WO2013129179A1 - 酵素の保存方法 - Google Patents

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nitrile hydratase
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microorganism
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絵美 石井
全人 織田
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三菱レイヨン株式会社
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01084—Nitrile hydratase (4.2.1.84)

Definitions

  • the present invention relates to a method for preserving a microorganism enzyme having nitrile hydratase activity, a method for activating it, and a method for producing activated nitrile hydratase.
  • Enzymes produced by microorganisms are used in many situations as catalysts for chemical conversion reactions.
  • nitrile hydratase, nitrilase, etc. which have nitrile group hydration or hydrolytic ability, it becomes possible to produce amides, carboxylic acids, ⁇ -hydroxycarboxylic acids and the like important in the chemical industry at low cost.
  • enzymes with optical specific hydration ability or optical specific hydrolytic ability it is possible to produce optically active carboxylic acids, amino acids, ⁇ -hydroxycarboxylic acids, etc. that are important as raw materials for pharmaceuticals and agricultural chemicals. become.
  • Patent Document 1 a method of storing in an aqueous solution containing a high concentration of inorganic salts
  • Patent Document 2 a method of storing by freezing
  • Patent Document 3 a method of performing (Patent Document 3) and the like are known.
  • Patent Document 4 for crushing bacterial cells, separating solids, and purifying bacterial enzymes.
  • the known storage method as described above has a complicated process and is not economical. Furthermore, since the activity of the enzyme is reduced, it is still not a satisfactory method. For example, the method of using an aqueous solution containing a high concentration of inorganic salts described in Patent Document 1 needs to be washed in a later process, which may only affect the quality of the product. And the manufacturing process becomes complicated. Moreover, in the method of preserving by freezing described in Patent Document 2, the freezing and thawing operations are complicated, and the enzyme activity is lost or lowered with the operations. The method described in Patent Document 3 for storing by aeration and stirring under pH control requires acid / alkaline chemicals and equipment and power for aeration and agitation.
  • Patent Document 4 describes a method of disrupting bacterial cells and centrifuging after acid / heat treatment, but there is room for improvement because the enzyme activity decreases with the progress of the process.
  • An object of the present invention is to provide a method for preserving an enzyme of a microbial cell obtained by culturing at a lower cost and more easily than a conventional method.
  • the present inventors have intensively studied to solve the above problems.
  • microbial cells with nitrile hydratase activity can be stored cheaply and easily by crushing the cells after culturing under light shielding using a high-pressure homogenizer and blocking the light to store them.
  • the enzyme activity was improved during storage. That is, the inventors have found that a method for preserving an enzyme of a microbial cell meeting the above-mentioned problems has been achieved, and the present invention has been completed. That is, the present invention relates to a method for storing an enzyme of a microbial cell obtained by culturing at a lower cost and more easily than conventional methods, and improving the enzyme activity during storage.
  • the present invention relates to a method for storing an enzyme having nitrile hydratase activity, which comprises crushing a cell body of a microorganism having hydratase activity after light-shielded culture using a high-pressure homogenizer and storing it while blocking light.
  • a more preferable method of the method of the present invention includes the following modes, that is, storing a crushed bacterial solution by a predetermined method; and using a predetermined microorganism having nitrile hydratase activity.
  • Still other preferred embodiments include storing the crushed bacterial solution at 4 to 37 ° C .; storing the crushed bacterial solution for 4 to 24 hours; and using a microorganism belonging to the genus Rhodococcus or Pseudonocardia.
  • the gist of the present invention is a nitrile hydratase activity characterized by further crushing a cell body of a microorganism having a nitrile hydratase activity after light-shielded culture using a high-pressure homogenizer, blocking the light and storing it. And a method for producing an activated nitrile hydratase.
  • microbial cells cultured under light-shielding suspended in a dispersion medium are crushed using a high-pressure homogenizer, and stored while blocking light, without aeration or stirring, pH adjustment or Even without heat treatment, it is possible to maintain a state in which an enzyme activity such as nitrile hydratase is maintained without rot or deterioration of the enzyme, that is, preservation.
  • an enzyme activity such as nitrile hydratase is maintained without rot or deterioration of the enzyme, that is, preservation.
  • it is possible to improve enzyme activity during storage that is, the labor and cost required in the conventional storage method can be greatly reduced, and a method for storing a bacterial enzyme that can be industrially satisfied is provided.
  • the microorganism having nitrile hydratase activity has the property of producing the target enzyme catalyst and accumulating it in the cell or secreting it outside the cell.
  • These microorganisms include microorganisms isolated from nature and genetically modified microorganisms. Representative examples of such microorganisms include, for example, the genus Rhodococcus having the nitrile hydratase activity, the genus Gordona, the genus Pseudomonas, the genus Pseudonocardia, and the genus Geobacillus. The microorganism to which it belongs is mentioned.
