WO2006062189A1 - ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体 - Google Patents

ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体 Download PDF

Info

Publication number
WO2006062189A1
WO2006062189A1 PCT/JP2005/022647 JP2005022647W WO2006062189A1 WO 2006062189 A1 WO2006062189 A1 WO 2006062189A1 JP 2005022647 W JP2005022647 W JP 2005022647W WO 2006062189 A1 WO2006062189 A1 WO 2006062189A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nitrile hydratase
subunit
activity
seq
amino acid
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/022647
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kaoru Furuya
Akira Tamaki
Shin-Ichiro Nagasawa
Ayano Suzuki
Original Assignee
Asahi Kasei Kabushiki Kaisha
Tongsuh Petrochemical Corp. Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Asahi Kasei Kabushiki Kaisha, Tongsuh Petrochemical Corp. Ltd. filed Critical Asahi Kasei Kabushiki Kaisha
Priority to JP2006546771A priority Critical patent/JPWO2006062189A1/ja
Publication of WO2006062189A1 publication Critical patent/WO2006062189A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)

Definitions

  • the present invention relates to a microorganism belonging to the genus Rhodococcus transformed with a nitrile hydratase gene, and an amide from a nitrile compound using the enzyme catalytic action of nitrile hydratase retained by the microorganism.
  • the present invention relates to a method for producing a compound.
  • a microbial enzyme is used instead of the conventional chemical method using a copper catalyst.
  • the method used as a catalyst has become mainstream.
  • Such enzymes are commonly referred to as nitrile hydratases, but since the first report, many enzymes have been discovered by various microorganisms.
  • the genus Arthrobacter Agricultural and Biological Chemistry Vol.44 p.2251-2252, 1980
  • the genus Agrobacterium JP 05-103681
  • the genus Acinetobacter JP-A-61-282089
  • JP-A-5_030983 Enteropactor ⁇ 61 "0 & 61-) genus (JP-A-05-236975), Genrewiuer genus (Erwinia) (JP 05-161496), Xanthobacter genus (JP 05-161495), Klebsiella genus (JP 05_030982), Corynebacterium (.01711 ⁇ 2 & 61 11111) genus (special Kaisho 54_129190, later proved to be Rhodococcus genus), Pseudomonas genus (JP 58-86093), Citropacter genus (JP 05_030984) Streptomyces stamp 11 ⁇ 063 genus ( JP 05-236976), Bacillus genus (JP 51-86186, and JP 7-255494), Fusarium genus (JP 01-086889),
  • Klebsiella genus Japanese Patent Laid-Open No. 6-303971
  • Achromopacter genus Japanese Patent Laid-Open No. 08-266277
  • Syudunocanoredia genus Japanese Patent Laid-Open No. 9-275978
  • Rhodococcus is like Corynebataterium This problem can be solved by expressing it in microorganisms that maintain the activity of intracellular enzymes, even in high-concentration amide compounds and nitrile compounds, which have a tight cell wall, but developed genetic manipulation systems for individual microorganisms. It is difficult to do.
  • nitrile hydratase which maintains high activity even in the presence of high concentrations of nitrile compounds as substrates and amide compounds as products, is desirable for the same purpose.
  • the absolute values thereof may vary depending on the type of enzyme used in the reaction, the type of nitrile compound, and the type of nitrile compound, and no enzyme that combines all of them has been found.
  • nitrile hydratase enzyme power present in the host microorganism If it can be stably present among amide compounds and nitrile compounds at high concentrations, the microorganism can be used as an immobilization carrier for retaining the enzyme inside. Can be considered. In that case, the reaction in a high concentration substrate (nitrile compound) becomes possible, and the accumulated concentration of the final amide compound also increases. Furthermore, operations such as taking out the enzyme and binding to the immobilization carrier can be omitted, and the microorganism itself can be used as a catalyst for the reaction.
  • an object of the present invention is to isolate nitrile hydratase having high stability against heat and high concentration compounds from nature, provide an amino acid sequence and a gene sequence of the enzyme, a recombinant plasmid containing the gene,
  • An object of the present invention is to provide a transformant that achieves a rare expression level of an enzyme even in a host having a cost advantage during production using the recombinant plasmid.
  • another object of the present invention is to produce a method of producing the enzyme using the transformant by culturing and growing the transformant, and to use the transformant. It is to provide an inexpensive method for producing the corresponding amide compound from Tolui compound. Means for solving the problem
  • the present inventors have determined that as a microorganism having nitrile hydratase activity from soil in the vicinity of a hot spring in Saitama Prefecture, ) was found.
  • the temperature of 65 ° C normally used for culturing this microorganism is the conventional one. It exceeds the normal culture temperature (45 ° C to 60 ° C) of thermophilic bacteria with nitrile hydratase, and has stability to amide compounds and nitrile compounds as enzymes.
  • nitrile hydratase enzyme was purified from the microorganism, and it was shown that the nitrile hydratase activity has high stability against heat, high concentrations of nitrile compounds and amide compounds.
  • the nitrile hydratase gene was isolated from the chromosomal DNA of the microorganism based on the N-terminal amino acid sequence of each subunit of the purified enzyme, and the amino acid sequence and gene sequence were revealed for the first time. Homology with nitrile hydratase was found to be very low.
  • Rhodococcus rhodochrous M33 strain VKM Ac-1515D
  • Rhodococcus rhodochrous M33 strain VKM Ac-1515D
  • Substrate specificity Shows activity using acrylonitrile, adiponitrile, acetonitrile, isobutyronitrile, n- valeronitrile, n -butyronitrile, benzonitrile and hexanenitrile as substrates.
  • Molecular weight A protein composed of at least the following two types of subunits, and the molecular weight of each subunit as determined by reducing SDS-polyacrylamide electrophoresis is as follows.
  • Substrate specificity Shows activity using acrylonitrile, adiponitrile, acetonitrile, isobutyronitrile, n- valeronitrile, n -butyronitrile, benzonitrile, hexanenitrile as substrates.
  • Molecular weight A protein composed of at least the following two types of subunits, and the molecular weight of each subunit as determined by reducing SDS-polyacrylamide electrophoresis is as follows.
