, предпочтительными для масштабного использования в промышленности являются микроорганизмы из рода Rhodococcus, рода Pseudonocardia, а также рекомбинантный Е. coli и рекомбинантный микроорганизм из рода Rhodococcus, в клетки которых был встроен ген нитрилгидратазы из указанных микроорганизмов. Конкретные примеры микроорганизмов из рода Rhodococcus включают штамм Rhodococcus rhodochrous J-1, описанный в JP 6-55148 В, и Rhodococcus rhodochrous NCIMB41164, описанный в WO 2005/054456 А. Штамм Rhodococcus rhodochrous J-1 был депонирован 18 сентября 1987 г. в Депозитарном Центре запатентованных организмов при Национальном Институте промышленной науки и технологии, независимом административном учреждении (Patent Organism Depository Center of National Institute of Industrial Science and Technology, an Independent Administrative Institution (zip code: 305-8566, Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan (ditto, в настоящем описании)) с номером доступа FERM ВР-1478. Далее, штамм NCIMB41164 был депонирован 5 марта 2003 года в Национальной Коллекции промышленных и морских бактерий (National Collection of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB)) (NCIMB Ltd Ferguson Building Craibstone Estate Bucksburn Aberdeen AB21 9YA) с номером доступа NCIMB41164. Конкретные примеры микроорганизмов из рода Pseudonocardia включают Pseudonocardia thermophila JCM3095, который был описан в JP 09-275978 А. Этот штамм был депонирован в том же Депозитарном Центре запатентованных организмов (Patent Organism Depository Center) с номером доступа FERM ВР-5785.

В настоящем изобретении, один тип микроорганизма, выбранный из указанного выше перечня, может использоваться в отдельности, сам по себе, или может использоваться сочетание двух или более таких микроорганизмов.

Культивирование микроорганизмов, обладающих нитрилгидратазной активностью, может проводиться в обычных условиях, применяемых для культивирования микроорганизмов, с тем исключением, что указанное культивирование проводится в защищенных от света условиях.

[0015] Нитрилгидратаза обозначает фермент, обладающий способностью гидролизовать нитрильное соединение с образованием соответствующего амидного соединения. Нуклеиновые кислоты, кодирующие нитрилгидратазу, а также примеры соответствующих нуклеотидных последовательностей описаны в Патентном документе 2. Нуклеиновые кислоты могут экспрессироваться в клетке микроорганизмов после их встраивания по известному молекулярно-биологическому методу (относительно методов молекулярной биологии см. работу: Sambrook, Fritsch and Maniatis, «Molecular Cloning: A Laboratory Manual» 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press). Конкретно, в настоящем изобретении, может использоваться фермент, полученный из природных микроорганизмов, обладающих нитрилгилратазной активностью, или может использоваться фермент, полученный при экспрессии в микробных клетках нуклеиновых кислот, кодирующих нитрилгидратазу. В настоящем изобретении, один тип фермента, выбранный из указанного выше списка, может использоваться в отдельности или может использоваться сочетание двух или более ферментов.

[0016] В настоящем изобретении, термин «консервировать», во всех его формах, обозначает сохранение разрушенных микробных клеток в реакторе или контейнере. При этом обычно проводится перемешивание или аэрация, поскольку в данной ситуации не достигается однородная концентрация в реакторе или контейнере. Однако в настоящем изобретении, выдерживание без перемешивания или аэрации также возможно. В настоящем изобретении, термин «выдерживание» обозначает, что разрушенные микробные клетки содержатся в реакторе или контейнере без перемешивания или аэрации. Что касается способа защиты от света, используемого в настоящем изобретении, то возможно сохранять разрушенные микробные клетки в реакторе, защищенном от проникновения света или в закрытом контейнере в темной комнате.

[0017] В настоящем изобретении, температура сохранения варьируется, в зависимости от природы микроорганизмов, которые продуцируют рассматриваемый фермент, от типа фермента или т.п. Однако при использовании активности фермента в качестве индикатора, возможно подобрать подходящую температуру сохранения.