  • Rhodococcus which introduce
  • industrially preferred are Rhodococcus, Pseudocardia, and recombinant Escherichia coli and recombinant Rhodococcus bacteria into which the nitrile hydratase gene of these microorganisms has been introduced.
  • specific examples of microorganisms belonging to the genus Rhodococcus include Rhodococcus rhodochrous J-1 described in JP-B-6-55148 and Rhodococcus described in International Publication Pamphlet WO2005 / 054456.
  • Rhodococcus rhodochrous J-1 strain under the accession number “FERM BP-1478”, was established on September 18, 1987 by the National Institute of Technology and Evaluation, Patent Biological Depositary Center (1-1, Higashi 1-1, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture 305-8586) -1 central 6th (hereinafter the same in this specification).
  • the NCIMB 41164 stock was deposited on March 5, 2003 at the National Collection of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB) (NCIMB Ltd Ferguson Building Craibstone Estate Bucksburn Aberdeen AB21 9YA) under the accession number NCIMB41164.
  • 1 type selected from the said microorganisms can be used individually or in combination of 2 or more types.
  • the microorganism having nitrile hydratase activity may be cultured under normal conditions suitable for culturing microorganisms, except that the microorganism is cultured in the dark.
  • Nitrile hydratase refers to an enzyme capable of hydrolyzing a nitrile compound to produce a corresponding amide compound.
  • nucleic acids encoding nitrile hydratase and sequences thereof include those described in Patent Document 2. Such nucleic acids can be introduced and expressed in microbial cells by conventional molecular biology techniques (see Sambrook, Fritsch and Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory for these molecular methods). Manual "2nd Edition (1989), Cold Harbor Laboratory Press).
  • an enzyme obtained from a microorganism having natural nitrile hydratase activity can be used, and an enzyme obtained by expressing a nucleic acid encoding nitrile hydratase in a microorganism cell can also be used.
  • 1 type selected from the said enzyme can be used individually or in combination of 2 or more types.
  • “preservation” means storing crushed bacterial cells in a tank or container. At this time, stirring or aeration may be performed so that the concentration in the tank or the container is not biased. However, in the present invention, the agitation may be performed without agitation or aeration. In the present invention, “standing still” means storing the crushed cells in a tank or container without stirring or aeration. In the present invention, as a method for blocking light, the microbial cell crushed material may be stored in a sealed container in a light-shielding tank or dark room.
  • the storage temperature varies depending on the microorganism producing the enzyme, the type of enzyme, and the like, but it is possible to set an appropriate storage temperature using the enzyme activation as an index.
  • storage is usually possible at room temperature, but from the viewpoint of enzyme activation, it is preferably performed at 4 to 37 ° C., more preferably 4 to 25 ° C., and further preferably 4 to 15 ° C. If the storage temperature is lower than 4 ° C., not only the cell suspension may be solidified but also the cost for cooling may be increased. Moreover, when it exceeds 37 degreeC, there exists a possibility that nitrile hydratase activity may fall depending on a microbial cell enzyme.
  • the storage period varies depending on the microorganism producing the enzyme, the type of enzyme, the storage temperature, and the like, but it is possible to set an appropriate storage period using the enzyme activation as an index.
  • the storage period is usually 4 to 24 hours, but 6 to 24 hours is more preferable. If the storage period is shorter than 4 hours, the nitrile hydratase activity may not be sufficiently improved. On the other hand, if it is longer than 24 hours, depending on the temperature and bacterial enzyme, the bacterial cell suspension may rot and the nitrile hydratase activity may decrease.
  • the enzyme activity is activated as compared with the case where the light is not shielded.
  • the nitrile hydratase activity after storage exceeds 100% with respect to the nitrile hydratase activity before storage. Preferably, it is maintained at 103% or more, more preferably 110% or more, and further preferably 120%.
  • Nitrile hydratase activity can be measured by any method known in the art. For example, the nitrile hydratase activity should be measured by comparing the reaction rate of acrylamide formation with respect to the substrate (for example, acrylonitrile) before and after storage. Is possible.
  • the “dispersion medium” means a solution used for suspending microbial cells to be crushed.
  • the type of the dispersion medium is arbitrary, and the liquid medium used at the time of culturing cells or the liquid medium used at the time of culturing may be replaced with an organic acid aqueous solution.
  • the component of the organic acid aqueous solution is not particularly limited as long as it does not inhibit the enzyme activity.
  • carboxylic acids such as acrylic acid, formic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid, and oxalic acid.
  • acrylic acid is preferable in terms of maintaining the quality of acrylamide.
  • the preparation of the microbial cell disruption solution of the present invention is preferably carried out on the microbial cells obtained by culturing before the chemical treatment (for example, glutaraldehyde treatment disclosed in JP-A-7-265091).
  • a high-pressure homogenizer that crushes the cells while suspended in a dispersion medium can be used.