  • Rhodococcus rhodochrous strain M33 Rhodococcus rhodochrous M33
  • VKM Ac_1515D or KCCM-10635 Z or a variant thereof, any of (1) to (3) The microorganism according to crab.
  • a method for producing nitrile hydratase or a cell-treated product containing the same, comprising culturing the microorganism according to any one of (1) to (5) in a medium.
  • a method for producing an amide compound which comprises reacting the nitrile hydratase according to (8) or a treated microbial cell containing the same with a nitrile compound to synthesize an amide compound from the nitrile compound .
  • nitrile hydratase expressed in the present invention will be described.
  • having nitrile hydratase activity means conversion to an amide compound by adding a water molecule to a nitrile compound, such as acetamide for acetonitrile, n-propioamide for n-propionitrile, and acrylamide for acrylonitrile. It has the activity to do.
  • the produced compound can be identified by gas chromatography Z mass spectrometry (GCZMS), infrared absorption spectrum (IR), and nuclear magnetic resonance spectrum (NMR) after separation by liquid chromatography. .
  • nitrile hydratase activity when nitrile hydratase activity is measured, for example, 0.1 ml of a nitrile hydratase enzyme solution is added to 1 ml of a 0.1 wt% nitrile compound solution (0.05 M-phosphate buffer ⁇ 7 ⁇ 7). Add ⁇ and incubate for 10 to 60 minutes at a reaction temperature of 27 ° C to 60 ° C. Then stop the reaction by adding 0.1 ml of 1N hydrochloric acid, and remove a portion of the reaction mixture by liquid chromatography. It is possible to test for the presence or absence of amide compound formation.
  • nitrile compounds as the substrate in the present invention include, for example, Asetonitoriru, n- propyl Onitoriru, n- butyronitrile, isobutyronitrile, n - Valero nitrile, aliphatic hexane nitrile, etc., to n- two Tolyl compounds, nitrile compounds containing halogen atoms such as 2-chloroprophitryl, aliphatic nitrile compounds containing unsaturated bonds such as acrylonitrile, crotononitrile, methatalonitrile, ratatonitrile, mandelonitrile, etc.
  • Hydroxytritrily compounds aminonitrile compounds such as 2-phenyldaricinonitrile, aromatic nitrile compounds such as benzonitrile and cyanobilysine, dinitrile compounds such as malononitrile, succinonitrile and adiponitrile, and the like Examples include Trinitrili compound.
  • the substrate specificity of nitrile hydratase in the present invention is determined by measuring whether or not each substrate has nitrile hydratase activity under various measurement conditions as described above. be able to. If the substrate specificity is wide, the number of corresponding amide compounds that can be produced increases, which is preferable, but this enzyme is at least acrylonitrile, adiponitrile, acetonitrile, isobutyronitrile, n_valeronitryl, n-butyronitrile, benzonitrile. Hexane nitrile can be used as a substrate.
  • the nitrile hydratase in the present invention is more preferably represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • Preferred examples include the subunit shown by the 205 amino acid sequence shown and the 13 subunit shown by the 226 amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • metals and other peptides may be contained.
  • the metal often contains iron or cobalt.
  • a protein containing either one of these subunits is acceptable.
  • the amino acid sequence of each subunit is the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2 in the above sequence listing as long as it forms a complex with other subunits and has nitrile hydratase activity.
  • cysteine residues may be modified to cysteine sulfinic acid or cysteine sulfenic acid after translation.
  • a preferred example is an amino acid sequence IJ in which 1 to 30 amino acids of the amino acid sequence are substituted, deleted, inserted, or post-translationally modified. Substitution, deletion, insertion, or translation.
  • the number of amino acids that undergo post-modification is more preferably 1 to: 10, more preferably 1 to 5, and most preferably 1 to 3.
  • a nitrile hydratase enzyme having such an amino acid sequence having substitution, deletion, or insertion can be obtained by a known site-directed mutagenesis method such as Molecular Cloning 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Can be obtained by introducing DNA into which substitution, deletion, or insertion has been introduced at the corresponding position of the base sequence and expressing it in a host microorganism as described below. Attempts can be made to create mutant enzymes with industrially desirable properties such as improved thermal stability, resistance to organic solvents, and changes in substrate specificity. In view of the strong technical level, the case where they have nitrile hydratase activity is included in the present invention.
  • nitrile hydratase in the present invention two subunits having a molecular weight of 25000 ⁇ 2000 and a molecular weight of 28000 ⁇ 2000 are produced by Coomassie brilliant blue by reducing SDS (sodium dodecyl sulfate) -polyacrylamide electrophoresis. Examples of those detected by staining are the nitrile hydratase, which is called the subunit 3 and the latter / 3 subunit.
  • the nitrile hydratase is used in the absence of stabilizers such as organic acids prior to activity measurement. Even after 30 minutes of heat treatment at ° C, 35% of the activity before heating can be retained.
  • the nitrile hydratase in the present invention does not do so even when 6% by weight of acrylonitrile is used as the substrate. The phenomenon is not observed.
  • the nitrile hydratase having the physicochemical properties as described above can be obtained, for example, by culturing a microorganism belonging to the genus Diobacillus, and as a microorganism belonging to the genus Diobacillus, as a microorganism belonging to the genus Diobacillus, Gobacillus caldoxylosilyt icus, Geobacillus kaustophilus, Geobacillus lituanicus, Geobacillus stearothermophilus, Subtilus subtilus Geobacillus thermocatenulatus, Geobacillus thermodenitrificans, Geobacillus thermoglucosidasius, Geobacillus thermoglucosidasius, Geobacillus th ermoleovorans), ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , ⁇ ⁇ (Geobacillus toebii, Geobacillus uzenensis), and
  • nitrile hydratase genes from microbial strains, such as the genus Agrobacterium, Achromobacter, Acinetobacter, Aeromonas ( Aeromonas, Enterobacter, Erwinia, Xanthobacter, Klebsiella, Corynebacteria, Sorhizobium, Smorhizobium (Pseudomonas), Streptomyces, Nocardia, Bacill us, Micro Micrococcus genus, Rhodococcus genus, Rhodosidomonas Examples include the genus Rhodopseudomonas, the genus Rhizobium, and the genus Pseudono cardia.
