CN104145017A - 酶的保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的课题在于提供一种廉价、简便地保存通过进行培养而获得的微生物菌体的酶并且在保存中提高酶活性的方法。一种腈水合酶的保存方法,其特征在于,将具有腈水合酶活性的微生物在遮光下培养后的菌体用高压式均质器破碎并遮光保存。
Description
技术领域
本发明涉及具有腈水合酶活性的微生物的酶的保存方法、活化方法和活化腈水合酶的制造方法。
背景技术
微生物生产的酶作为化学转换反应的催化剂被用于多种场合。特别是通过利用具有氰基的水合或水解能力的腈水合酶、腈水解酶等,可以廉价地制造化学工业上重要的酰胺、羧酸、α-羟基羧酸等。进而,通过利用具有光学特异性水合能力或光学特异性水解能力的上述酶,还可以制造作为医药、农药的制造原料中的重要的光学活性羧酸、氨基酸、α-羟基羧酸等。
在以来自微生物的酶为催化剂的化学转换反应中,需要使培养和收菌后的微生物稳定地保存至使用时。即,必须以没有因杂菌混入而发生腐败或溶菌从而酶的催化能力丧失或降低的方式进行保存。因此,一般而言,通过在稳定剂、代谢抑制剂、高浓度盐类的存在下进行保存,抑制微生物菌体保存时的微生物酶的失活、腐败、溶菌,用于化学转换反应。在未添加上述稳定剂等的情况下,已知通过冷冻、冷藏或通气搅拌,在维持酶的活性的同时进行保存。
在具有腈水合酶活性的微生物的情况下,已知有例如在含有高浓度的无机盐类的水溶液中进行保存的方法(专利文献1)、通过冷冻进行保存的方法(专利文献2)、在控制pH的条件下进行通气搅拌的方法(专利文献3)等。
另一方面还已知下述方法,以提高菌体催化剂使用者的便利性为目的,将菌体破碎并分离固态物质,从而纯化菌体酶(专利文献4)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特许第3163224号
专利文献2:日本特开2003-219870号公报
专利文献3:日本特开2003-144144号公报
专利文献4:国际公开第2011/007725号小册子
发明内容
然而,上述那样的公知的保存方法工序复杂,经济性不高。进而,酶的活性会降低,因而,尚不能说是令人满意的方法。例如,专利文献1中记载的使用含有高浓度的无机盐类的水溶液的方法需要在后续工序中进行洗涤等,因此,不仅有可能对制品的质量产生影响,而且制造工序也变得复杂。此外,专利文献2中记载的通过冷冻进行保存的方法中,冷冻、融化操作繁杂,此外伴随该操作还存在酶活性丧失、降低的问题。专利文献3中记载的在控制pH的条件下进行通气搅拌而保存的方法需要酸、碱化学品、进行通气搅拌的设备、动力。专利文献4中记载了将菌体破碎并在酸、加热处理后进行离心分离的方法,但随着工序的进行,酶活性降低,因此,还有改善的余地。
本发明的目的在于,提供与现有方法相比廉价、简便地对进行培养而获得的微生物菌体的酶进行保存的方法。
本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究。其结果发现,通过将具有腈水合酶活性的微生物在遮光下培养后的菌体用高压式均质器破碎并遮光保存,微生物菌体的酶廉价、简便地被保存,且保存中酶活性提高。即,发现实现与上述课题一致的微生物菌体的酶的保存方法,从而完成了本发明。
即,本发明涉及将通过进行培养而获得的微生物菌体的酶与现有方法相比廉价、简便地保存、并且在保存中提高酶活性的方法,其主旨在于一种具有腈水合酶活性的酶的保存方法,其特征为,将具有腈水合酶活性的微生物在遮光下培养后的菌体用高压式均质器破碎并遮光保存。
作为本发明方法的更优选的方法,可以列举以下的方式,即,将破碎后的菌液按规定的方法保存、使用具有腈水合酶活性的规定的微生物。
进一步作为另一优选方式,可以列举将破碎后的菌液在4~37℃保存、将破碎后的菌液保存4~24小时、使用属于红球菌属(Rhodococcus)或假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)的微生物。
本发明的主旨进一步在于具有腈水合酶活性的酶的活化方法和活化腈水合酶的制造方法,所述活化方法的特征为,将具有腈水合酶活性的微生物在遮光下培养后的菌体用高压式均质器破碎并遮光保存。