  • the high-pressure type homogenizer includes a French press, a continuous pressure type, and the like, but a continuous pressure type capable of stably obtaining a microbial cell disruption solution in a large amount industrially is preferable.
  • As a crushing method it is preferable to crush with a high-pressure homogenizer in a state suspended in a dispersion medium.
  • the temperature at the time of crushing is preferably 0 ° C. to 37 ° C., more preferably 0 ° C. to 25 ° C. in order to avoid thermal denaturation.
  • the pressure at the time of crushing is not particularly limited as long as it is a pressure capable of crushing bacterial cells, but it is preferably adjusted to 50 to 150 MPa, preferably 70 to 120 MPa.
  • concentration of bacteria when crushing may be in the range of 0.1 to 30% by mass in terms of dry cells.
  • the solid matter may be separated and used.
  • separating a solid substance is not limited, For example, centrifugation etc. are mentioned.
  • the temperature during the separation operation is preferably from 0 to 37 ° C, more preferably from 0 to 25 ° C.
  • Example demonstrates the implementation method of this invention further in detail, these Examples aim at the illustration of this invention, and do not limit this invention.
  • the enzyme activity was evaluated by storing the cultured cells in a predetermined method, and then centrifuging the supernatant after contacting the nitrile with the predetermined method described below. This was done by measuring the total reaction rate.
  • % display is mass%.
  • Rhodococcus bacterium transformant having nitrile hydratase gene As a transformant into which a nitrile hydratase gene derived from Rhodococcus rhodochrous J1 was introduced, Rhodococcus rhodochrous ATCC12674 / pSJ042 produced by the method described in JP-A-2008-154552 was used. For the transformant into which the nitrile hydratase gene derived from Pseudonocardia thermophila JCM3095 was introduced, the plasmid pSJ-N02A described in JP2011-200132A was introduced into the ATCC12674 strain in the same manner as described above. Rhodococcus rhodochrous ATCC12674 / pSJ-N02A was used.
  • Dry cell concentration dry cell mass [%]
  • the cell suspension is 120 ° C. From the mass ratio before and after drying for 3 hours using a dryer (percentage: percentage of dried residue of the bacterial solution [%]), the cell suspension is a liquid that does not substantially contain the microorganism cell layer This was determined by subtracting the mass ratio (percentage: supernatant salt concentration [%]) before and after drying when the liquid layer was similarly dried.
  • nitrile hydratase activity was calculated from the reaction rate of acrylamide formation with the supernatant obtained by crushing the cells and separating the solid.
  • the reaction was started by adding an aqueous solution of acrylonitrile as a substrate to the supernatant. After shaking at 10 ° C. for 10 minutes, the reaction was stopped by filtration separation of the bacterial cells and addition of phosphoric acid, and gas chromatography (GC-14B, Shimadzu Corporation).
  • GC-14B gas chromatography
  • a 1 m glass column packed with Porapak PS (Waters) was used, and a FID having a column temperature of 210 ° C. and a detector of 230 ° C. was used.
  • the enzyme activity of nitrile hydratase in the present invention was measured as the amount ( ⁇ mol) of acrylamide produced by 1 mg of cells per minute.
  • Example 1 The dry cell concentration of ATCC12674 / pSJ042 and ATCC12674 / pSJ-N02A obtained by culturing as described above was measured. Next, the microbial cells were crushed using the microbial cell suspension obtained by culturing in a small microbial cell pulverizer PANDA2K (manufactured by Niro Soavi), which is a high-pressure homogenizer. The crushing pressure was 100 MPa, and the temperature during crushing was 4 ° C. Immediately after preparing the crushing liquid (0 hour), and centrifuge the crushing liquid stored at 4 to 37 ° C in a dark place for 4 to 24 hours at 4 ° C and 15000 rpm for 5 minutes. To obtain a supernatant. As a result of measuring the nitrile hydratase activity of this supernatant, Table 4 shows the relative values when the activity at 0 hour is defined as 100.
  • Example 2 The cultured cells were Rhodococcus rhodochrous J1, and the enzyme activity improving effect was determined in the same manner as in Example 1 except that 3L jar fermenter (manufactured by Takasugi Seisakusho) was used instead of the 500 ml Erlenmeyer flask. In addition, the dry cell density
  • ⁇ Comparative example 2> The effect of improving enzyme activity was determined in the same manner as in Example 2 except that the storage temperature was 50 ° C. As a result, the relative values when the activity at 0 hour is defined as 100 are shown in Table 5.
  • ⁇ Comparative Example 3> The effect of improving enzyme activity was determined in the same manner as in Example 2 except that the storage time was 48 hours. As a result, the relative values when the activity at 0 hour is defined as 100 are shown in Table 5.
  • ⁇ Comparative Example 4> The effect of improving enzyme activity was determined in the same manner as in Example 2 except that an ultrasonic generator (manufactured by TAITEC, VP-300) was used as the crushing device.