  • screening was performed by the following method. First, a small amount of soil collected at various locations is placed in a test tube containing water or physiological saline, and cultured in a shaking incubator at 65 ° C for 2 to 14 days. The Take a portion of this culture and place it in a general-purpose microbial growth medium such as glycerol, polypeptone, or yeast extract. Incubate for about days. A part of the culture solution thus obtained is spread on an agar plate medium containing the above-mentioned microorganism growth medium components and further cultured at 65 ° C. to form colonies, whereby a microorganism can be isolated.
  • a general-purpose microbial growth medium such as glycerol, polypeptone, or yeast extract.
  • the microorganism thus obtained is used for a suitable period of time using a test tube or a flask containing a liquid medium obtained by adding a nitrile compound such as n-valeronitrile or an amide compound such as methacrylamide to the medium components.
  • a nitrile compound such as n-valeronitrile or an amide compound such as methacrylamide
  • the cells are grown by shaking at 65 ° C., and the target microorganism is selected based on the above nitrile hydratase activity measurement method.
  • a representative strain of such a microorganism was identified from 16S rRNA and the following biochemical properties, and it was found to be Geobacillus thermoglu cosidasius.
  • This strain is named “Geobacillus thermoglucosidasius Q_6” and is a patent biological deposit center of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. (Postal code 305-8566)) was deposited under the number FERM P-19351 (accepted ⁇ May 16, 2003) and transferred to the deposit under the Budapest Treaty as FERM BP-08658 (date of receipt 2004) March 11). Although various patents ' publications were investigated, there was no description about having a nitrile hydratase activity with respect to microorganisms belonging to Giobacillus' thermodalcosidesis. From this fact, Giobacillus' thermodalcosidesis Q-6 strain is recognized as a new strain. The properties of Gibacillus' Thermodalcosidesis Q-6 strain are as follows.
  • Attitude toward oxygen facultative anaerobic
  • the enzyme is purified from a microorganism, each subunit is separated by reduced SDS polyacrylamide electrophoresis, and each band is separated from a gel.
  • a part of the amino acid sequence can be determined by excision and protein sequencer.
  • DNA containing positions 695-1312 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing and DNA containing position 1 681 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 of the sequence listing, each of which is an ⁇ - subunit.
  • the ability to encode 3 subunits including, but not limited to, DNA containing this base sequence.
  • DNA that can hybridize under stringent conditions to DNA consisting of a base sequence complementary to these sequences is included in the present invention as long as it has nitrile hydratase activity. . That is, these nitriles can be used to express the nitrile hydratase of the present invention.
  • the f column is ECL direct nucleic acid labeling and detection systerru, manufactured by Macham Almasia Biotech Co., Ltd., and the conditions described in the manual (wash: 42 ° C, including 0.5xSSC primary) wash buffer).
  • DNA that can be hybridized under stringent conditions include, for example, DNA containing position 695-1312 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing or the sequence listing under the stringent conditions described above.
  • Arbitrary usually at least 20, preferably at least 50, particularly preferably at least 100 of the complementary base sequences in DNA comprising positions 1 to 681 of the base sequence of number 3
  • DNA encoding nitrile hydratase used in the present invention can be obtained by the following method.
  • gene recombination techniques, recombinant protein production techniques, and analysis methods known in the art are employed.
  • the DNA encoding the nitrile hydratase used in the present invention is a base sequence disclosed in the present specification, or an amino acid sequence lj, and in some cases, a sequence such as an amino acid sequence determined from the above-described purified enzyme. According to the information, it can be obtained from a microorganism containing the nitrile hydratase of the present invention, such as Thermo-Dalcosidesis Q-6 strain.
  • DNA encoding the nitrile hydratase of the present invention can also be obtained by plaque hybridization or colony hybridization.
  • primers were prepared according to the N-terminal amino acid sequence information of both subunits determined from the purified enzyme described above, and a part of the nitrile hydratase gene was amplified by PCR reaction.
  • a similar process can be performed as a probe.
  • the obtained DNA is inserted into a plasmid vector, for example, pUC118, cloned, and the base is prepared by a known method such as the dideoxy terminator method (Proceedings of the National Academy of Sciences. USA, 74: 5463-5467, 1977). Sequence determination can be performed.
  • the gene prepared in this manner was confirmed to be a DNA encoding nitrile hydratase by using the activity measurement method described above for an expression product in an E. coli host transformed with the gene. I can be patient.
  • a microorganism suitable for industrial production is transformed.
  • industrial microorganisms suitable for production microorganisms belonging to the genus Rhodococcus are preferred.
  • a recombinant vector characterized in that the above DNA is linked to the vector is used.
  • the recombinant vector used in the present invention includes a promoter region suitable for a host microorganism.
  • a promoter region suitable for a host microorganism capable to ligate downstream such that the 5 ′ end of the DNA obtained by the above method can function, insert a transcription termination sequence downstream of it, and incorporate it into an appropriate expression vector. S can.
  • An appropriate expression vector is not particularly limited as long as it can be replicated in a host microorganism.
  • the vector can be selected from vectors usually used in Rhodococcus, such as pK4, pRF30, pBS305, and pRE_7.
  • the promoter used in the expression vector is preferably a promoter such as a nitrilase gene or a nitrile hydratase gene that can be expected to have a high expression level, but is not limited thereto.
  • a host is capable of inserting a gene into a chromosome, it is not necessary to have a region capable of autonomous replication in the host.
  • the ⁇ subunit gene and the ⁇ subunit gene may be expressed as cistrons independent of the respective promoters, or may be expressed as polycistrons with a common promoter.
  • each subunit gene may be on a separate vector.
  • the host is transformed using two types of expression vectors, a first expression vector containing the ⁇ subunit gene and a second expression vector containing the ⁇ subunit gene.
  • the above recombinant vector may be allowed to coexist with a DNA that expresses an amino acid sequence (Patent No. 3408737 and Journal of Biochemistry 125: 696-704 (1999)) necessary for nitrile hydratase activation, if necessary. is there.
  • a plasmid vector containing a promoter and transcription termination factor necessary for expression is used, a gene encoding a protein involved in nitrile hydratase activation, nitrile hydratase
  • a subunit gene and ⁇ subunit gene may be expressed as independent cistrons, or may be expressed as a polycystin by a common control region. Similarly, each gene may be on a separate vector.
