KR20140121428A - 효소의 보존 방법 - Google Patents

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KR20140121428A
KR20140121428A KR1020147022097A KR20147022097A KR20140121428A KR 20140121428 A KR20140121428 A KR 20140121428A KR 1020147022097 A KR1020147022097 A KR 1020147022097A KR 20147022097 A KR20147022097 A KR 20147022097A KR 20140121428 A KR20140121428 A KR 20140121428A
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에미 이시이
마사히토 오다
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미쯔비시 레이온 가부시끼가이샤
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Abstract

본 발명은 배양하여 얻어진 미생물 균체의 효소를, 저렴ㆍ간편하게 보존하고, 보존 중에 효소 활성을 향상시키는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 본 발명은 니트릴히드라타아제 활성을 갖는 미생물의 차광하 배양 후의 균체를 고압식 호모지나이저로 파쇄하고, 광을 차단하여 보존하는 것을 특징으로 하는 니트릴히드라타아제의 보존 방법에 관한 것이다.

Description

효소의 보존 방법{METHOD FOR PRESERVING ENZYME}
본 발명은, 니트릴히드라타아제 활성을 갖는 미생물의 효소를 보존하는 방법, 활성화하는 방법 및 활성화 니트릴히드라타아제의 제조 방법에 관한 것이다.
미생물이 생산하는 효소는, 화학 변환 반응의 촉매로서 많은 경우에 사용되고 있다. 특히, 니트릴기의 수화 또는 가수분해능을 갖는 니트릴히드라타아제, 니트릴라아제 등을 이용함으로써, 화학 공업상 중요한 아미드, 카르복실산, α-히드록시카르복실산 등을 저렴하게 제조하는 것이 가능해진다. 또한, 광학 특이적 수화능 또는 광학 특이적 가수분해능을 갖는 상기 효소를 이용함으로써, 의약, 농약의 제조 원료로서 중요한 광학 활성 카르복실산, 아미노산, α-히드록시카르복실산 등의 제조도 가능해진다.
미생물 유래의 효소를 촉매로 하는 화학 변환 반응에 있어서는, 배양 및 집균한 미생물을 사용시까지 안정적으로 보존하여 둘 필요가 있다. 즉, 잡균이 혼입되어 부패되거나 또는 용균됨으로써, 효소의 촉매능이 상실되거나 저하되지 않도록 보존해 두어야 한다. 따라서, 일반적으로는 안정제, 대사 저해제, 고농도 염류의 존재하에 보존함으로써 미생물 균체 보존시의 미생물 효소의 실활이나 부패, 용균을 억제하여, 화학 변환 반응에 사용하고 있다. 상기 안정제 등을 첨가하지 않는 경우에는, 동결이나 냉장, 또는 통기 교반에 의해 효소의 활성을 유지하면서 보존하는 것이 알려져 있다.
니트릴히드라타아제 활성을 갖는 미생물의 경우, 예를 들면 고농도의 무기 염류를 포함하는 수용액 중에서 보존하는 방법(특허문헌 1), 동결에 의해 보존하는 방법(특허문헌 2), pH 제어하에 통기 교반을 행하는 방법(특허문헌 3) 등이 알려져 있다.
한편, 균체 촉매 사용자의 편리성을 향상시키는 것을 목적으로서, 균체를 파쇄하여 고형물을 분리하고, 균체 효소를 정제하는 방법(특허문헌 4)이 알려져 있다.
일본 특허 제3163224호 일본 특허 공개 제2003-219870호 공보 일본 특허 공개 제2003-144144호 공보 국제 공개 제2011/007725호 팸플릿
그러나, 상기와 같은 공지된 보존 방법은 공정이 복잡하며, 경제성이 우수하지 않다. 또한, 효소의 활성이 저하되기 때문에, 아직 만족할만한 방법이라고는 할 수 없다. 예를 들면, 특허문헌 1에 기재되어 있는 고농도의 무기 염류를 포함하는 수용액을 사용하는 방법은, 후속 공정에서 세정 등을 행할 필요가 있기 때문에 제품의 품질에 영향을 줄 우려가 있을 뿐만 아니라, 제조 공정이 복잡해진다. 또한, 특허문헌 2에 기재되어 있는 동결에 의해 보존하는 방법에서는, 동결, 융해 조작이 번잡하며, 그의 조작에 따라 효소 활성이 상실되거나 저하된다는 문제가 있었다. 특허문헌 3에 기재되어 있는 pH 제어하에 통기 교반하여 보존하는 방법은, 산ㆍ알칼리 약품이나 통기 교반을 행하는 설비ㆍ동력이 필요로 된다. 특허문헌 4에는 균체를 파쇄하고, 산ㆍ가열 처리 후에 원심 분리를 행하는 방법이 기재되어 있지만, 공정을 거침에 따라 효소 활성이 저하된다는 점에서 개선의 여지가 있었다.