В настоящем изобретении, указанное сохранение в основном может быть проведено при комнатной температуре. Однако с целью достижения желательной активации фермента, предпочтительно проводить ее при температуре от 4 до 37°С, более предпочтительно при температуре от 4 до 25°С и еще более предпочтительно при температуре от 4 до 15°С. В том случае, когда температура сохранения ниже 4°С, не только может заморозиться суспензия микробных клеток, но также могут возрасти затраты, связанные с таким охлаждением. С другой стороны, если температура повышается выше 37°С, то может снижаться нитрилгидратазная активность в зависимости от природы самого микробного фермента.

[0018] В настоящем изобретении, длительность указанного сохранения варьирует в зависимости от природы микроорганизмов, продуцирующих фермент, от типа этого фермента, температуры, поддерживаемой в ходе сохранения, и т.п. Однако, используя ферментативную активность в качестве индикатора, можно подобрать подходящую длительность этого процесса. В основном, длительность периода сохранения может составлять от 4 до 24 часов. Однако, более предпочтительно, указанная длительность составляет от 6 до 24 часов. Когда период сохранения длится менее 4 часов, указанная нитрилгидратазная активность может не усилиться в достаточной мере. С другой стороны, когда указанный период сохранения длится более 24 часов, нитрилгидратазная активность может снижаться из-за разложения суспензии микробных клеток в зависимости от температуры или природы микробного фермента.

[0019] Когда микробный фермент консервируют по способу настоящего изобретения, указанная ферментативная активность повышается, в сравнении с вариантом, когда не проводится защита от действия света. В том, что касается активности нитрилгидратазы, то указанная нитрилгидратазная активность после сохранения в основном повышается на 100%, в сравнении с активностью нитрилгидратазы до сохранения. Она поддерживается на уровне предпочтительно 103% или выше, более предпочтительно на уровне 110% или выше, или еще более предпочтительно на уровне 120% или выше.

Указанная нитрилгидратазная активность может быть определена в рамках любого способа, известного в данной области техники. Так, например, оценка активности может быть проведена путем сравнения скорости реакции образования акриламида на основе субстрата (например, акрилонитрила), до начала сохранения и после сохранения.

[0020] В настоящем изобретении, термин «диспергирующая среда» обозначает раствор, используемый для суспендирования микробных клеток, подлежащих разрушению. При этом может использоваться любой тип диспергирующей среды, где такая диспергирующая среда может представлять собой жидкую среду, используемую для разрушения культуры микробных клеток, или среду, полученную путем замены жидкой среды, использованной для культивирования, водной средой или кислотой.

[0021] Компонент водного раствора органической кислоты особо не ограничивается, главное, чтобы он не ингибировал ферментативную активность. Примеры такого рода компонента включают карбоновые кислоты, такие как акриловая кислота, муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, масляная кислота или щавелевая кислота. Среди них, с точки зрения поддержания качества акриламида, предпочтительной является акриловая кислота.

[0022] Суспензию разрушенных клеток по настоящему изобретению предпочтительно изготавливают с использованием микробных клеток, полученных путем культивирования, до проведения химической обработки (например, обработки глютаральдегидом, как описано в JP 7-265091 А). В качестве способа разрушения может использоваться гомогенизатор высокого давления, который позволяет разрушать микробные клетки, суспендированные в диспергирующей среде. Примеры гомогенизатора высокого давления включают френч-пресс и гомогенизатор с постоянным рабочим давлением. Предпочтительным является гомогенизатор с постоянным рабочим давлением, позволяющий осуществлять промышленное получение суспензии разрушенных клеток в больших количествах и с требуемой стабильностью. В том, что касается способа разрушения клеток, следует отметить, что предпочтительно проводить разрушение с использованием гомогенизатора высокого давления, на основе суспендированной в диспергирующей среде массы. Температура в момент разрушения составляет, с тем чтобы избежать термического разложения, предпочтительно от 0 до 37°С, и более предпочтительно от 0 до 25°С. Давление в процессе разрушения особо не ограничивается, главное, чтобы используемое давление позволяло разрушать микробные клетки. Однако его обычно корректируют до уровня от 50 до 150 МПа или предпочтительно от 70 до 120 МПа. Концентрация клеток в момент разрушения также особо не ограничивается. Однако этот показатель, в эквиваленте сухой микробной массы, может варьировать в диапазоне от 0,1 до 30 мас.%.