  • the enzyme activity is improved.
  • the microorganism-derived enzyme used in the above Examples and Comparative Examples was used, the enzyme activation effect was not obtained at a storage temperature of 50 ° C. In addition, the enzyme activation effect was not obtained at a storage temperature of 30 to 37 ° C. and a storage period of 48 hours.
  • an enzyme activation effect can be obtained by using a high-pressure homogenizer.
  • Example 3 The cultured cells were Rhodococcus rhodochrous NCIMB41164, and the effect of improving the enzyme activity was determined in the same manner as in Example 1 except that a manual French press (Otake Seisakusho Model 5502), which is a high-pressure homogenizer, was used to disrupt the cells. did. In addition, the dry cell density
  • ⁇ Comparative Example 6> The effect of improving enzyme activity was determined in the same manner as in Example 3 except that the storage temperature was 50 ° C. As a result, the relative values when the activity at 0 hour is defined as 100 are shown in Table-6.
  • ⁇ Comparative Example 7> The effect of improving enzyme activity was determined in the same manner as in Example 3 except that the storage time was 48 hours. As a result, the relative values when the activity at 0 hour is defined as 100 are shown in Table-6.
  • ⁇ Comparative Example 8> The effect of improving enzyme activity was determined in the same manner as in Example 3 except that an ultrasonic generator (manufactured by TAITEC, VP-300) was used as the crushing device.
  • the enzyme activity is improved.
  • the enzyme activation effect could not be obtained by disrupting the cells with an ultrasonic homogenizer. Further, the enzyme activation effect could not be obtained without shading during storage.

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Abstract

　培養して得られた微生物菌体の酵素を、安価・簡便に保存し、且つ保存中に酵素活性を向上させる方法を提供することを課題とする。ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物の遮光下培養後の菌体を高圧式ホモジナイザーで破砕し、光を遮断して保存することを特徴とするニトリルヒドラターゼの保存方法。

Description

酵素の保存方法
　本発明は、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物の酵素を保存する方法、活性化する方法、及び活性化ニトリルヒドラターゼの製造方法に関する。
　微生物の産生する酵素は、化学変換反応の触媒として多くの場面で使用されている。とりわけ、ニトリル基の水和又は加水分解能を有するニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ等を利用することにより、化学工業上重要なアミド、カルボン酸、α-ヒドロキシカルボン酸等を安価に製造することが可能になる。更に、光学特異的水和能又は光学特異的加水分解能を持つ上記酵素を利用することにより、医薬、農薬の製造原料として重要な光学活性カルボン酸、アミノ酸、α-ヒドロキシカルボン酸等の製造も可能になる。
　微生物由来の酵素を触媒とする化学変換反応においては、培養及び集菌した微生物を使用時まで安定に保存しておく必要がある。すなわち、雑菌が混入して、腐敗し、あるいは溶菌することで、酵素の触媒能が失われたり、低下したりしないように保存しておかなければならない。そこで、一般的には、安定剤、代謝阻害剤、高濃度塩類の存在下で保存することにより微生物菌体保存時の微生物酵素の失活や腐敗、溶菌を抑制し、化学変換反応に使用している。上記安定剤等を添加しない場合には、凍結や冷蔵、或いは通気撹拌により酵素の活性を維持しながら保存することが知られている。
　ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物の場合、例えば、高濃度の無機塩類を含む水溶液中で保存する方法（特許文献１）、凍結により保存する方法（特許文献２）、pH制御の下で通気攪拌を行う方法（特許文献３）等が知られている。
　一方、菌体触媒ユーザーの利便性を向上させることを目的として、菌体を破砕して固形物を分離し、菌体酵素を精製する方法（特許文献４）が知られている。
特許第３１６３２２４号 特開２００３-２１９８７０号公報 特開２００３-１４４１４４号公報 国際公開第２０１１／００７７２５号パンフレット
　ところが、上記の様な公知の保存方法は、工程が複雑であり、経済性に優れない。さらに、酵素の活性が低下するといったことから、未だ満足すべき方法とはいえない。例えば、特許文献１に記載されている、高濃度の無機塩類を含む水溶液を使用する方法は、後の工程で洗浄等を行う必要があるため、製品の品質に影響を与える恐れがあるだけでなく、製造工程が複雑になる。また、特許文献２に記載されている、凍結により保存する方法では、凍結、融解操作が煩雑であり、またその操作に伴い酵素活性が失われたり、低下する問題があった。特許文献３に記載されている、pH制御下で通気攪拌して保存する方法は、酸・アルカリ薬品や通気攪拌を行う設備・動力が必要となる。特許文献４には、菌体を破砕し、酸・加熱処理後に遠心分離を行う方法が記載されているが、工程を経るに連れて酵素活性が低下することから改善の余地があった。
　本発明は、培養して得られた微生物菌体の酵素を、従来法と比較して安価・簡便に保存する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物の遮光下培養後の菌体を、高圧式ホモジナイザーを用いて破砕し、光を遮断して保存することにより、微生物菌体の酵素が安価・簡便に保存され、且つ保存中に酵素活性が向上することを知見した。すなわち、上記課題に合致した微生物菌体の酵素の保存方法が達成されることを知見し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、培養して得られた微生物菌体の酵素を、従来法と比較して安価・簡便に保存し、且つ保存中に酵素活性を向上させる方法に係わり、その要旨は、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物の遮光下培養後の菌体を、高圧式ホモジナイザーを用いて破砕し、光を遮断して保存することを特徴とするニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素の保存方法に存する。
　本発明方法のより好ましい方法として以下の態様、即ち、破砕した菌液を所定の方法で保存すること；ニトリルヒドラターゼ活性を有する所定の微生物を用いることが挙げられる。
　更に他の好ましい態様として、破砕した菌液を４～３７℃で保存すること；破砕した菌液を４～２４時間保存すること；Rhodococcus属又はPseudonocardia属に属する微生物を用いることが挙げられる。
　本発明の要旨は、更に、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物の遮光下培養後の菌体を、高圧式ホモジナイザーを用いて破砕し、光を遮断して保存することを特徴とするニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素の活性化方法；及び活性化ニトリルヒドラターゼの製造方法に存する。
　本発明によれば、分散媒に懸濁させた遮光下培養した微生物菌体を高圧式ホモジナイザーを用いて破砕し、光を遮断して保存することにより、通気や撹拌を行わず、pH調整や加熱処理なしでも腐敗や酵素の劣化なしにニトリルヒドラターゼ等の酵素活性を維持した状態を保つこと、すなわち、保存することが可能となる。また、本発明によれば、保存中に酵素活性を向上することが可能である。すなわち、従来の保存方法で必要とされてきた労力やコストを大幅に削減することができ、工業的に満足し得る菌体酵素の保存方法が提供される。
　以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
　本発明においてニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物は、目的とする酵素触媒を生産し菌体内に蓄積又は菌体外に分泌する性質を有するものである。この微生物には自然界より単離された微生物及び遺伝子組換え微生物が含まれる。このような微生物の代表例としては、例えば、ニトリルヒドラターゼ活性を持つロドコッカス（Rhodococcus）属、ゴルドナ（Gordona）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、シュードノカルディア（Pseudonocardia）属、ジオバチルス（Geobacillus）属に属する微生物が挙げられる。更に、これらの微生物のニトリルヒドラターゼ遺伝子を導入した組換え微生物が挙げられる。中でも工業的には、ロドコッカス属、シュードノカルディア属及びこれらの微生物のニトリルヒドラターゼ遺伝子を導入した組換え大腸菌及び組換えロドコッカス属細菌が好ましい。例えば、ロドコッカス属の微生物の具体例としては、特公平６-５５１４８号公報に記載されるロドコッカス・ロドクロウスＪ-１株（Rhodococcus rhodochrous J-1）および国際公開パンフレットＷＯ２００５／０５４４５６号に記載されるロドコッカス・ロドクロウスNCIMB41164株が挙げられる。ロドコッカス・ロドクロウスＪ-１株は、受託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ－１４７８」として、１９８７年９月１８日に独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター（〒３０５－８５６６　茨城県つくば市東１－１－１中央第６（以下、本明細書において同様））に寄託されている。また、NCIMB41164株は、２００３年３月５日にNational Collection of Industrial and Marine Bacteria(NCIMB)（NCIMB Ltd Ferguson Building Craibstone Estate Bucksburn Aberdeen AB21 9YA）に受託番号NCIMB41164として寄託されている。シュードノカルディア属の具体例としては、特開平０９-２７５９７８号公報に記載されるシュードノカルディア・サーモフィラ（Pseudonocardia thermophila JCM3095）が挙げられる。当該株は、「ＦＥＲＭ ＢＰ－５７８５」として同特許生物寄託センターに寄託されている。