본 발명은, 배양하여 얻어진 미생물 균체의 효소를 종래법과 비교하여 저렴ㆍ간편하게 보존하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토를 행하였다. 그 결과, 니트릴히드라타아제 활성을 갖는 미생물의 차광하 배양 후의 균체를 고압식 호모지나이저를 사용하여 파쇄하고, 광을 차단하여 보존함으로써, 미생물 균체의 효소가 저렴ㆍ간편하게 보존되고, 보존 중에 효소 활성이 향상되는 것을 발견하였다. 즉, 상기 과제에 합치한 미생물 균체의 효소의 보존 방법이 달성되는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은, 배양하여 얻어진 미생물 균체의 효소를 종래법과 비교하여 저렴ㆍ간편하게 보존하고, 보존 중에 효소 활성을 향상시키는 방법에 관한 것이며, 그의 요지는 니트릴히드라타아제 활성을 갖는 미생물의 차광하 배양 후의 균체를 고압식 호모지나이저를 사용하여 파쇄하고, 광을 차단하여 보존하는 것을 특징으로 하는 니트릴히드라타아제 활성을 갖는 효소의 보존 방법에 있다.
본 발명 방법의 보다 바람직한 방법으로서 이하의 형태, 즉 파쇄한 균액을 소정의 방법으로 보존하는 것; 니트릴히드라타아제 활성을 갖는 소정의 미생물을 사용하는 것을 들 수 있다.
다른 바람직한 형태로서, 파쇄한 균액을 4 내지 37℃에서 보존하는 것; 파쇄한 균액을 4 내지 24시간 보존하는 것; 로도코커스(Rhodococcus)속 또는 슈도노카르디아(Pseudonocardia)속에 속하는 미생물을 사용하는 것을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 요지는, 니트릴히드라타아제 활성을 갖는 미생물의 차광하 배양 후의 균체를 고압식 호모지나이저를 사용하여 파쇄하고, 광을 차단하여 보존하는 것을 특징으로 하는 니트릴히드라타아제 활성을 갖는 효소의 활성화 방법; 및 활성화 니트릴히드라타아제의 제조 방법에 있다.
본 발명에 따르면, 분산매에 현탁시킨 차광하에 배양한 미생물 균체를 고압식 호모지나이저를 사용하여 파쇄하고, 광을 차단하여 보존함으로써, 통기나 교반을 행하지 않고, pH 조정이나 가열 처리 없이도 부패나 효소의 열화 없이 니트릴히드라타아제 등의 효소 활성을 유지한 상태를 유지하는 것, 즉 보존하는 것이 가능해진다. 또한, 본 발명에 따르면, 보존 중에 효소 활성을 향상시키는 것이 가능하다. 즉, 종래의 보존 방법에서 필요로 되어 온 노동력이나 비용을 대폭으로 삭감할 수 있으며, 공업적으로 만족할 수 있는 균체 효소의 보존 방법이 제공된다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 이하의 실시 형태는, 본 발명을 설명하기 위한 예시이며, 본 발명을 이 실시 형태만으로 한정하는 취지가 아니다. 본 발명은, 그의 요지를 일탈하지 않는 한 다양한 형태로 실시할 수 있다.