[0023] Таким образом, согласно настоящему изобретению, возможно осуществлять сохранение суспензии разрушенных клеток, с последующим отделением от этой массы твердого компонента, с целью дальнейшего использования. Способ выделения твердого компонента не ограничивается, и его примеры включают отделение центрифугированием. Температура в указанном процессе выделения составляет предпочтительно от 0 до 37°С и более предпочтительно, от 0 до 25°С.

ПРИМЕРЫ

[0024] Ниже, приводится более подробное описание настоящего изобретения с использованием примеров. Однако все эти примеры даны лишь для целей пояснения настоящего изобретения, и они никоим образом не должны рассматриваться как ограничивающие в чем-то настоящее изобретение. В приведенных далее тест-примерах (примеры, сравнительные примеры и стандартные примеры) оценка ферментативной активности проводится при измерении скорости реакции гидратации, когда супернатант, полученный после центрифугирования культуры микробных клеток, а также после сохранения по определенному способу, приводится во взаимодействие с нитрилом в рамках определенного, описанного ниже, метода.

Ниже, в тексте описания примеров, сравнительных примеров и стандартных примеров, символ «%» обозначает % по массе, т.е. мас.%.

[0025] <Получение трансформанта из рода Rhodococcus, содержащего ген нитрилгидратазы>

В качестве трансформанта, содержащего встроенный в него ген нитрилгидратазы из Rhodococcus rhodochrous J1, использовали Rhodococcus rhodochrous ATCC12674/pSJ042, полученный по способу, описанному в JP 2008-154552 А.

В том, что касается трансформанта, содержащего встроенный в него ген нитрилгидратазы из Pseudonocardia thermophila JCM3095, то использовали трансформант Rhodococcus rhodochrous ATCC12674/pSJ-N02A, который был получен при введении плазмиды pSJ-N02A, как описано в JP 2011-200132 А, в штамм АТСС12674 по описанному здесь методу.

[0026] <Культивирование микробных клеток>

(1) Культивирование трансформанта штамма АТСС12674

В коническую колбу на 500 мл добавляли 100 мл среды (рН 7,2), которая была получена при растворении компонентов, указанных в таблице 1, в водопроводной воде, и затем подвергали все стерилизации в автоклаве при температуре 121°С в течение 20 мин. К среде добавляли мочевину и канамицин до концентрации 0,1 г/л и 50 мг/л соответственно. После инокуляции проводили культивирование ATCC12674/pSJ042 или ATCC12674/pSJ-N02A в течение 72 ч при температуре 30°С и при качании со скоростью 230 об/мин в защищенных от света условиях. Компоненты среды, которые использовались в данном тест-примере, показаны в таблице 1.

(2) Культивирование штамма Rhodococcus rhodochrous J-1

В баночный ферментер объемом 3 л (производство компании Takasugi Seisakusho), добавляли 2,5 л среды (рН 7,0), которая была получена при растворении компонентов, указанных в таблице 2, в водопроводной воде и затем подвергали все стерилизации в автоклаве при температуре 121°С в течение 20 мин. В среду инокулировали 20 мл штамма Rhodococcus rhodochrous J-1, полученного при культивировании в описанных выше условиях (1), и проводили культивирование в течение 42 ч в защищенных от света условиях. Температура в процессе культивирования составляла 35°С. Компоненты среды, которая использовалась в данном тест-примере, показаны в таблице 2.

(3) Культивирование штамма Rhodococcus rhodochrous NCIMB-41164

В коническую колбу объемом 500 мл вносят 100 мл среды (рН 7.2), полученной при растворении компонентов, указанных в таблице 3, в водопроводной воде, после чего все стерилизуют в автоклаве при температуре 121°С в течение 20 мин. К полученной смеси добавляют мочевину до конечной концентрации 5,0 г/л. После инокуляции штамма Rhodococcus rhodochrous NCIMB-41164 проводят культивирование в течение 65 ч при температуре 30°С и качании со скоростью 230 об/мин, в защищенных от света условиях. Компоненты среды, которые были использованы в данном тест-примере, показаны в таблице 3.