根据本发明,通过将悬浮于分散介质的遮光下培养的微生物菌体用高压式均质器破碎并遮光保存,即使不进行通气、搅拌、不进行pH调节、加热处理,也可以保持维持了没有腐败、酶的劣化的腈水合酶等的酶活性的状态,即,也可以进行保存。此外,根据本发明,还可以在保存中提高酶活性。即,提供一种可以大幅削减对现有的保存方法而言必需的劳力、成本、能够在工业上令人满意的菌体酶的保存方法。
具体实施方式
以下详细地对本发明进行说明。以下的实施方式是用于说明本发明的例示,本发明的宗旨并不仅限于该实施方式。在不脱离其主旨的范围内,本发明可以以各种形态进行实施。
在本发明中,具有腈水合酶活性的微生物具有生成作为目的的酶催化剂并使其在菌体内累积或将其分泌至菌体外的性质。该微生物包括从自然界分离的微生物和基因重组微生物。作为这样的微生物的代表例,可以列举例如具有腈水合酶活性的属于红球菌(Rhodococcus)属、戈登菌(Gordona)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、假诺卡氏菌(Pseudonocardia)属、土壤芽孢杆菌(Geobacillus)属的微生物。进而,还可以列举导入有这些微生物的腈水合酶基因的重组微生物。其中,就工业性而言,优选红球菌属、假诺卡氏菌属和导入有这些微生物的腈水合酶基因的重组大肠杆菌和重组红球菌属细菌。例如,作为红球菌属的微生物的具体例子,可以列举日本特公平6-55148号公报中记载的玫瑰红红球菌J-1株(Rhodococcus rhodochrous J-1)和国际公开小册子WO2005/054456号中记载的玫瑰红红球菌NCIMB41164株。玫瑰红红球菌J-1株以保藏编号“FERM BP-1478”于1987年9月18日保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构专利生物保藏中心(〒305-8566茨城县筑波市东1-1-1中央第6(以下,在本说明书中同样))。此外,NCIMB41164株于2003年3月5日以保藏编号NCIMB41164保藏于National Collection of Industrial andMarine Bacteria(NCIMB)(NCIMB Ltd Ferguson Building Craibstone EstateBucksburn Aberdeen AB219YA)。作为假诺卡氏菌属的具体例子,可以列举日本特开平09-275978号公报中记载的嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardiathermophila JCM3095)。该菌株作为“FERM BP-5785”保藏于同一专利生物保藏中心。
在本发明中,可以单独使用从上述微生物中选择的1种,或组合使用2种以上。
具有腈水合酶活性的微生物的培养除了在遮光下进行培养以外,只要在适于微生物的培养的常用条件下进行培养即可。
腈水合酶是指,具有使腈化合物水解而生成相应的酰胺化合物的能力的酶。可以列举前述专利文献2中记载的作为编码腈水合酶的核酸及其序列的例子。这样的核酸可以通过通常的分子生物学方法导入到微生物细胞内并进行表达(关于这些分子学方法,参照以下:Sambrook,Fritsch and Maniatis,"MolecularCloning:A Laboratory Manual"2nd Edition(1989),Cold Spring Harbor LaboratoryPress)。即,在本发明中,既可以使用由具有天然的腈水合酶活性的微生物获得的酶,也可以使用使编码腈水合酶的核酸在微生物细胞内表达而获得的酶。在本发明中,可以单独使用由上述酶选择的1种或组合使用2种以上。
本发明中的“保存”意思是在罐、容器中保管菌体破碎物。此时,可以进行搅拌、通气以使罐、容器内的浓度没有偏差,在本发明中,不进行搅拌、通气而是进行静置也无妨。本发明中的“静置”意思是不进行搅拌、通气而在罐、容器中保管菌体破碎物。本发明中,作为遮光的方法,只要利用遮光性的罐、暗室在密闭容器中保存菌体破碎物即可。
本发明中,保存温度根据生产酶的微生物、酶的种类等的不同而变化,可以以酶活化为指标设定适当的保存温度。
本发明中,保存可以在通常室温下进行,从酶活化的观点出发,优选在4~37℃、更优选在4~25℃、进一步优选在4~15℃进行。如果保存温度比4℃低,则不仅菌体悬浊液有可能发生凝固,用于冷却的费用也有可能增高。此外,如果比37℃高,则由于菌体酶的作用,腈水合酶活性有可能降低。