  • the desired nitrile hydratase By using the expression vector prepared by the above method and transforming a host microorganism, the desired nitrile hydratase can be expressed.
  • a method for introducing a gene into a host microorganism it can be introduced into a preferred host by any conventional method known in the art, such as transformation, transduction, conjugation transfer, or electoral position.
  • a transformed microorganism capable of producing the nitrile hydratase that is, a microorganism of the genus Rhodococcus, Particularly preferably, Rhodococcus rhodochrous M33 strain (VKM Ac_1515D or KCCM-10635) is grown by culturing to obtain nitrile hydratase or a treated microbial cell containing it from the culture. can do.
  • the transformant of the present invention is preferably cultured in a medium containing a nutrient source that can be assimilated by these microorganisms.
  • the transformant can be cultured by a usual method for producing enzymes, antibiotics, and the like. it can.
  • the culture may usually be liquid culture or solid culture.
  • carbohydrates such as gnolecose and sucrose; alcohols such as sorbitol and glycerol; organic acids such as citrate and acetic acid; carbon sources such as soybean oil or mixtures thereof; nitrogen-containing inorganic substances such as yeast extract, meat extract, ammonium sulfate, and ammonia Organic nitrogen sources; inorganic nutrient sources such as phosphates, magnesium, iron, konnoret, manganese, potassium, etc .; and a medium appropriately mixed with vitamins such as biotin and thiamine are used. More preferably, such medium components should contain Fe ions or Co ions in an amount of 0.1 ⁇ g / ml or more. In general, the culture conditions are preferably aerobic.
  • the culture temperature is not particularly limited as long as the host microorganism can grow, but it is usually 5 ° C to 80 ° C, preferably 20 to 70 ° C, more preferably about 37 ° C. Is done.
  • the pH during the culture is not particularly limited as long as the host microorganism can grow, but the pH is usually 3 to 9, preferably 5 to 8, and more preferably 6 to 7. .
  • a microorganism belonging to the genus Rhodococcus is used as a host microorganism.
  • the species of microorganisms belonging to the genus Rhodococcus to be used as the host microorganism is not particularly limited.
  • Rhodococcus rhod ochrous, Rhodococcus ruber, Rhodo examples include Ellis mouth police (Rhodococcus erythropolis) and Rotodococcus rubrop ertinctus.
  • Rhodococcus rhodochrous M33 strain (VKM Ac-1515 D or VKPM S-1268). Rhodococh as a host microorganism
  • Rhodococh As a host microorganism
  • the reason why the Rhodococcus rhodochrous M33 strain (VKM Ac_1515D, VKPM S-1268) is particularly preferred is that in the production of the above amide compound having a thick cell wall as a characteristic of the genus Rhodococcus, By reacting the obtained bacterial cells with nitrile compounds as they are, accumulation of 46% (weight Z liquid amount) of acrylamide has been reported by the action of nitrile hydratase possessed by the bacteria (US Pat. No. 5,827,699). issue).
  • Rhodococcus rhodochrous J1 strain and other normal microorganisms require a medium containing expensive nutrients such as yeast extract, meat extract, and vitamin for sufficient growth
  • Rhodococcus rhodochrous M33 strain is simple. It has the great advantage that it can be cultured in an inexpensive synthetic medium.
  • this patent uses the name Rhodococcus rhodochrous and the name of the M33 strain deposited at the Institute of Biochemistry and Physiology of Mic roorganisms of The Russian Academy of Science (IBFM) at S Temple (December 6, 1993).
  • this strain is not a Rhodococcus 'Rhodcrous species, but may be a new species close to the Rhodococcus' Norever species Is high.
  • This strain is the Korean Culture Center of Microorganisms (South Korea 12 0-091, Seoul 1-259) (361-221, Yurim Bldg., Hong Kong 1-dong, Seodaemun- gu, Seoul 120-09 (Republic of Korea) was deposited under the Budapest Treaty as M- 10635 (Receipt date: December 10, 2004).
  • Rhodococcus rhodochrous M33 strain (VKM Ac_1515D, VKPM S-1268 or KCCM-10635) can also be used as a host microorganism.
  • the mutant as long as the nitrile hydratase gene can be expressed by transformation with the nitrile hydratase gene to produce the nitrile hydratase, the above-mentioned Rhodococcus rhodochrous M33 strain can be used. Any variant derived from can be used. Specific examples include natural mutations, or chemical mutants or mutants that have undergone artificial mutations such as ultraviolet rays.
  • a nitrile hydratase produced by culturing the transformant of the present invention in a medium or a treated microbial cell containing the same is allowed to act on the nitrile compound
  • Amide compounds can be synthesized from nitrile compounds.
  • the degree of purification is not particularly limited as long as the action of the enzyme is not inhibited.
  • the enzyme-containing material is used.
  • a microorganism producing the enzyme, a transformant transformed by introducing a gene of the enzyme, and the like may be used.
  • the cells When using microorganisms, transformants, etc., the cells may be used, and the cells may be treated with live cells, a solvent treatment such as acetone or toluene, or freeze drying.
  • bacterial cells with increased compound permeability can be used.
  • it may be an enzyme-containing material such as a crushed cell lysate or a microbial cell extract.
  • a method for preparing a cell-treated product containing the enzyme first, the culture is separated into solid and liquid, and the obtained wet cell is used in a buffer solution such as a phosphate buffer solution or a Tris-HCl buffer solution as necessary.
  • a crude nitrile hydratase-containing liquid can be obtained.
  • This crude enzyme-containing solution can be further purified by using a known protein or enzyme isolation / purification means, if necessary.
  • an organic solvent such as acetone or ethanol can be added to a crude enzyme-containing solution to separate it, and ammonium sulfate can be added for salting out to precipitate a section containing nitrile hydratase from an aqueous solution.
  • An example of the method of crush recovery is shown.
  • the enzyme cells, the treated cells containing the enzyme, etc. may be packed in a column or immobilized on a support by a known method, especially in the case of cells, polyacrylamide. It may be encapsulated in a polymer such as a gel.
  • the reaction is carried out by suspending the microbial cell or the microbial cell-treated product in water or an aqueous solution such as a buffer solution such as a phosphate buffer and adding a nitrile compound thereto.
  • the concentration of the microbial cells or the treated microbial cells used is 0.01% to 20% by weight, preferably 0.1% to 10% by weight.