본 발명에 있어서 니트릴히드라타아제 활성을 갖는 미생물은, 목적으로 하는 효소 촉매를 생산하여 균체 내에 축적 또는 균체 외로 분비하는 성질을 갖는 것이다. 이 미생물에는 자연계로부터 단리된 미생물 및 유전자 재조합 미생물이 포함된다. 이러한 미생물의 대표예로서는, 예를 들면 니트릴히드라타아제 활성을 갖는 로도코커스(Rhodococcus)속, 고르도나(Gordona)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 슈도노카르디아(Pseudonocardia)속, 지오바실러스(Geobacillus)속에 속하는 미생물을 들 수 있다. 또한, 이 미생물의 니트릴히드라타아제 유전자를 도입한 재조합 미생물을 들 수 있다. 이 중에서도 공업적으로는, 로도코커스속, 슈도노카르디아속 및 이들 미생물의 니트릴히드라타아제 유전자를 도입한 재조합 대장균 및 재조합 로도코커스속 세균이 바람직하다. 예를 들면, 로도코커스속의 미생물의 구체예로서는, 일본 특허 공고 (평)6-55148호 공보에 기재된 로도코커스ㆍ로도크로스 J-1주(Rhodococcus rhodochrous J-1) 및 국제 공개 팸플릿 WO2005/054456호에 기재된 로도코커스ㆍ로도크로스 NCIMB41164주를 들 수 있다. 로도코커스ㆍ로도크로스 J-1주는 수탁 번호 「FERM BP-1478」로서, 1987년 9월 18일에 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 생물 기탁 센터(우편번호 305-8566 이바라끼껭 쯔꾸바시 히가시 1-1-1 주오 제6(이하, 본 명세서에 있어서 마찬가지임))에 기탁되어 있다. 또한, NCIMB41164주는, 2003년 3월 5일에 내셔널 콜렉션 오브 인더스트리얼 앤드 마린 박테리아(National Collection of Industrial and Marine Bacteria)(NCIMB)(애버딘 벅스번 크라이브스톤 이스테이트 퍼거슨 빌딩 NCIMB 엘티디(NCIMB Ltd Ferguson Building Craibstone Estate Bucksburn Aberdeen) AB219YA)에 수탁 번호 NCIMB41164로서 기탁되어 있다. 슈도노카르디아속의 구체예로서는, 일본 특허 공개 (평)09-275978호 공보에 기재된 슈도노카르디아ㆍ써모필라(Pseudonocardia thermophila JCM3095)를 들 수 있다. 당해 주는, 「FERM BP-5785」로서 동 특허 생물 기탁 센터에 기탁되어 있다.
본 발명에 있어서는, 상기 미생물로부터 선택되는 1종을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
니트릴히드라타아제 활성을 갖는 미생물의 배양은, 차광하에서 배양을 하는 것 이외에는 미생물의 배양에 적합한 통상의 조건으로 배양할 수 있다.
니트릴히드라타아제란, 니트릴 화합물을 가수분해하여, 대응하는 아미드 화합물을 생성하는 능력을 갖는 효소를 말하는 것이다. 니트릴히드라타아제를 코딩하는 핵산 및 그의 서열의 예로서는, 상기 특허문헌 2에 기재된 것을 들 수 있다. 이러한 핵산은, 통상의 분자 생물학적 방법에 의해 미생물 세포 내에 도입 및 발현 가능하다(이들 분자학적 방법에 대해서는, 이하를 참조: 문헌 [Sambrook, Fritsch and Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 2nd Edition(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press]). 즉, 본 발명에 있어서는, 천연의 니트릴히드라타아제 활성을 갖는 미생물로부터 얻어지는 효소를 사용할 수도 있고, 니트릴히드라타아제를 코딩하는 핵산을 미생물 세포 내에서 발현시켜 얻어지는 효소를 사용할 수도 있다. 본 발명에 있어서는, 상기 효소로부터 선택되는 1종을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서 「보존」이란, 탱크나 용기 중에 균체 파쇄물을 보관하는 것을 의미한다. 이때, 탱크나 용기 내의 농도가 치우치지 않도록 교반이나 통기를 할 수도 있지만, 본 발명에서는, 교반이나 통기를 행하지 않고 정치할 수도 있다. 본 발명에 있어서 「정치」란, 교반이나 통기를 하지 않고 탱크나 용기 중에 균체 파쇄물을 보관하는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 광을 차단하는 방법으로서는 차광성의 탱크나 암실에서 밀폐 용기 중에 균체 파쇄물을 보존할 수 있다.
본 발명에 있어서, 보존 온도는 효소를 생산하는 미생물, 효소의 종류 등에 따라 변화되지만, 효소 활성화를 지표로 적절한 보존 온도를 설정하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서, 보존은 통상 실온에서 가능하지만, 효소 활성화의 관점에서 바람직하게는 4 내지 37℃, 보다 바람직하게는 4 내지 25℃, 더욱 바람직하게는 4 내지 15℃에서 행해진다. 보존 온도가 4℃보다도 낮으면 균체 현탁액이 응고될 가능성이 있을 뿐만 아니라, 냉각을 위한 비용이 높아질 우려가 있다. 또한, 37℃보다도 높아지면 균체 효소에 따라서는 니트릴히드라타아제 활성이 저하될 우려가 있다.
