JPWO2013129179A1 - 酵素の保存方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、培養して得られた微生物菌体の酵素を、従来法と比較して安価・簡便に保存する方法を提供することを目的とする。
すなわち、本発明は、培養して得られた微生物菌体の酵素を、従来法と比較して安価・簡便に保存し、且つ保存中に酵素活性を向上させる方法に係わり、その要旨は、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物の遮光下培養後の菌体を、高圧式ホモジナイザーを用いて破砕し、光を遮断して保存することを特徴とするニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素の保存方法に存する。
本発明においては、上記微生物から選択される1種を単独で又は2種以上を組み合わせて用いることができる。
ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物の培養は、遮光下で培養をすること以外は、微生物の培養に適した通常の条件で、培養すればよい。
本発明において、保存は通常室温で可能であるが、酵素活性化の観点から好ましくは4〜37℃、より好ましくは4〜25℃、さらに好ましくは4〜15℃で行われる。保存温度が4℃よりも低いと菌体懸濁液が凝固する可能性があるだけでなく、冷却のための費用が高くなる恐れがある。また、37℃よりも高くなると菌体酵素によってはニトリルヒドラターゼ活性が低下する恐れがある。
ニトリルヒドラターゼ活性は、当該技術分野で公知のいずれかの方法により測定できるが、例えば、保存開始前と保存後の基質(例えば、アクリロニトリル)に対するアクリルアミド生成反応速度を比較すること等により測定することが可能である。
以下の実施例及び比較例に於ける%表示は質量%である。
Rhodococcus rhodochrous J1由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子を導入した形質転換体として、特開2008-154552号公報に記載の方法で作製されたRhodococcus rhodochrous ATCC12674/pSJ042を用いた。
Pseudonocardia thermophila JCM3095由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子を導入した形質転換体には、特開2011-200132号公報に記載のプラスミドpSJ-N02Aを、記載の方法と同様にしてATCC12674株に導入した、形質転換体Rhodococcus rhodochrous ATCC12674/pSJ-N02Aを用いた。
(1)ATCC12674株形質転換体の培養
500mlの三角フラスコに表−1の成分を水道水に溶解して調製した培地(pH7.2)100mlを入れ、121℃、20分のオートクレーブにより滅菌した。この培地に、尿素0.1g/L、カナマイシン50mg/Lとなるよう添加し、ATCC12674/pSJ042またはATCC12674/pSJ-N02Aを接種し、遮光下で30℃、230rpmで72時間培養した。試験例で使用した培地成分を以下の表−1に示す。
(2)Rhodococcus rhodochrous J-1株の培養
3Lジャーファーメンター(高杉製作所製)に表−2の成分を水道水に溶解して調製した培地(pH7.0)2.5Lを入れ、121℃、20分のオートクレーブにより滅菌した。この培地に、(1)と同様の方法で培養したRhodococcus rhodochrous J-1を20mL接種し、光を遮断して42時間培養した。培養温度は35℃であった。試験例で使用した培地成分を以下の表−2に示す。
(3)Rhodococcus rhodochrous NCIMB-41164株の培養
500mlの三角フラスコに表−3の成分を水道水に溶解して調製した培地(pH7.2)100mlを入れ、121℃、20分のオートクレーブにより滅菌した。これに、尿素5.0g/Lとなるよう添加し、Rhodococcus rhodochrous NCIMB-41164を接種し、遮光下で30℃、230rpmで65時間培養した。試験例で使用した培地成分を以下の表−3に示す。
「乾燥菌体濃度(乾燥菌体質量[%])」とは、菌体懸濁液に含まれる菌体の乾燥質量の比率により表され、具体的には、菌体懸濁液を120℃の乾燥機で3時間乾燥させた時の乾燥前後の質量比(百分率:菌液乾燥残渣割合[%])から、菌体懸濁液を微生物菌体層と実質的に菌体を含まない液層に分離した際の該液層を同様に乾燥させた時の乾燥前後の質量比(百分率:上清塩濃度[%])を差引くことにより求めたものである。
ニトリルヒドラターゼ活性は、菌体を破砕して固形物を分離した上澄み液によるアクリルアミド生成反応速度から算出した。基質であるアクリロニトリルの水溶液を上澄み液に添加することで反応を開始し、10℃で10分間振盪した後、菌体の濾過分離とリン酸添加により反応を停止させ、ガスクロマトグラフィ(GC−14B、島津製作所)で分析した。分析条件は、Porapack PS(ウォーターズ社)を充填した1mガラスカラムを用い、カラム温度210℃、検出器は230℃のFIDを使用した。
本発明におけるニトリルヒドラターゼの酵素活性は、1分間に菌体1mgが生産するアクリルアミドの量(μmol)として測定した。
<実施例1>
前述の通り培養を行って得たATCC12674/pSJ042、およびATCC12674/pSJ-N02Aについて、乾燥菌体濃度を測定した。次に、高圧式ホモジナイザーである小型菌体破砕装置PANDA2K(Niro Soavi社製)にて、培養を行って得た菌体懸濁液を用いて、菌体を破砕した。破砕圧力は100MPa、破砕時の温度は4℃であった。
破砕液を調製した直後(0時間目)と、暗所にて4〜37℃で静置することで4〜24時間保存した破砕液を、4℃、15000rpmにて5分間、遠心分離を行って上澄み液を得た。この上澄み液のニトリルヒドラターゼ活性を測定した結果、0時間目の活性を100としたときの相対値を表−4に示す。
保存温度を50℃にした以外は実施例1と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。結果、0時間目の活性を100としたときの相対値を表−4に示す。
培養した菌体がRhodococcus rhodochrous J1であり、500mlの三角フラスコの代わりに3Lジャーファーメンター(高杉製作所製)を用いて培養した以外は実施例1と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。なお、培養後の乾燥菌体濃度は、39.8g/Lであった。結果、0時間目の活性を100としたときの相対値を表−5に示す。
保存温度を50℃にした以外は実施例2と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。結果、0時間目の活性を100としたときの相対値を表−5に示す。
<比較例3>
保存時間を48時間にした以外は実施例2と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。結果、0時間目の活性を100としたときの相対値を表−5に示す。
<比較例4>