  • the upper limit of the reaction temperature is preferably 90 ° C, more preferably 85 ° C, more preferably 70 ° C, and the lower limit of the reaction temperature is, for example, 1 ° C, preferably 4 ° C, more preferably. 10 ° C.
  • reaction pH is, for example, 5-10, preferably 6-8
  • reaction time is, for example, 10 minutes to 72 hours.
  • Nitrile compound The amide compound can be produced and accumulated at a high concentration by gradually dropping the substance. In order to recover the amide compound from the reaction solution, there is a method of removing the treated microbial cells by filtration, centrifugation or the like and then removing them by a method such as crystallization.
  • a small amount (approximately lg) of soil collected in the vicinity of a hot spring in Saitama Prefecture was placed in a test tube containing 5 ml of physiological saline and cultured in a shaker at 65 ° C for 3 days. Some of the cultures takes (0. 5 ml), glucose 1.0%, polypeptone 0.5 0 /. In addition to 0.3% by weight of yeast extract (pH 7.0), the cells were cultured with reciprocal shaking at 65 ° C for 2 days. Microorganisms were isolated by spreading a part (0.1 ml) of the resulting culture solution on an agar plate medium containing the above-mentioned medium components and culturing at 65 ° C. for another 2 days to form colonies.
  • Isolated microorganism was inoculated in a liquid medium ⁇ Ka ⁇ 1 1 _ Bareronitori Le of 0.1 wt% to the medium of the same composition, by culturing for 24 hours at 65 ° C, nitrile assimilative A culture solution having high microorganisms was obtained. 1 ml of this culture broth was added to 9 ml of a 1.1 wt% acrylonitrile solution (0.05 M-phosphate buffer pH 7.7), and the reaction was started at a reaction temperature of 27 ° C. After 10 minutes, the reaction was stopped by adding lml of 1N hydrochloric acid.
  • reaction solution was analyzed by liquid chromatography (HPLC) and screened for microorganisms having nitrile hydratase activity by examining the presence or absence of acrylamide formation.
  • HPLC liquid chromatography
  • D. bacillus thermodarcosidesis Q-6 strain was obtained as a microorganism having a hydration activity for converting a nitrile compound into an amide compound.
  • HITACHI D-7000 manufactured by Hitachi
  • Example 2 Measurement of nitrile hydratase activity and its temperature dependence in D. bacillus' thermodalcosidesis Q-6 strain
  • Glycerol 0.2% by weight, Kuen trisodium dihydrate 0.2 wt%, dihydrogen potassium ⁇ beam 0.1 wt% phosphoric acid, potassium hydrogen phosphate 0.1 wt.%, Polypeptone 0.1%, yeast E key scan 0.1 0 / .
  • the hydratase activity (UZmg) was 9.37 UZmg. Furthermore, at 10 ° C, a cell suspension containing 0.5% by weight of acrylonitrile was prepared so as to be 5 UZml. Using this cell suspension, 30 ° C, 40 ° C, 50 ° C, The nitrile hydratase activity was similarly determined under the conditions of 60 ° C and 70 ° C and is shown in Table 1. As a result, the optimum temperature when cells were used in the reaction was around 60 ° C, and the activity was particularly high in the high temperature range.
  • Example 3 Thermal stability of nitrile hydratase in cells of G. bacillus' Thermodalcosidecius Q-6 strain
  • the cells obtained by the culture method of Example 2 should be 10 U / ml.
  • the suspension was suspended in distilled water, incubated at a predetermined temperature for 30 minutes, and the residual activity was measured.
  • 0.5 mL of 1% by weight acrylonitrile solution (0.05 M potassium phosphate buffer, ⁇ 7.5) is added with 0.5 ml of the incubated bacterial solution and the reaction is started while stirring at 27 ° C. did. After 5 minutes, the reaction was stopped by adding 100 / i L of 1N hydrochloric acid.
  • the activity after the storage treatment with respect to the activity before the storage treatment is calculated and shown in Table 2 as a conversion value with the activity before the storage treatment as the standard (100). From these results, it can be seen that the enzyme activity of nitrile hydratase in the cells of G. bacillus' Thermodalcosidecius Q_ 6 strain is stably maintained even at high temperatures, even at high temperatures of 70 ° C. % Of activity can be retained, and 30% or more of activity can be retained even at a high temperature of 80 ° C.
  • nitrile hydratase activity for converting various nitrile compounds described in Table 3 below into the corresponding amide compounds was examined.
  • nitrile solution 0.05 M potassium phosphate buffer, PH 7.5
  • I mL of the cell suspension was added, and the reaction was started at a reaction temperature of 30 ° C. After 10 minutes, the reaction was stopped by adding 1 mL of 1N hydrochloric acid. As a result, they all had nitrile hydratase activity.
  • the cells obtained by culturing Giobacillus thermodarcosidesis Q-6 strain were disrupted, and then subjected to ammonium sulfate precipitation, anion exchange column mouth matography, DEAE column, hydroxyapatite column, and gel filtration chromatography.
  • the nitrile hydratase enzyme was purified by dialysis.
  • An amino acid sequence of about 30 residues of purified nitrile hydratase subunit and ⁇ subunit of the purified nitrile hydratase is determined, and an oligonucleotide for gene amplification is considered in consideration of codon usage of amino acids based on the genus
  • a degenerate primer was prepared, and chromosomal DNA extracted from the bacterial cells was used as a cage, and degenerate PCR was performed to obtain an amplified DNA fragment. The amplified DNA fragment was cloned and the nucleotide sequence of the inserted fragment was determined.
  • the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence was compared with the N-terminal amino acid sequence of nitrile hydratase ⁇ subunit and subunit purified from Giobacillus' thermodalcosidesis Q-6 strain. It was confirmed that the sequence encoded nitrile hydratase.
  • Oligonucleotide degenerate primers for gene amplification are prepared from sequences having high homology in downstream genes of various known nitrile hydratase subunits, and chromosomal DNA extracted from the cells is used as a cocoon type. Degenerate PCR was performed to obtain amplified DNA fragments. The obtained amplified DNA fragment of the ⁇ subunit portion of the bacterium was cloned and the nucleotide sequence was determined.