  本発明においては、上記微生物から選択される１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
　ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物の培養は、遮光下で培養をすること以外は、微生物の培養に適した通常の条件で、培養すればよい。
　ニトリルヒドラターゼとは、ニトリル化合物を加水分解して、対応するアミド化合物を生成する能力を持つ酵素をいうものである。ニトリルヒドラターゼをコードする核酸及びその配列の例としては、前記特許文献２に記載されるものが挙げられる。このような核酸は、通常の分子生物学的手法によって微生物細胞内に導入及び発現可能である（これらの分子学的手法については、以下を参照：Sambrook,Fritsch and Maniatis,"Molecular Cloning:A Laboratory Manual"2nd Edition(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press）。すなわち、本発明においては、天然のニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物から得られる酵素を用いることもでき、ニトリルヒドラターゼをコードする核酸を微生物細胞内で発現させて得られる酵素を用いることもできる。本発明においては、上記酵素から選択される１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
　本発明において「保存」とは、タンクや容器中に菌体破砕物を保管することを意味する。この際、タンクや容器内の濃度が偏らないように攪拌や通気をしてもよいが、本発明では、攪拌や通気を行わず静置してもかまわない。本発明において「静置」とは、撹拌や通気をせずタンクや容器中に菌体破砕物を保管することを意味する。本発明において、光を遮断する方法としては、遮光性のタンクや暗室にて密閉容器中に菌体破砕物を保存すればよい。
　本発明において、保存温度は、酵素を生産する微生物、酵素の種類等によって変化するが、酵素活性化を指標に、適切な保存温度を設定することが可能である。
　本発明において、保存は通常室温で可能であるが、酵素活性化の観点から好ましくは４～３７℃、より好ましくは４～２５℃、さらに好ましくは４～１５℃で行われる。保存温度が４℃よりも低いと菌体懸濁液が凝固する可能性があるだけでなく、冷却のための費用が高くなる恐れがある。また、３７℃よりも高くなると菌体酵素によってはニトリルヒドラターゼ活性が低下する恐れがある。
　本発明において、保存期間は、酵素を生産する微生物、酵素の種類、保存温度等によって変化するが、酵素活性化を指標に、適切な保存期間を設定することが可能である。保存期間は、通常４～２４時間であればよいが、６～２４時間がより好ましい。保存期間が４時間よりも短いと、ニトリルヒドラターゼ活性が十分に向上しない恐れがある。また、２４時間よりも長いと、温度や菌体酵素によっては菌体懸濁液が腐敗しニトリルヒドラターゼ活性が低下する恐れがある。
　本発明の方法によって菌体酵素を保存した場合、遮光をしない場合に比べ、酵素活性が活性化される。通常、前記のニトリルヒドラターゼ活性は保存前のニトリルヒドラターゼ活性に対し、保存後のニトリルヒドラターゼ活性が１００％を超える。好ましくは１０３％以上、より好ましくは１１０％以上、さらに好ましくは１２０％維持される。
　ニトリルヒドラターゼ活性は、当該技術分野で公知のいずれかの方法により測定できるが、例えば、保存開始前と保存後の基質（例えば、アクリロニトリル）に対するアクリルアミド生成反応速度を比較すること等により測定することが可能である。
　本発明において「分散媒」とは、破砕対象となる微生物菌体の懸濁に使用する溶液を意味する。該分散媒の種類は任意であり、菌体培養時に使用した液体培地、あるいは培養時に使用した液体培地を有機酸水溶液に置換したものでもよい。
　有機酸水溶液の成分としては、酵素活性を阻害しないものであれば特に限定されない。例えば、アクリル酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、シュウ酸等のカルボン酸類が挙げられ、中でもアクリルアミドの品質を維持する点で、アクリル酸が好ましい。
　本発明の菌体破砕液の調製は、培養を行って得た菌体について、薬剤処理（例えば特開平７－２６５０９１に開示されたグルタルアルデヒド処理）を行う前に実施することが好ましい。破砕方法は、分散媒に懸濁させた状態で菌体破砕する、高圧式ホモジナイザーを使用することができる。高圧式ホモジナイザーには、フレンチプレス、連続圧力式などがあるが、工業的に大量に且つ安定的に菌体の破砕液を得ることができる、連続圧力式が好ましい。破砕方法は、分散媒で懸濁させた状態で高圧式ホモジナイザーで破砕することが好ましい。破砕時の温度は、熱変性を回避するため０℃～３７℃が好ましく、０℃～２５℃がさらに好ましい。破砕時の圧力は、菌体を破砕できる圧力であれば特に制限されないが、５０～１５０MPa、好ましくは７０～１２０MPaに調節するのが良い。破砕する際の菌濃度は特に制限はないが、乾燥菌体換算で０．１～３０質量％の範囲とすればよい。
　なお、本発明において、破砕した菌液を保存した後、固形物を分離して使用してもよい。固形物を分離する方法は限定されないが、例えば遠心分離等が挙げられる。分離操作の際の温度は、０～３７℃が好ましく、０～２５℃がさらに好ましい。
　以下、実施例により本発明の実施方法を更に詳細に説明するが、これらの実施例は、本発明の例示を目的とするものであり、本発明を限定するものではない。以下の試験例（実施例及び比較例）において、酵素活性の評価は、培養した菌体を所定法で保存後、遠心分離した上清を後記の所定の方法でニトリルと接触させたときの水和反応速度を測定することにより行った。