본 발명에 있어서, 보존 기간은 효소를 생산하는 미생물, 효소의 종류, 보존 온도 등에 따라 변화되지만, 효소 활성화를 지표로 적절한 보존 기간을 설정하는 것이 가능하다. 보존 기간은 통상 4 내지 24시간일 수 있지만, 6 내지 24시간이 보다 바람직하다. 보존 기간이 4시간보다도 짧으면, 니트릴히드라타아제 활성이 충분히 향상되지 않을 우려가 있다. 또한, 24시간보다도 길면, 온도나 균체 효소에 따라서는 균체 현탁액이 부패하여 니트릴히드라타아제 활성이 저하될 우려가 있다.
본 발명의 방법에 의해 균체 효소를 보존한 경우, 차광을 하지 않는 경우에 비해 효소 활성이 활성화된다. 통상, 상기한 니트릴히드라타아제 활성은 보존 전의 니트릴히드라타아제 활성에 대하여 보존 후의 니트릴히드라타아제 활성이 100％를 초과한다. 바람직하게는 103％ 이상, 보다 바람직하게는 110％ 이상, 더욱 바람직하게는 120％ 유지된다.
니트릴히드라타아제 활성은, 당해 기술 분야에서 공지된 어느 하나의 방법에 의해 측정할 수 있지만, 예를 들면 보존 개시 전과 보존 후의 기질(예를 들면, 아크릴로니트릴)에 대한 아크릴아미드 생성 반응 속도를 비교하는 것 등에 의해 측정하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서 「분산매」란, 파쇄 대상이 되는 미생물 균체의 현탁에 사용하는 용액을 의미한다. 상기 분산매의 종류는 임의이며, 균체 배양시에 사용한 액체 배지, 또는 배양시에 사용한 액체 배지를 유기산 수용액으로 치환한 것일 수도 있다.
유기산 수용액의 성분으로서는, 효소 활성을 저해하지 않는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 아크릴산, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 옥살산 등의 카르복실산류를 들 수 있으며, 이 중에서도 아크릴아미드의 품질을 유지하는 점에서 아크릴산이 바람직하다.
본 발명의 균체 파쇄액의 제조는, 배양을 행하여 얻은 균체에 대하여 약제 처리(예를 들면 일본 특허 공개 (평)7-265091에 개시된 글루타르알데히드 처리)를 행하기 전에 실시하는 것이 바람직하다. 파쇄 방법은, 분산매에 현탁시킨 상태에서 균체 파쇄하는 고압식 호모지나이저를 사용할 수 있다. 고압식 호모지나이저에는, 프렌치 프레스, 연속 압력식 등이 있지만, 공업적으로 대량이면서도 안정적으로 균체의 파쇄액을 얻을 수 있는 연속 압력식이 바람직하다. 파쇄 방법은, 분산매로 현탁시킨 상태에서 고압식 호모지나이저로 파쇄하는 것이 바람직하다. 파쇄시의 온도는, 열 변성을 피하기 위해 0℃ 내지 37℃가 바람직하고, 0℃ 내지 25℃가 더욱 바람직하다. 파쇄시의 압력은, 균체를 파쇄할 수 있는 압력이면 특별히 제한되지 않지만, 50 내지 150MPa, 바람직하게는 70 내지 120MPa로 조절하는 것이 바람직하다. 파쇄할 때의 균 농도는 특별히 제한은 없지만, 건조 균체 환산으로 0.1 내지 30질량％의 범위로 할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 파쇄한 균액을 보존한 후, 고형물을 분리하여 사용할 수도 있다. 고형물을 분리하는 방법은 한정되지 않지만, 예를 들면 원심 분리 등을 들 수 있다. 분리 조작시의 온도는 0 내지 37℃가 바람직하고, 0 내지 25℃가 더욱 바람직하다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명의 실시 방법을 더욱 상세하게 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시를 목적으로 하는 것이며, 본 발명을 한정하는 것이 아니다. 이하의 시험예(실시예 및 비교예)에 있어서, 효소 활성의 평가는 배양한 균체를 소정법으로 보존한 후, 원심 분리한 상청을 후술하는 소정의 방법으로 니트릴과 접촉시켰을 때의 수화 반응 속도를 측정함으로써 행하였다.