  • nitrile hydratase ⁇ subunit and ⁇ subunit of Giobacillus' Thermodalcosidecius Q-6 strain obtained as described above were introduced into an appropriate expression vector.
  • an appropriate host bacterium was transformed. Examples of the host include Rhodococcus, Coryne, and E. coli. A guest who does not have amidase is preferable.
  • acrylamide was produced by contacting the microbial cells obtained by culturing the obtained transformant with acrylonitrile in an aqueous medium, and the production efficiency and nitrile hydratase activity were compared. .
  • the downstream gene was co-expressed with a nitrile hydratase subunit and a ⁇ subunit, and the nitrile hydratase activity was compared. As a result, it was found that the downstream gene is a gene involved in activation that significantly increases nitrile hydratase activity.
  • Example 5 Physicochemical properties of purified enzyme
  • the nitrile hydratase activity fraction was purified by culturing Giobacillus' thermodalcosidesis Q-6 strain and applying it to various columns.
  • the method for measuring the nitrile hydratase activity fraction in chromatography was as follows. To the eluate of each fraction diluted with HEPES buffer (100 mM, pH 7.2) 1 Weight% acrylonitrile was added and reacted at 27 ° C for 1 minute. The reaction was stopped by adding 10% by volume of IN HC1 to the reaction solution, and the resulting acrylamide concentration was measured by the above-mentioned HPLC analysis method.
  • a 96-well 2 ml deep bottom plate (COSTAR) was used for the culture. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation at 8000 g for 10 minutes, and 3 g of the obtained wet cells were resuspended in 20 mL of HE PES buffer (100 mM, pH 7.2). The cells are crushed with an ultrasonic breaker under cooling, and ammonium sulfate (30% by weight saturation concentration) is added to the cell lysate and gently stirred at 4 ° C for 30 minutes. Centrifugation was performed to obtain a supernatant.
  • HE PES buffer 100 mM, pH 7.2
  • Centrifugation Ammonium sulfate (70 wt% saturation concentration) was added to the supernatant, gently agitated for 30 minutes at 4 ° C, and then the precipitate obtained by centrifugation at 20000 g for 10 minutes was mixed with 9 ml of HEPES buffer (100 mM, Redissolved in pH 7.2), dialyzed in 1 L of the same solution at 4 ° C for 24 hours, and subjected to anion exchange chromatography (Amersham Biosciences; HiTrap DEAE FF (column volume 5 mL x 5)) Provided.
  • HEPES buffer 100 mM, Redissolved in pH 7.2
  • HEPES buffer 100 mM, pH 7.2
  • elute the fraction by linearly increasing the potassium chloride concentration from 0.0 M to 0.5 M, and contain nitrile hydratase activity.
  • the fraction was subjected to apatite column chromatography (manufactured by BIO-RAD; CHT2_I (column volume 2 mL)).
  • 0.1M potassium phosphate aqueous solution f Night (pH 7.2) developed f Night, the fraction was eluted by increasing potassium phosphate linearly from 0.01M force to 0.3M, nitrile hydra A fraction containing tase activity was obtained.
  • the fraction was subjected to gel filtration chromatography (Amersham Biosciences; Superdex 200 HR 10/30) using 0.05M sodium phosphate aqueous solution (pH 7.2) containing 0.15M NaCl as a developing solution.
  • a nitrile hydratase activity fraction was obtained. This The following examples were carried out using the nitrile hydratase activity fraction of the gel filtration chromatography thus obtained.
  • the nitrile hydratase activity fraction solution (3.2 mgZmL, 0.05 M phosphate buffer (pH 7.5)) derived from Giobacillus thermodarcosidesis Q _6 strain was reacted at the reaction temperatures shown in Table 4.
  • the nitrile hydratase activity that converts the compound to an amide compound was measured. lmL 0.5 weight 0 /.
  • a nitrile hydratase active fraction solution was added to an acrylonitrile solution (0.05M potassium phosphate buffer, pH 7.5), and the reaction was started while stirring at each temperature. After 2 minutes, the reaction was stopped by adding 100 / L of 1N hydrochloric acid.
  • the unit of enzyme activity (unit) is defined as the unit that converts 1 ⁇ mol of acrylonitrile into acrylamide per minute (hereinafter referred to as U), and the hydration activity per unit weight of the enzyme (U / mg) Table 4 shows the results. From this result, the activity of nitrile hydratase in the nitrile hydratase activity fraction purified from Giobacillus' thermodalcosidesis Q-6 strain increased to 60 ° C as the reaction temperature increased. The optimal temperature is considered to be around 60 ° C, similar to when the cells are used in the reaction, and shows a very high nitrile hydratase activity even at a high temperature of 70 ° C.
  • the nitrile hydratase active fraction solution (3.2 mg / ml, 0.05M phosphate buffer ( P H7. 5)) 30 min. was measured.
  • Nitrile hydratase solution after incubation treatment in addition 5 ⁇ ⁇ was stirred at 27 ° C However, the reaction started. After 2 minutes, the reaction was stopped by adding 100 zL of 1N hydrochloric acid.
  • Step 4 Acrylonitrile concentration dependence and concentration tolerance of purified nitrile hydratase Dependence and resistance to acrylonitrile concentration as substrate for nitrile hydratase purified from Giobacillus' thermodalcosidesis Q-6 strain
  • 4 ⁇ 1 of nitrile hydratase active fraction solution (3.2 mg / mL, 0.05 M phosphate buffer ( ⁇ 7 ⁇ 5)) was added to a 5 ml solution (0.05 M in various weight% acrylonitrile).
  • potassium phosphate buffer pH 7.5
  • the enzyme activity of nitrile hydratase in the aqueous solution in the nitrile hydratase active fraction purified from Giobacillus' thermodalcosidesis Q-6 strain is maintained even at an acrylamide concentration as high as 35%. And les.
  • Example 6 Nitrilhydratase derived from Giobacillus' thermodalcosidesis Q-6 strain
  • Step 1 Confirmation and determination of N-terminal amino acid sequence of nitrile hydratase enzyme from D. bacillus' thermodalcosidesis Q-6 strain
  • the eluate of nitrile hydratase activity fraction obtained by gel filtration chromatography obtained in Example 5 was subjected to reduced SDS-polyacrylamide electrophoresis under reducing conditions. After electrophoresis, protein staining with Coomassie brilliant blue (CBB) was performed, and as a result of decoloration, two major bands having a molecular weight of about 25 K Dalton and about 28 K Dalton were confirmed.