[0027]

[0028]

[0029]

[0030] <Определение концентрации микробных клеток в сухом состоянии>

Фраза «концентрация микробных клеток в сухом состоянии (сухая микробная масса [%])» обозначает долю сухой массы микробных клеток, которые содержатся в суспензии микробных клеток. Конкретно, этот показатель вычисляют путем вычитания из массовой доли микробных клеток до и после сушки суспензии микробных клеток величины, определенной в виде разницы массы жидкого слоя до и после сушки, где указанную сушку проводят в течение 3 ч с использованием сушилки при температуре 120°С, после разделения суспензии микробных клеток на слой микробных клеток и жидкий слой, который, о существу,не содержит микробных клеток (процент: концентрация соли в супернатанте [%]), в соответствии с указанным выше способом (процент: доля сухого остатка, полученного из микробного раствора [%]).

[0031] <Определение активности нитрилгидратазы>

Активность нитрилгидратазы рассчитывают исходя из скорости реакции образования акриламида при использовании супернатанта, из которого были удалены твердые компоненты после разрушения микробных клеток. При добавлении к супернатанту водного раствора акрилонитрила начинается реакция. После встряхивания реакционной смеси в течение 10 мин при температуре 10°С реакцию останавливают при отделении фильтрованием микробных клеток и добавлении фосфорной кислоты. Далее проводят анализ с использованием газовой хроматографии (GC-14B, производство компании Shimadzu Corporation). Для анализа используют стеклянную колонку длиной 1 м, заполненную Porapack PS (производство компании Waters Company), температура в колонке составляет 210°С и в качестве детектора был использован FID при температуре 230°С.

В настоящем изобретении, ферментативную активность нитрилгидратазы определяют как количество акриламида (мкмоль), полученного в расчете на 1 мг микробных клеток в течение одной минуты.

[0032] Тест-пример

<Пример 1>

Концентрацию микробных клеток в сухом состоянии определяют в штаммах ATCC12674/pSJ042 и ATCC12674/pSJ-N02A, которые были получены при культивировании по описанной выше методике. Далее, с использованием небольшого дезинтегратора микробных клеток PANDA2K (производство компании Niro Soavi), представляющего собой гомогенизатор высокого давления, и суспензии микробных клеток, полученных в результате культивирования, разрушают указанные микробные клетки. Разрушение проводят под давлением 100 МПа при поддержании температуры в процессе разрушения клеток на уровне 4°С.

Суспензию разрушенных микроорганизмов, сразу же после получения (0 часов) и после сохранения в течение периода времени от 4 до 24 ч путем выдерживания в темном помещении при температуре от 4 до 37°С, подвергают центрифугированию в течение 5 мин при температуре 4°С и скорости 15000 об/мин, с получением супернатанта. Далее, в полученном супернатанте определяют активность нитрилгидратазы. Относительные значения, вычисленные применительно к активности в момент 0 часов, которая принята за 100, показаны в таблице 4.

[0033] <Стандартный пример 1>

Эффект повышения ферментативной активности определяли по процедуре примера 1, с тем исключением, что изменили температуру сохранения, которая здесь составляет 50°С. Ниже, в таблице 4 показаны относительные значения, вычисленные применительно к активности в момент 0 часов, которая принята за 100.

[0034]

[0035] Было показано, что при культивировании микроорганизмов в защищенных от света условиях и при сохранении фермента из микробных клеток в течение соответствующего периода времени и с соблюдением нужной температуры, также при защите от действия света, ферментативная активность усиливается. В том случае, когда применяли фермент, полученный из микроорганизмов, которые использовали в указанных выше примерах и стандартных примерах, фермент терял свою активность при сохранении при температуре 50°С, то есть не наблюдался эффект активации фермента.