破砕装置として超音波発生機(TAITEC製、VP−300)を使用した以外は実施例2と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。超音波破砕操作においては、15mlコニカルチューブ(CORNING製)に培養した菌体懸濁液を1ml採取し、氷冷しながら強度20%にて5分間適用した。結果、0時間目の活性を100としたときの相対値を表−5に示す。
<比較例5>
遮光操作を行わなかった以外は実施例2と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。結果、0時間目の活性を100としたときの相対値を表−5に示す。
培養した菌体がRhodococcus rhodochrous NCIMB41164であり、菌体の破砕に高圧式ホモジナイザーである手動式フレンチプレス(大岳製作所 5502型)を用いた以外は実施例1と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。なお、培養後の乾燥菌体濃度は、5.4g/Lであった。結果、0時間目の活性を100としたときの相対値を表−6に示す。
保存温度を50℃にした以外は実施例3と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。結果、0時間目の活性を100としたときの相対値を表−6に示す。
<比較例7>
保存時間を48時間にした以外は実施例3と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。結果、0時間目の活性を100としたときの相対値を表−6に示す。
<比較例8>
破砕装置として超音波発生機(TAITEC製、VP−300)を使用した以外は実施例3と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。超音波破砕操作においては、15mlコニカルチューブ(CORNING製)に培養した菌体懸濁液を1ml採取し、氷冷しながら強度20%にて5分間適用した。結果、0時間目の活性を100としたときの相対値を表−6に示す。
<比較例9>
遮光操作を行わなかった以外は実施例3と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。結果、0時間目の活性を100としたときの相対値を表−6に示す。
以下の実施例、比較例及び参考例に於ける%表示は質量%である。
保存温度を50℃にした以外は実施例1と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。結果、0時間目の活性を100としたときの相対値を表−4に示す。
保存温度を50℃にした以外は実施例2と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。結果、0時間目の活性を100としたときの相対値を表−5に示す。
<参考例3>
保存時間を48時間にした以外は実施例2と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。結果、0時間目の活性を100としたときの相対値を表−5に示す。
<比較例4>
破砕装置として超音波発生機(TAITEC製、VP−300)を使用した以外は実施例2と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。超音波破砕操作においては、15mlコニカルチューブ(CORNING製)に培養した菌体懸濁液を1ml採取し、氷冷しながら強度20%にて5分間適用した。結果、0時間目の活性を100としたときの相対値を表−5に示す。
<比較例5>
遮光操作を行わなかった以外は実施例2と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。結果、0時間目の活性を100としたときの相対値を表−5に示す。
保存温度を50℃にした以外は実施例3と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。結果、0時間目の活性を100としたときの相対値を表−6に示す。
<参考例7>
保存時間を48時間にした以外は実施例3と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。結果、0時間目の活性を100としたときの相対値を表−6に示す。
<比較例8>
破砕装置として超音波発生機(TAITEC製、VP−300)を使用した以外は実施例3と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。超音波破砕操作においては、15mlコニカルチューブ(CORNING製)に培養した菌体懸濁液を1ml採取し、氷冷しながら強度20%にて5分間適用した。結果、0時間目の活性を100としたときの相対値を表−6に示す。
<比較例9>
遮光操作を行わなかった以外は実施例3と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。結果、0時間目の活性を100としたときの相対値を表−6に示す。
Claims (6)
- 以下の工程を含むニトリルヒドラターゼの保存方法。
(1)ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物を遮光下で培養する工程。
(2)培養した微生物菌体を高圧式ホモジナイザーを用いて破砕する工程。
(3)得られた菌体破砕物を遮光下で4〜24時間、4〜37℃で保存する工程。 - ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物が、Rhodococcus属又はPseudonocardia属に属する微生物であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 以下の工程を含むニトリルヒドラターゼの活性化方法。
(1)ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物を遮光下で培養する工程。
(2)培養した微生物菌体を高圧式ホモジナイザーを用いて破砕する工程。
(3)得られた菌体破砕物を遮光下で4〜24時間、4〜37℃で保存する工程。 - ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物が、Rhodococcus属又はPseudonocardia属に属する微生物であることを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 以下の工程を含む活性化ニトリルヒドラターゼの製造方法。
(1)ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物を遮光下で培養する工程。
(2)培養した微生物菌体を高圧式ホモジナイザーを用いて破砕する工程。
(3)得られた菌体破砕物を遮光下で4〜24時間、4〜37℃で保存する工程。 - ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物が、Rhodococcus属又はPseudonocardia属に属する微生物であることを特徴とする請求項5に記載の方法。
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