  • CBB Coomassie brilliant blue
  • ⁇ -sub A primer was prepared considering the position of the gene encoding the unit and / 3 subunit on the chromosome.
  • Step 3 Extraction of chromosomal DNA from D. bacillus. Thermodarcosidesis Q_6 strain and degenerate PCR
  • Giobacillus' thermodalcosidesis Q_6 strain was cultured and collected by the same method as in Example 2, and chromosomal DNA was extracted from the cells using QIAGEN's Genomic-tip System (500 / G) kit. Degenerate PCR was carried out using 0.1 ⁇ g of chromosomal DNA of D. bacillus' Thermognocosidesis Q-6 strain dissolved in TE solution as a cage. In the degenerate PCR reaction, 36 combinations of primers 1 to 6 described in SEQ ID NOs: 5 to 10 in the sequence listing and primers 7 to 12 described in SEQ ID NOs: 11 to 16 in the sequence listing were performed.
  • Two OOpmol primers were used to amplify DNA fragments by degenerate PCR reaction using 5 U Takara Ex Taq DNA polymerase and a total volume of 100 ⁇ l of the reaction solution.
  • the reaction conditions are as follows. 96 ° C, heat denaturation for 3 min, 96 ° C, 30 sec heat denaturation, 42 ° C, 30 sec annealing, 72 ° C, 1 min 30 sec after 35 cycles of extension, 72 ° C, 5
  • the reaction was allowed to extend for 4 minutes and kept at 4 ° C.
  • Each PCR product was subjected to 1% by weight agarose electrophoresis to confirm DNA amplification.
  • primer 5 (a R2) described in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing and SEQ ID NO: 11 in the sequence listing were used.
  • PCR reaction performed with the combination of primer 7 (i3 Fl) described and the combination of primer 5 (H2) described in SEQ ID NO: 9 of the sequence listing and primer 8 ( ⁇ F2) described in SEQ ID NO: 12 of the sequence listing Only in this case, amplification of a DNA fragment of about 700 bp was confirmed.
  • the amplified DNA fragment was excised from the gel, extracted using the QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN), and ligated to the pGEM_T Vector (Promega) using T4 DNA Liga se.
  • QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit
  • pGEM_T Vector Promega
  • A is added to the 3 'end.
  • LB agar medium 50 zg / ml ampicillin, 0.5 weight 0/0 bacto yeast extra Tato, 1 weight 0/0 butter Toto Lipton, 0.5 weight 0/0
  • the cells were cultured overnight at 37 ° C.
  • the plasmid DNA was extracted from the transformant cultured in the LB medium by a conventional method, and the base sequence was deciphered using the insert sequence of about 700 bp and the SP6 and T7 promoter sequences on the vector as primers.
  • RF1 681 bp open reading frame
  • the 25 amino acid sequence at the N-terminal side deduced from the base sequence of ORF1 and the 25 amino acid sequence at the N-terminal side of the purified 28-K dalton polypeptide chain are completely identical, and SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. It corresponds to the 1st to 25th sequence of the described amino acid sequence.
  • the amino acid sequence of ORF1 showed low homology with the known ⁇ -subunit amino acid sequence of nitrile hydratase, suggesting that it encodes the protein.
  • the nitrile hydratase ⁇ subunit of Giobacillus' Thermodalcosidecius Q-6 strain encodes 226 amino acids, and the degree of amino acid sequence match with highly homologous proteins in the existing database is In descending order, from Klebsiella genus MC12609, nitrile hydratase ⁇ subunit and 43%, Agrobacterium nitril hydratase ⁇ subunit and 42%, Rhodosyudomonas genus JCM3095 nitrile hydratase subunit 40% and very low.
  • the amino acid identity of the protein derived from the genus Bacillus, a closely related genus was 35.0% with the nitrile hydratase j3 subunit of the thermophilic bacterium Bacillus BR449, and the thermophilic bacterium Bacillus smithii SC. -J05- 1 nitrile hydratase j3 subunit and 34.5% were extremely low.
  • the nitrile hydratase j3 subunit of the thermophilic bacterium Bacillus BR449 and the nitrile hydratase j3 subunit of the thermophilic bacterium Bacillus smithii SC-J05-1 have a high agreement of 85.6%.
  • oligonucleotide primers for PCR amplification were prepared in the di-tolyl hydratase ⁇ subunit of Giobacillus' thermodalcosidecius Q_6 strain whose base sequence was previously decoded.
  • Degenerate PCR was carried out using 0.1 ⁇ g of chromosomal DNA of Giobacillus thermodalcarcidesius Q-6 strain as a saddle type.
  • the degenerate PCR reaction is performed by combining primers 13, 14 shown in SEQ ID NOs: 17, 18 and primers 15, 16 shown in SEQ ID NOs: 18, 19 in the sequence listing at an annealing temperature of 50 ° C. Went down the street.
  • an amplified DNA product of about 0.8 kb was obtained in a PCR reaction performed using a combination of primer 13 (pR 1) shown in SEQ ID NO: 17 of the sequence listing and primer 15 (Q6AposF) shown in SEQ ID NO: 18 of the sequence listing. The existence of was confirmed.
  • the nitrile hydratase subunit of Giobacillus' Thermodalcosidecius Q-6 strain encodes 205 amino acids, and the degree of amino acid sequence match with a highly homologous protein in the existing database is In descending order, the nitrile hydratase / 3 subunit of the thermophile Bacillus BR449 is 66.3%, and the nitrile hydratase / 3 subunit of the thermophile Bacillus smithii SC-J05-1 is 63.9%. Les.
  • thermophilic bacterium Bacillus BR449 and the nitrile hydratase ⁇ subunit of the thermophilic bacterium Bacillus smithii SC-J05-1 have a high homology of 88.8%.
  • Primer 17 ((36 & 1) —? 1-chome) described in SEQ ID NO: 21 in the sequence listing and primer 18 (Q6ABall_Rl_BglII_T) described in SEQ ID NO: 22 in the sequence listing.