[0036] <Пример 2>

Эффект усиления ферментативной активности определяли по процедуре примера 1, с тем исключением, что в качестве культивируемых микроорганизмов здесь был взят штамм Rhodococcus rhodochrous J1 и для культивирования использовали баночный ферментер на 3 л (производство компании Takasugi Seisakusho), а не коническую колбу объемом 500 мл. После культивирования концентрация микробных клеток в сухом состоянии составляла 39,8 г/л. Ниже, в таблице 5, показаны относительные значения, вычисленные применительно к активности в момент 0 ч, которая принята за 100.

[0037] <Стандартный пример 2>

Эффект усиления ферментативной активности определяли по процедуре примера 2, с тем исключением, что изменили температуру сохранения, которая здесь составляла 50°С. Ниже, в таблице 5, показаны относительные значения, вычисленные применительно к активности в момент 0 ч, которая принята за 100.

<Стандартный пример 3>

Эффект усиления ферментативной активности определяли по процедуре примера 2, с тем исключением, что изменили длительность периода сохранения, которая здесь составляла 48 ч. Ниже, в таблице 5, показаны относительные значения, вычисленные применительно к активности в момент 0 ч, которая принята за 100.

<Сравнительный пример 4>

Эффект усиления ферментативной активности определяли по процедуре примера 2, с тем исключением, что здесь, в качестве устройства для разрушения клеток, использовали ультразвуковой генератор (VP-300, производство компании TAITEC). Для работы с ультразвуковым дезинтегратором отбирали 1 мл суспензии полученных при культивировании микробных клеток в коническую пробирку на 15 мл (производство компании Corning) и проводили разрушение клеток по 5 мин с интенсивностью на уровне 20%, при охлаждении льдом. Ниже, в таблице 5, показаны относительные значения, вычисленные применительно к активности в момент 0 ч, которая принята за 100.

<Сравнительный пример 5>

Эффект усиления ферментативной активности определяли по процедуре примера 2, с тем исключением, что здесь не предпринимались меры по защите клеток от действия света. Ниже, в таблице 5, показаны относительные значения, вычисленные применительно к активности в момент 0 ч, которая принята за 100.

[0038]

[0039] Было показано, что при культивировании микроорганизмов в защищенных от света условиях и при выдерживании фермента из микробных клеток в течение соответствующего периода времени и с соблюдением нужной температуры, также при защите от действия света, ферментативная активность усиливается. В том случае, когда применяли фермент, полученный из микроорганизмов, которые использовали в указанных выше примерах, сравнительных примерах и стандартных примерах, эффект активации фермента не наблюдался в условиях сохранения при температуре 50°С. Не наблюдался также эффект активации фермента ни в случае сохранения при температуре от 30 до 37°С, ни в случае сохранения в течение 48 ч. Однако при использовании гомогенизатора высокого давления наблюдался эффект активации фермента.

[0040] <Пример 3>

Эффект усиления ферментативной активности определяли по процедуре примера 1, с тем исключением, что в качестве культивируемых микроорганизмов здесь был взят штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB41164, а для разрушения микробных клеток использовали ручной френч-пресс (Модель 5502, производство компании Otake Seisakusho), представляющий собой вариант гомогенизатора высокого давления. Концентрация микробных клеток в сухом состоянии после культивирования составляла 5,4 г/л. Ниже, в таблице 6, показаны относительные значения, вычисленные применительно к активности в момент 0 ч, которая принята за 100.

[0041] <Стандартный пример 6>

Эффект усиления ферментативной активности определяли по процедуре примера 3, с тем исключением, что изменили температуру сохранения, которая здесь составляла 50°С. Ниже, в таблице 6, показаны относительные значения, вычисленные применительно к активности в момент 0 ч, которая принята за 100.

<Стандартный пример 7>

Эффект усиления ферментативной активности определяли по процедуре примера 3, с тем исключением, что изменили длительность периода сохранения, которая здесь составляла 48 ч. Ниже, в таблице 6, показаны относительные значения, вычисленные применительно к активности в момент 0 ч, которая принята за 100.