本发明中,保存期限根据生产酶的微生物、酶的种类、保存温度等的不同而变化,可以以酶活化为指标设定适当的保存期限。保存期限通常为4~24小时为好,更优选为6~24小时。如果保存期限比4小时短,则腈水合酶活性有可能未充分提高。此外,如果比24小时长,则有可能由于温度、菌体酶而菌体悬浊液腐败,腈水合酶活性降低。
在通过本发明的方法保存菌体酶的情况下,与未遮光的情况相比,酶活性被活化。通常,前述腈水合酶活性相对于保存前的腈水合酶活性,保存后的腈水合酶活性超过100%。优选维持在103%以上,更优选维持在110%以上,进一步优选维持在120%。
腈水合酶活性可以通过本技术领域公知的任何方法进行测定,例如,可以通过对保存开始前与保存后相对于底物(例如丙烯腈)的丙烯酰胺生成反应速度进行比较等来测定。
本发明中的“分散介质”意思是成为破碎对象的微生物菌体的悬浮所使用的溶液。该分散介质的种类是任意的,可以是菌体培养时使用的液体培养基或将培养时使用的液体培养基用有机酸水溶液进行置换的介质。
作为有机酸水溶液的成分,只要不阻碍酶活性就没有特别限定。可以列举例如丙烯酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、草酸等羧酸类,其中,就维持丙烯酰胺的质量的观点而言,优选丙烯酸。
本发明的菌体破碎液的调制优选在对进行培养而获得的菌体进行化学试剂处理(例如日本特开平7-265091中公开的戊二醛处理)前实施。破碎方法可以以悬浮于分散介质的状态进行菌体破碎、使用高压式均质器。高压式均质器有弗氏细胞压碎器、连续压力式等,优选可以在工业上大量且稳定地获得菌体破碎液的连续压力式。破碎方法优选以悬浮于分散介质的状态用高压式均质器进行破碎。关于破碎时的温度,为了避免热变性,优选0℃~37℃,进一步优选0℃~25℃。破碎时的压力只要是能够使菌体破碎的压力就没有特别限制,可以调节至50~150MPa,优选调节至70~120MPa。破碎时的菌浓度没有特别限制,以干燥菌体换算为0.1~30质量%的范围即可。
其中,本发明中,也可以在保存破碎后的菌液后,分离固态物质而使用。分离固态物质的方法没有限定,可以列举例如离心分离等。分离操作时的温度优选为0~37℃,进一步优选为0~25℃。
实施例
以下,通过实施例对本发明的实施方法进行进一步详细地说明,但这些实施例是以例示本发明为目的,并非对本发明进行限定。以下的试验例(实施例和比较例)中,酶活性的评价通过下述方式进行:按规定方法保存培养过的菌体后,以后述的规定的方法使离心分离的上清与腈接触,对此时的水合反应速度进行测定。
以下的实施例和比较例中,%表示质量%。
<具有腈水合酶基因的红球菌(Rhodococcus)属细菌转化子的制作>
作为导入有来自玫瑰红红球菌J1(Rhodococcus rhodochrous J1)的腈水合酶基因的转化子,使用按日本特开2008-154552号公报所述的方法制作的玫瑰红红球菌ATCC12674/pSJ042(Rhodococcus rhodochrous ATCC12674/pSJ042)。
对于导入有来自嗜热假诺卡氏菌JCM3095(Pseudonocardia thermophilaJCM3095)的腈水合酶基因的转化子使用将日本特开2011-200132号公报记载的质粒pSJ-N02A以与记载的方法同样地导入ATCC12674株的转化子玫瑰红红球菌ATCC12674/pSJ-N02A(Rhodococcus rhodochrousATCC12674/pSJ-N02A)。
<菌体的培养>
(1)ATCC12674株转化子的培养
在500ml的三角瓶中,加入将表-1的成分溶解于自来水而调制的培养基(pH7.2)100ml,通过121℃、20分钟的高压灭菌进行灭菌。在该培养基中,以尿素为0.1g/L、卡那霉素为50mg/L的方式进行添加,接种ATCC12674/pSJ042或ATCC12674/pSJ-N02A,在遮光下以30℃、230rpm培养72小时。将试验例中使用的培养基成分示于以下的表-1中。
(2)玫瑰红红球菌J-1(Rhodococcus rhodochrous J-1)株的培养
在3L发酵罐(高杉制作所制)中加入将表-2的成分溶解于自来水而调制的培养基(pH7.0)2.5L,通过121℃、20分钟的高压灭菌进行灭菌。在该培养基中,接种以与(1)同样的方法培养的玫瑰红红球菌J-1(Rhodococcusrhodochrous J-1)20mL,遮光培养42小时。培养温度为35℃。将试验例中使用的培养基成分示于以下的表-2中。