　以下の実施例及び比較例に於ける%表示は質量%である。
＜ニトリルヒドラターゼ遺伝子を有するロドコッカス（Rhodococcus）属細菌形質転換体の作成＞
　Rhodococcus rhodochrous J1由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子を導入した形質転換体として、特開２００８-１５４５５２号公報に記載の方法で作製されたRhodococcus rhodochrous ATCC12674／pSJ042を用いた。
　Pseudonocardia thermophila JCM3095由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子を導入した形質転換体には、特開２０１１-２００１３２号公報に記載のプラスミドpSJ-N02Aを、記載の方法と同様にしてＡＴＣＣ１２６７４株に導入した、形質転換体Rhodococcus rhodochrous ATCC12674/pSJ-N02Aを用いた。
＜菌体の培養＞
（１）ＡＴＣＣ１２６７４株形質転換体の培養
　５００ｍｌの三角フラスコに表－１の成分を水道水に溶解して調製した培地（ｐＨ７．２）１００ｍｌを入れ、１２１℃、２０分のオートクレーブにより滅菌した。この培地に、尿素0.1g/L、カナマイシン50mg/Lとなるよう添加し、ATCC12674／pSJ042またはATCC12674/pSJ-N02Aを接種し、遮光下で３０℃、２３０ｒｐｍで７２時間培養した。試験例で使用した培地成分を以下の表－１に示す。
（２）Rhodococcus rhodochrous J-1株の培養
　３Ｌジャーファーメンター（高杉製作所製）に表－２の成分を水道水に溶解して調製した培地（ｐＨ７．０）２．５Lを入れ、１２１℃、２０分のオートクレーブにより滅菌した。この培地に、（１）と同様の方法で培養したRhodococcus rhodochrous J-1を２０ｍL接種し、光を遮断して４２時間培養した。培養温度は３５℃であった。試験例で使用した培地成分を以下の表－２に示す。
（３）Rhodococcus rhodochrous NCIMB-41164株の培養
　５００ｍｌの三角フラスコに表－３の成分を水道水に溶解して調製した培地（ｐＨ７．２）１００ｍｌを入れ、１２１℃、２０分のオートクレーブにより滅菌した。これに、尿素5.0g/Lとなるよう添加し、Rhodococcus rhodochrous NCIMB-41164を接種し、遮光下で３０℃、２３０ｒｐｍで６５時間培養した。試験例で使用した培地成分を以下の表－３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
＜乾燥菌体濃度の測定＞
　「乾燥菌体濃度（乾燥菌体質量[％]）」とは、菌体懸濁液に含まれる菌体の乾燥質量の比率により表され、具体的には、菌体懸濁液を１２０℃の乾燥機で３時間乾燥させた時の乾燥前後の質量比（百分率：菌液乾燥残渣割合[％]）から、菌体懸濁液を微生物菌体層と実質的に菌体を含まない液層に分離した際の該液層を同様に乾燥させた時の乾燥前後の質量比（百分率：上清塩濃度[％]）を差引くことにより求めたものである。
＜ニトリルヒドラターゼ活性の測定＞
　ニトリルヒドラターゼ活性は、菌体を破砕して固形物を分離した上澄み液によるアクリルアミド生成反応速度から算出した。基質であるアクリロニトリルの水溶液を上澄み液に添加することで反応を開始し、１０℃で１０分間振盪した後、菌体の濾過分離とリン酸添加により反応を停止させ、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ－１４Ｂ、島津製作所）で分析した。分析条件は、Ｐｏｒａｐａｃｋ　ＰＳ（ウォーターズ社）を充填した１ｍガラスカラムを用い、カラム温度２１０℃、検出器は２３０℃のＦＩＤを使用した。
　本発明におけるニトリルヒドラターゼの酵素活性は、1分間に菌体１ｍｇが生産するアクリルアミドの量（μｍｏｌ）として測定した。
［試験例］
＜実施例１＞
　前述の通り培養を行って得たATCC12674／pSJ042、およびATCC12674／pSJ-N02Aについて、乾燥菌体濃度を測定した。次に、高圧式ホモジナイザーである小型菌体破砕装置ＰＡＮＤＡ２Ｋ（Ｎｉｒｏ　Ｓｏａｖｉ社製）にて、培養を行って得た菌体懸濁液を用いて、菌体を破砕した。破砕圧力は１００ＭＰａ、破砕時の温度は４℃であった。
　破砕液を調製した直後（０時間目）と、暗所にて４～３７℃で静置することで４～２４時間保存した破砕液を、４℃、１５０００ｒｐｍにて５分間、遠心分離を行って上澄み液を得た。この上澄み液のニトリルヒドラターゼ活性を測定した結果、０時間目の活性を１００としたときの相対値を表－４に示す。
＜比較例１＞
　保存温度を５０℃にした以外は実施例１と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。結果、０時間目の活性を１００としたときの相対値を表－４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　微生物を遮光下で培養し、微生物菌体からの酵素を遮光下で酵素に応じた温度で酵素に応じた期間保存すると、酵素活性が向上することが分かる。上記実施例及び比較例で用いた微生物由来の酵素を用いた場合、保存温度が５０℃では酵素が失活し、酵素活性化効果が得られなかった。
＜実施例２＞
　培養した菌体がRhodococcus rhodochrous J1であり、５００ｍｌの三角フラスコの代わりに３Ｌジャーファーメンター（高杉製作所製）を用いて培養した以外は実施例１と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。なお、培養後の乾燥菌体濃度は、３９．８ｇ／Lであった。結果、０時間目の活性を１００としたときの相対値を表－５に示す。
＜比較例２＞
　保存温度を５０℃にした以外は実施例２と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。結果、０時間目の活性を１００としたときの相対値を表－５に示す。