이하의 실시예 및 비교예에 있어서의 ％ 표시는 질량％이다.
<니트릴히드라타아제 유전자를 갖는 로도코커스(Rhodococcus)속 세균 형질 전환체의 제작>
로도코커스 로도크로스 J1 유래의 니트릴히드라타아제 유전자를 도입한 형질 전환체로서, 일본 특허 공개 제2008-154552호 공보에 기재된 방법으로 제작된 로도코커스 로도크로스 ATCC12674/pSJ042를 사용하였다.
슈도노카르디아 써모필라 JCM3095 유래의 니트릴히드라타아제 유전자를 도입한 형질 전환체에는, 일본 특허 공개 제2011-200132호 공보에 기재된 플라스미드 pSJ-N02A를 기재된 방법과 마찬가지로 하여 ATCC12674주에 도입한 형질 전환체 로도코커스 로도크로스 ATCC12674/pSJ-N02A를 사용하였다.
<균체의 배양>
(1) ATCC12674주 형질 전환체의 배양
500ml의 삼각 플라스크에 표 1의 성분을 수돗물에 용해하여 제조한 배지(pH 7.2) 100ml를 넣고, 121℃, 20분의 오토클레이브에 의해 멸균하였다. 이 배지에 요소 0.1g/L, 카나마이신 50mg/L가 되도록 첨가하고, ATCC12674/pSJ042 또는 ATCC12674/pSJ-N02A를 접종하여, 차광하에서 30℃, 230rpm으로 72시간 배양하였다.시험예에서 사용한 배지 성분을 이하의 표 1에 나타낸다.
(2) 로도코커스 로도크로스 J-1주의 배양
3L 자 발효기(jar fermentor)(타카스기 세이사꾸쇼 제조)에 표 2의 성분을 수돗물에 용해하여 제조한 배지(pH 7.0) 2.5L를 넣고, 121℃, 20분의 오토클레이브에 의해 멸균하였다. 이 배지에, (1)과 마찬가지의 방법으로 배양한 로도코커스 로도크로스 J-1을 20mL 접종하고, 광을 차단하여 42시간 배양하였다. 배양 온도는 35℃였다. 시험예에서 사용한 배지 성분을 이하의 표 2에 나타낸다.
(3) 로도코커스 로도크로스 NCIMB-41164주의 배양
500ml의 삼각 플라스크에 표 3의 성분을 수돗물에 용해하여 제조한 배지(pH 7.2) 100ml를 넣고, 121℃, 20분의 오토클레이브에 의해 멸균하였다. 이것에 요소 5.0g/L가 되도록 첨가하고, 로도코커스 로도크로스 NCIMB-41164를 접종하고, 차광하에서 30℃, 230rpm으로 65시간 배양하였다. 시험예에서 사용한 배지 성분을 이하의 표 3에 나타낸다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
<건조 균체 농도의 측정>
「건조 균체 농도(건조 균체 질량[％])」란, 균체 현탁액에 포함되는 균체의 건조 질량의 비율에 의해 표시되며, 구체적으로는 균체 현탁액을 120℃의 건조기에서 3시간 건조시켰을 때의 건조 전후의 질량비(백분율: 균액 건조 잔사 비율[％])로부터, 균체 현탁액을 미생물 균체층과 실질적으로 균체를 포함하지 않는 액층으로 분리했을 때의 상기 액층을 마찬가지로 건조시켰을 때의 건조 전후의 질량비(백분율: 상청염 농도[％])를 뺌으로써 구한 것이다.
<니트릴히드라타아제 활성의 측정>
니트릴히드라타아제 활성은, 균체를 파쇄하여 고형물을 분리한 상청액에 의한 아크릴아미드 생성 반응 속도로부터 산출하였다. 기질인 아크릴로니트릴의 수용액을 상청액에 첨가함으로써 반응을 개시하고, 10℃에서 10분간 진탕한 후, 균체의 여과 분리와 인산 첨가에 의해 반응을 정지시켜, 가스 크로마토그래피(GC-14B, 시마즈 세이사꾸쇼)로 분석하였다. 분석 조건은, 포라팩(Porapack) PS(워터스사)를 충전한 1m 유리 칼럼을 사용하고, 칼럼 온도 210℃, 검출기는 230℃의 FID를 사용하였다.