(3)玫瑰红红球菌NCIMB-41164(Rhodococcus rhodochrousNCIMB-41164)株的培养
在500ml的三角瓶中加入将表-3的成分溶解于自来水而调制的培养基(pH7.2)100ml,通过121℃、20分钟的高压灭菌进行灭菌。在其中以尿素为5.0g/L的方式进行添加,接种玫瑰红红球菌NCIMB-41164(Rhodococcusrhodochrous NCIMB-41164),在遮光下以30℃、230rpm培养65小时。将试验例中使用的培养基成分示于以下的表-3中。
[表1]
表-1
葡萄糖 | 15g/L |
酵母提取物 | 1g/L |
谷氨酸钠 | 10g/L |
磷酸二氢钾 | 0.5g/L |
磷酸氢二钾 | 0.5g/L |
七水合硫酸镁 | 0.5g/L |
六水合氯化钴 | 0.01g/L |
[表2]
表-2
果糖 | 20g/L |
聚蛋白胨 | 10g/L |
谷氨酸钠 | 13g/L |
磷酸二氢钾 | 2g/L |
磷酸氢二钾 | 2g/L |
七水合硫酸镁 | 1g/L |
甲基脲 | 0.32g/L |
乙醇 | 4ml/L |
六水合氯化钴 | 0.1g/L |
[表3]
表-3
葡萄糖 | 10g/L |
酵母提取物 | 3g/L |
蛋白胨 | 1g/L |
磷酸二氢钾 | 0.3g/L |
磷酸氢二钾 | 0.7g/L |
七水合硫酸镁 | 0.5g/L |
六水合氯化钴 | 0.01g/L |
<干燥菌体浓度的测定>
“干燥菌体浓度(干燥菌体质量[%])”是指用菌体悬浊液中所含的菌体的干燥质量的比率表示,具体而言,通过从使菌体悬浊液在120℃的干燥机中干燥3小时时的干燥前后的质量比(百分率:菌液干燥残渣比例[%])减去对将菌体悬浊液分离为微生物菌体层和实质上不含菌体的液层时的该液层同样地进行干燥时干燥前后的质量比(百分率:上清盐浓度[%])而求得的值。
<腈水合酶活性的测定>
腈水合酶活性由将菌体破碎并分离固态物质后的上清液的丙烯酰胺生成反应速度算出。通过在上清液中添加作为底物的丙烯腈的水溶液使反应开始,在10℃振荡10分钟后,通过菌体的过滤分离和磷酸的添加使反应停止,用气相色谱(GC-14B、岛津制作所)进行分析。分析条件为:使用填充有PorapackPS(沃特世(Waters)社)的1m玻璃柱,柱温210℃,检测器使用230℃的FID。
本发明中的腈水合酶的酶活性作为1mg菌体在1分钟内产生的丙烯酰胺的量(μmol)而测定。
[试验例]
<实施例1>
对于如前所述进行培养而得到的ATCC12674/pSJ042和ATCC12674/pSJ-N02A,测定干燥菌体浓度。然后,在作为高压式均质器的小型菌体破碎装置PANDA2K(尼鲁索尔维(Niro Soavi)社制)中,使用进行了培养而得到的菌体悬浊液,将菌体破碎。破碎压力为100MPa,破碎时的温度为4℃。
将调制破碎液之后不久(第0小时)的破碎液、以及于暗处在4~37℃静置保存4~24小时后的破碎液在4℃、15000rpm进行5分钟离心分离,得到上清液。将对该上清液的腈水合酶活性进行测定的结果以第0小时的活性作为100时的相对值示于表-4。
<比较例1>
将保存温度设为50℃,除此以外,进行与实施例1同样地操作,对酶活性的提高效果进行判断。作为结果,将以第0小时的活性作为100时的相对值示于表-4。
[表4]
表-4
可知,如果在遮光下培养微生物,在遮光下将来自微生物菌体的酶在根据酶确定的温度下保存根据酶确定的期限,则酶活性提高。在使用来自上述实施例和比较例中所用的微生物的酶的情况下,保存温度为50℃则酶失活,未获得酶活化效果。
<实施例2>
培养过的菌体为玫瑰红红球菌J1(Rhodococcus rhodochrous J1),代替500ml的三角瓶,使用3L发酵罐(高杉制作所制)进行培养,除此以外,进行与实施例1同样地操作,对酶活性的提高效果进行判断。其中,培养后的干燥菌体浓度为39.8g/L。作为结果,将以第0小时的活性作为100时的相对值示于表-5。
<比较例2>
将保存温度设为50℃,除此以外,进行与实施例2同样地操作,对酶活性的提高效果进行判断。作为结果,将以第0小时的活性作为100时的相对值示于表-5。
<比较例3>