＜比較例３＞
　保存時間を４８時間にした以外は実施例２と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。結果、０時間目の活性を１００としたときの相対値を表－５に示す。
＜比較例４＞
　破砕装置として超音波発生機（ＴＡＩＴＥＣ製、ＶＰ－３００）を使用した以外は実施例２と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。超音波破砕操作においては、１５ｍｌコニカルチューブ（ＣＯＲＮＩＮＧ製）に培養した菌体懸濁液を１ｍｌ採取し、氷冷しながら強度２０％にて５分間適用した。結果、０時間目の活性を１００としたときの相対値を表－５に示す。
＜比較例５＞
　遮光操作を行わなかった以外は実施例２と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。結果、０時間目の活性を１００としたときの相対値を表－５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　微生物を遮光下で培養し、微生物菌体からの酵素を遮光下で酵素に応じた温度で酵素に応じた期間静置すると、酵素活性が向上することが分かる。上記実施例及び比較例で用いた微生物由来の酵素を用いた場合、保存温度が５０℃では酵素活性化効果が得られなかった。また、保存温度３０～３７℃、保存期間４８時間では酵素活性化効果が得られなかった。また、高圧式ホモジナイザーを用いることにより、酵素活性化効果が得られる。
＜実施例３＞
　培養した菌体がRhodococcus rhodochrous NCIMB41164であり、菌体の破砕に高圧式ホモジナイザーである手動式フレンチプレス（大岳製作所　５５０２型）を用いた以外は実施例１と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。なお、培養後の乾燥菌体濃度は、５.４ｇ／Lであった。結果、０時間目の活性を１００としたときの相対値を表－６に示す。
＜比較例６＞
　保存温度を５０℃にした以外は実施例３と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。結果、０時間目の活性を１００としたときの相対値を表－６に示す。
＜比較例７＞
　保存時間を４８時間にした以外は実施例３と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。結果、０時間目の活性を１００としたときの相対値を表－６に示す。
＜比較例８＞
　破砕装置として超音波発生機（ＴＡＩＴＥＣ製、ＶＰ－３００）を使用した以外は実施例３と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。超音波破砕操作においては、１５ｍｌコニカルチューブ（ＣＯＲＮＩＮＧ製）に培養した菌体懸濁液を１ｍｌ採取し、氷冷しながら強度２０％にて５分間適用した。結果、０時間目の活性を１００としたときの相対値を表－６に示す。
＜比較例９＞
　遮光操作を行わなかった以外は実施例３と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。結果、０時間目の活性を１００としたときの相対値を表－６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　微生物を遮光下で培養し、微生物菌体からの酵素を遮光下で酵素に応じた温度で酵素に応じた期間静置すると、酵素活性が向上することが分かる。上記実施例及び比較例で用いた微生物由来の酵素を用いた場合、超音波式ホモジナイザーによる菌体破壊では酵素活性化効果が得られなかった。また、保存時の遮光無しでは酵素活性化効果が得られなかった。

Claims (6)

  1. 　以下の工程を含むニトリルヒドラターゼの保存方法。
    （１）ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物を遮光下で培養する工程。
    （２）培養した微生物菌体を高圧式ホモジナイザーを用いて破砕する工程。
    （３）得られた菌体破砕物を遮光下で４～２４時間、４～３７℃で保存する工程。
  2. 　ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物が、Rhodococcus属又はPseudonocardia属に属する微生物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 　以下の工程を含むニトリルヒドラターゼの活性化方法。
    （１）ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物を遮光下で培養する工程。
    （２）培養した微生物菌体を高圧式ホモジナイザーを用いて破砕する工程。
    （３）得られた菌体破砕物を遮光下で４～２４時間、４～３７℃で保存する工程。
  4. 　ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物が、Rhodococcus属又はPseudonocardia属に属する微生物であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
  5. 　以下の工程を含む活性化ニトリルヒドラターゼの製造方法。
    （１）ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物を遮光下で培養する工程。
    （２）培養した微生物菌体を高圧式ホモジナイザーを用いて破砕する工程。
    （３）得られた菌体破砕物を遮光下で４～２４時間、４～３７℃で保存する工程。
  6. 　ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物が、Rhodococcus属又はPseudonocardia属に属する微生物であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
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