본 발명에 있어서의 니트릴히드라타아제의 효소 활성은, 1분간에 균체 1mg이 생산되는 아크릴아미드의 양(μmol)으로서 측정하였다.
[시험예]
<실시예 1>
상술한 바와 같이 배양을 행하여 얻은 ATCC12674/pSJ042 및 ATCC12674/pSJ-N02A에 대하여 건조 균체 농도를 측정하였다. 이어서, 고압식 호모지나이저인 소형 균체 파쇄 장치 PANDA2K(니로 소아비(Niro Soavi)사 제조)로 배양을 행하여 얻은 균체 현탁액을 사용하여 균체를 파쇄하였다. 파쇄 압력은 100MPa, 파쇄시의 온도는 4℃였다.
파쇄액을 제조한 직후(0시간째)와, 암소에서 4 내지 37℃에서 정치함으로써 4 내지 24시간 보존한 파쇄액을 4℃, 15000rpm으로 5분간 원심 분리를 행하여 상청액을 얻었다. 이 상청액의 니트릴히드라타아제 활성을 측정한 결과, 0시간째의 활성을 100으로 했을 때의 상대값을 표 4에 나타낸다.
<비교예 1>
보존 온도를 50℃로 한 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 하여 효소 활성의 향상 효과를 판정하였다. 그 결과, 0시간째의 활성을 100으로 했을 때의 상대값을 표 4에 나타낸다.
Figure pct00004
미생물을 차광하에서 배양하고, 미생물 균체로부터의 효소를 차광하에서 효소에 따른 온도에서 효소에 따른 기간 보존하면, 효소 활성이 향상되는 것을 알 수 있다. 상기 실시예 및 비교예에서 사용한 미생물 유래의 효소를 사용한 경우, 보존 온도가 50℃에서는 효소가 실활되어, 효소 활성화 효과가 얻어지지 않았다.
<실시예 2>
배양한 균체가 로도코커스 로도크로스 J1이며, 500ml의 삼각 플라스크 대신에 3L 자 발효기(타카스기 세이사꾸쇼 제조)를 사용하여 배양한 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 하여 효소 활성의 향상 효과를 판정하였다. 또한, 배양 후의 건조 균체 농도는 39.8g/L였다. 그 결과, 0시간째의 활성을 100으로 했을 때의 상대값을 표 5에 나타낸다.
<비교예 2>
보존 온도를 50℃로 한 것 이외에는 실시예 2와 마찬가지로 하여 효소 활성의 향상 효과를 판정하였다. 그 결과, 0시간째의 활성을 100으로 했을 때의 상대값을 표 5에 나타낸다.
<비교예 3>
보존 시간을 48시간으로 한 것 이외에는 실시예 2와 마찬가지로 하여 효소 활성의 향상 효과를 판정하였다. 그 결과, 0시간째의 활성을 100으로 했을 때의 상대값을 표 5에 나타낸다.
<비교예 4>
파쇄 장치로서 초음파 발생기(TAITEC 제조, VP-300)를 사용한 것 이외에는 실시예 2와 마찬가지로 하여 효소 활성의 향상 효과를 판정하였다. 초음파 파쇄 조작에 있어서는, 15ml 코니칼 튜브(코닝(CORNING) 제조)에 배양한 균체 현탁액을 1ml 채취하고, 빙냉하면서 강도 20％에서 5분간 적용하였다. 그 결과, 0시간째의 활성을 100으로 했을 때의 상대값을 표 5에 나타낸다.
<비교예 5>
차광 조작을 행하지 않은 것 이외에는 실시예 2와 마찬가지로 하여 효소 활성의 향상 효과를 판정하였다. 그 결과, 0시간째의 활성을 100으로 했을 때의 상대값을 표 5에 나타낸다.
Figure pct00005
미생물을 차광하에서 배양하고, 미생물 균체로부터의 효소를 차광하에서 효소에 따른 온도에서 효소에 따른 기간 정치하면, 효소 활성이 향상되는 것을 알 수 있다. 상기 실시예 및 비교예에서 사용한 미생물 유래의 효소를 사용한 경우, 보존 온도가 50℃에서는 효소 활성화 효과가 얻어지지 않았다. 또한, 보존 온도 30 내지 37℃, 보존 기간 48시간에서는 효소 활성화 효과가 얻어지지 않았다. 또한, 고압식 호모지나이저를 사용함으로써 효소 활성화 효과가 얻어진다.