<Сравнительный пример 8>

Эффект усиления ферментативной активности определяли по процедуре примера 3, с тем исключением, что здесь, в качестве устройства для разрушения клеток, использовали ультразвуковой генератор (VP-300, производство компании TAITEC). Для работы с ультразвуковым дезинтегратором отбирали 1 мл суспензии полученных при культивировании микробных клеток в коническую пробирку на 15 мл (производство компании Corning) и проводили разрушение клеток по 5 мин интенсивностью на уровне 20% при охлаждении льдом. Ниже, в таблице 6, показаны относительные значения, вычисленные применительно к активности в момент 0 ч, которая принята за 100.

<Сравнительный пример 9>

Эффект усиления ферментативной активности определяли по процедуре примера 3, с тем исключением, что здесь не предпринимались меры по защите клеток от действия света. Ниже, в таблице 6, показаны относительные значения, вычисленные применительно к активности в момент 0 ч, которая принята за 100.

[0042]

[0043] Было показано, что при культивировании микроорганизмов в защищенных от света условиях и при выдерживании фермента из микробных клеток в течение соответствующего периода времени и с соблюдением нужной температуры, также при защите от действия света, ферментативная активность усиливается. В том случае, когда применяли фермент, полученный из микроорганизмов, которыйиспользовали в указанных выше примерах, сравнительных примерах и стандартных примерах, эффект активации фермента не наблюдался, если разрушение клеток проводили с использованием ультразвукового гомогенизатора. Кроме того, эффект активации также не наблюдался, если в процессе сохранения не проводилась защита от действия света.

Claims

1. Способ получения нитрилгидратазы, включающий следующие стадии:
(1) стадию культивирования микроорганизмов, обладающих активностью нитрилгидратазы, в защищенных от света условиях,
(2) стадию разрушения полученных при культивировании микробных клеток с использованием гомогенизатора высокого давления,
(3) стадию сохранения полученных, как указано выше, разрушенных микробных клеток при 4-37°С в условиях защиты их от действия света, и
(4) стадию получения супернатанта, содержащего нитрилгидратазу.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные микроорганизмы, обладающие активностью нитрилгидратазы, представляют собой микроорганизмы из рода Rhodococcus или из рода Pseudonocardia.

3. Способ сохранения нитрилгидратазы, включающий следующие стадии:
(1) стадию культивирования микроорганизмов, обладающих активностью нитрилгидратазы, в защищенных от света условиях,
(2) стадию разрушения полученных при культивировании микробных клеток с использованием гомогенизатора высокого давления,
(3) стадию сохранения полученных, как указано выше, разрушенных микробных клеток в течение 4-24 ч, при температуре от 4 до 37°С, в условиях защиты от действия света, и
(4) стадию получения супернатанта, содержащего нитрилгидратазу.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что указанные микроорганизмы, обладающие активностью нитрилгидратазы, представляют собой микроорганизмы из рода Rhodococcus или из рода Pseudonocardia.

5. Способ активации нитрилгидратазы, включающий следующие стадии:
(1) стадию культивирования микроорганизмов, обладающих активностью нитрилгидратазы, в защищенных от света условиях,
(2) стадию разрушения полученных при культивировании микробных клеток с использованием гомогенизатора высокого давления,
(3) стадию сохранения полученных, как указано выше, разрушенных микробных клеток в течение 4-24 ч, при температуре от 4 до 37°С, в условиях защиты от действия света, и
(4) стадию получения супернатанта, содержащего нитрилгидратазу.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что указанные микроорганизмы, обладающие активностью нитрилгидратазы, представляют собой микроорганизмы из рода Rhodococcus или из рода Pseudonocardia.

7. Способ получения активированной нитрилгидратазы, включающий следующие стадии:
(1) стадию культивирования микроорганизмов, обладающих активностью нитрилгидратазы, в защищенных от света условиях,
(2) стадию разрушения полученных при культивировании микробных клеток с использованием гомогенизатора высокого давления,
(3) стадию сохранения полученных, как указано выше, разрушенных микробных клеток в течение 4-24 ч, при температуре от 4 до 37°С, в условиях защиты от действия света, и
(4) стадию получения супернатанта, содержащего нитрилгидратазу.

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что указанные микроорганизмы, обладающие активностью нитрилгидратазы, представляют собой микроорганизмы из рода Rhodococcus или из рода Pseudonocardia.