将保存时间设为48小时,除此以外,进行与实施例2同样地操作,对酶活性的提高效果进行判断。作为结果,将以第0小时的活性作为100时的相对值示于表-5。
<比较例4>
使用超声波发生器(TAITEC制、VP-300)作为破碎装置,除此以外,进行与实施例2同样地操作,对酶活性的提高效果进行判断。在超声波破碎操作中,在15ml圆锥管(康宁公司(CORNING)制)中采取培养过的菌体悬浊液1ml,用冰冷却的同时以强度20%应用5分钟。作为结果,将以第0小时的活性作为100时的相对值示于表-5。
<比较例5>
未进行遮光操作,除此以外,进行与实施例2同样地操作,对酶活性的提高效果进行判断。作为结果,将以第0小时的活性作为100时的相对值示于表-5。
[表5]
表-5
可知,如果在遮光下培养微生物,在遮光下将来自微生物菌体的酶在根据酶确定的温度下静置根据酶确定的时间,则酶活性提高。在使用来自上述实施例和比较例中所用的微生物的酶的情况下,在保存温度为50℃时未获得酶活化效果。此外,在保存温度为30~37℃、保存期限为48小时未获得酶活化效果。此外,通过使用高压式均质器可以获得酶活化效果。
<实施例3>
培养的菌体为玫瑰红红球菌NCIMB41164(Rhodococcus rhodochrousNCIMB41164),菌体的破碎使用作为高压式均质器的手动式弗氏细胞压碎器(大岳制作所5502型),除此以外,进行与实施例1同样地操作,对酶活性的提高效果进行判断。其中,培养后的干燥菌体浓度为5.4g/L。作为结果,将以第0小时的活性作为100时的相对值示于表-6。
<比较例6>
将保存温度设为50℃,除此以外,进行与实施例3同样地操作,对酶活性的提高效果进行判断。作为结果,将以第0小时的活性作为100时的相对值示于表-6。
<比较例7>
将保存时间设为48小时,除此以外,进行与实施例3同样地操作,对酶活性的提高效果进行判断。作为结果,将以第0小时的活性作为100时的相对值示于表-6。
<比较例8>
使用超声波发生器(TAITEC制、VP-300)作为破碎装置,除此以外,进行与实施例3同样地操作,对酶活性的提高效果进行判断。在超声波破碎操作中,在15ml圆锥管(CORNING制)中采取培养过的菌体悬浊液1ml,在用冰冷却的同时以强度20%应用5分钟。作为结果,将以第0小时的活性作为100时的相对值示于表-6。
<比较例9>
未进行遮光操作,除此以外,进行与实施例3同样地操作,对酶活性的提高效果进行判断。作为结果,将以第0小时的活性作为100时的相对值示于表-6。
[表6]
表-6
可知,如果在遮光下培养微生物,在遮光下将来自微生物菌体的酶在根据酶确定的温度下静置根据酶确定的时间,则酶活性提高。在使用来自上述实施例和比较例中所用的微生物的酶的情况下,对于由超声波式均质器进行的菌体破碎,未获得酶活化效果。此外,在保存时未遮光的情况下,未获得酶活化效果。
Claims (6)
1.一种腈水合酶的保存方法,包括以下的工序:
(1)在遮光下对具有腈水合酶活性的微生物进行培养的工序,
(2)使用高压式均质器对培养过的微生物菌体进行破碎的工序,
(3)将得到的菌体破碎物在遮光下、4~37℃保存4~24小时的工序。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,具有腈水合酶活性的微生物为属于红球菌属或假诺卡氏菌属的微生物。
3.一种腈水合酶的活化方法,包括以下的工序:
(1)在遮光下对具有腈水合酶活性的微生物进行培养的工序,
(2)使用高压式均质器对培养过的微生物菌体进行破碎的工序,
(3)将得到的菌体破碎物在遮光下、4~37℃保存4~24小时的工序。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,具有腈水合酶活性的微生物为属于红球菌属或假诺卡氏菌属的微生物。
5.一种活化腈水合酶的制造方法,包括以下的工序:
(1)在遮光下对具有腈水合酶活性的微生物进行培养的工序,
(2)使用高压式均质器对培养过的微生物菌体进行破碎的工序,
(3)将得到的菌体破碎物在遮光下、4~37℃保存4~24小时的工序。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,具有腈水合酶活性的微生物为属于红球菌属或假诺卡氏菌属的微生物。
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