<실시예 3>
배양한 균체가 로도코커스 로도크로스 NCIMB41164이며, 균체의 파쇄에 고압식 호모지나이저인 수동식 프렌치 프레스(오타케 세이사꾸쇼 5502형)를 사용한 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 하여 효소 활성의 향상 효과를 판정하였다. 또한, 배양 후의 건조 균체 농도는 5.4g/L였다. 그 결과, 0시간째의 활성을 100으로 했을 때의 상대값을 표 6에 나타낸다.
<비교예 6>
보존 온도를 50℃로 한 것 이외에는 실시예 3과 마찬가지로 하여 효소 활성의 향상 효과를 판정하였다. 그 결과, 0시간째의 활성을 100으로 했을 때의 상대값을 표 6에 나타낸다.
<비교예 7>
보존 시간을 48시간으로 한 것 이외에는 실시예 3과 마찬가지로 하여 효소 활성의 향상 효과를 판정하였다. 그 결과, 0시간째의 활성을 100으로 했을 때의 상대값을 표 6에 나타낸다.
<비교예 8>
파쇄 장치로서 초음파 발생기(TAITEC 제조, VP-300)를 사용한 것 이외에는 실시예 3과 마찬가지로 하여 효소 활성의 향상 효과를 판정하였다. 초음파 파쇄 조작에 있어서는, 15ml 코니칼 튜브(코닝 제조)에 배양한 균체 현탁액을 1ml 채취하고, 빙냉하면서 강도 20％에서 5분간 적용하였다. 그 결과, 0시간째의 활성을 100으로 했을 때의 상대값을 표 6에 나타낸다.
<비교예 9>
차광 조작을 행하지 않은 것 이외에는 실시예 3과 마찬가지로 하여 효소 활성의 향상 효과를 판정하였다. 그 결과, 0시간째의 활성을 100으로 했을 때의 상대값을 표 6에 나타낸다.
Figure pct00006
미생물을 차광하에서 배양하고, 미생물 균체로부터의 효소를 차광하에서 효소에 따른 온도에서 효소에 따른 기간 정치하면, 효소 활성이 향상되는 것을 알 수 있다. 상기 실시예 및 비교예에서 사용한 미생물 유래의 효소를 사용한 경우, 초음파식 호모지나이저에 의한 균체 파괴에서는 효소 활성화 효과가 얻어지지 않았다. 또한, 보존시의 차광 없이는 효소 활성화 효과가 얻어지지 않았다.

Claims (6)

  1. 이하의 공정을 포함하는 니트릴히드라타아제의 보존 방법.
    (1) 니트릴히드라타아제 활성을 갖는 미생물을 차광하에서 배양하는 공정
    (2) 배양한 미생물 균체를 고압식 호모지나이저를 사용하여 파쇄하는 공정
    (3) 얻어진 균체 파쇄물을 차광하에서 4 내지 24시간, 4 내지 37℃에서 보존하는 공정
  2. 제1항에 있어서, 니트릴히드라타아제 활성을 갖는 미생물이 로도코커스(Rhodococcus)속 또는 슈도노카르디아(Pseudonocardia)속에 속하는 미생물인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 이하의 공정을 포함하는 니트릴히드라타아제의 활성화 방법.
    (1) 니트릴히드라타아제 활성을 갖는 미생물을 차광하에서 배양하는 공정
    (2) 배양한 미생물 균체를 고압식 호모지나이저를 사용하여 파쇄하는 공정
    (3) 얻어진 균체 파쇄물을 차광하에서 4 내지 24시간, 4 내지 37℃에서 보존하는 공정
  4. 제3항에 있어서, 니트릴히드라타아제 활성을 갖는 미생물이 로도코커스속 또는 슈도노카르디아속에 속하는 미생물인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 이하의 공정을 포함하는 활성화 니트릴히드라타아제의 제조 방법.
    (1) 니트릴히드라타아제 활성을 갖는 미생물을 차광하에서 배양하는 공정
    (2) 배양한 미생물 균체를 고압식 호모지나이저를 사용하여 파쇄하는 공정
    (3) 얻어진 균체 파쇄물을 차광하에서 4 내지 24시간, 4 내지 37℃에서 보존하는 공정
  6. 제5항에 있어서, 니트릴히드라타아제 활성을 갖는 미생물이 로도코커스속 또는 슈도노카르디아속에 속하는 미생물인 것을 특징으로 하는 방법.
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