  • Primer 17 described in SEQ ID NO: 21 in the sequence listing was designed as a translation initiation codon for the nitrile hydratase ⁇ subunit of Giobacillus thermodarcosidesis Q-6 strain in the restriction enzyme site Ndel.
  • a restriction enzyme Bglll site was introduced into primer 18 shown in SEQ ID NO: 22 in the sequence listing immediately below the translation termination codon of the nitrile hydratase subunit of Gibacillus' thermodalcosidesis Q-6 strain.
  • a PCR reaction was carried out using the chromosomal DNA of G. bacillus. Thermodarcosidesis Q-6 strain as a saddle and primers 17 and 18 described in SEQ ID NOs: 21 and 22 in the sequence listing, respectively, lOOpmol.
  • this plasmid was digested with Ndel and EcoRI restriction enzymes and subjected to 1.5% by weight agarose electrophoresis.
  • About 1.3 kb of insert DNA was excised from the agarose gel and extracted by a conventional method.
  • Novagene pET-28a (+) vector was used as an expression vector.
  • This DNA was digested with Ndel and EcoRI restriction enzymes and subjected to 1% by weight agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 5.3 kb was extracted by a conventional method.
  • These inserts and vectors were subjected to ligation reaction according to a conventional method, E.
  • coli strain JM109 was transformed, plasmid DNA was extracted from the transformant selected for kanamycin resistance, and the plasmid into which the insert was introduced was selected. From the above, an expression plasmid introduced as a nitrile hydratase ⁇ subunit and ⁇ subunit partial force S insert of Gibacillus' thermodalcosidecius Q-6 strain was obtained. The completed plasmid is referred to below as pET-28a (+)- ⁇ a.
  • the chromosomal DNA of Giobacillus' thermodalcosidecius Q-6 strain prepared in Step 3 of Example 6 was digested with various restriction enzymes and subjected to 1 wt% agarose gel electrophoresis. After the DNA in the agarose gel was transferred to a nylon membrane Hybond—N + (Amersham), chromosome Southern hybridization was performed using the previously prepared fluorescently labeled DIG probe. Hit one membrane with DNA transferred and immobilized 10ml hybrida I See Chillon buffer (1 weight 0 /. Skim milk, 0.1 wt 0 / ON- la ⁇ b sarcosine, 0.02 wt% SDS, 50 weight 0 /.
  • the pUCl18 plasmid vector DNA used for ligation was digested with the restriction enzyme Hindlll, then purified by phenol / chloroform treatment and ethanol precipitation, followed by the use of alkaline phosphatase (Takara). After dephosphorylation, phenol / chloroform treatment and ethanol precipitation were performed again, subjected to agarose electrophoresis, and repurified by extraction from an agarose gel.
  • the membrane was washed once with 2 X SSC dissolved night (18.76 g of NaC and 4.41 g of sodium citrate in 1 X SSC1 litnore), and then the membrane was air-dried on dry filter paper. Furthermore, DNA was immobilized on the membrane by UV irradiation at 120 mj / cm2.
  • the fluorescently labeled probe lOOng prepared in the same manner as above was heat denatured by boiling and quenching at 95 ° C for 10 minutes, added to the prehybridization buffer, and hybridized at 42 ° C. It was.
  • the membrane after hybridization was washed twice with 150 ml of 2 ⁇ SSC containing 0.1 wt% SDS at room temperature. Then washed twice for 5 minutes in 1 X SSC containing 0.1 weight 0/0 SDS in 150ml of heated Caro 65 ° C (149 ° F) was carried out. Subsequently, after washing for 5 minutes with 100 ml of maleic acid buffer (0.1M maleic acid, 0.15M NaCl, Na ⁇ H prepared to ⁇ 7.5), 50 ml of blocking solution (0.3Sfi% Tween20, 0 Blocking was performed at room temperature for 30 minutes in 0.1 M maleic acid buffer (pH 7.5) containing 15 M NaCl and 1% by weight skimmy milk.
  • maleic acid buffer 0.1M maleic acid, 0.15M NaCl, Na ⁇ H prepared to ⁇ 7.5
  • blocking solution 0.Sfi% Tween20, 0 Blocking was performed at room temperature for 30 minutes in 0.1 M maleic acid buffer (pH
  • Anti-digoxigenin-AP is diluted with 20 ml of blocking solution to 75 mU / ml, antibody reaction is performed at room temperature for 30 minutes, and then 100 ml of washing buffer (0.3 weight 0 /. Tween 20, 0.15 M NaCl) The membrane was washed 5 times in 0.1M maleate buffer containing pH 7.5; pH 7.5) to wash away unbound antibody. After equilibration for 5 minutes in 20 ml of detection buffer (0.1 M Tris-HCl, 0.1 M NaCl, pH 9.5), add 34 ⁇ l of 100 mg / ml sputum solution to 10 ml of detection buffer.
  • detection buffer 0.1 M Tris-HCl, 0.1 M NaCl, pH 9.5
  • a chromogenic substrate solution NBT / BCIP was prepared by diluting 35 ⁇ 1 of a 50 mg / ml BCIP solution, covered so that the membrane was completely immersed, and incubated for 1 to 16 hours in the dark. During the incubation, the color was confirmed without moving or shaking the disc. As a result, out of 1000 clones on the membrane, 4 positive signals were found and their positions and Overlapping positive clones were confirmed on the original petri dish.
  • Confirmed positive clones are inoculated from petri dishes into LB liquid medium containing ampicillin, cultured overnight at 37 ° C at 250 rpm, and the cells are collected by centrifugation. Extracted. After digesting the plasmid DNA with the restriction enzyme Hindlll, it was subjected to 1.5% by weight agarose electrophoresis, and the size of the inserted fragment was confirmed to be about 2.3 kb. In addition, it was confirmed by several patterns of PCR and a digestion pattern with a restriction enzyme that the inserted fragment contained the nitrile hydratase ⁇ -subunit portion of Giobacillus' thermodalcosidesis Q-6 strain.
  • Fig. 1 shows the restriction enzyme map and gene structure of the nitrile hydratase and downstream gene group of Giobacillus' thermodalcosidesis Q-6 strain.
  • ORF3 an open reading frame consisting of a 339 bp nucleotide sequence (hereinafter referred to as ORF3) exists in the inserted fragment in the same orientation downstream of the 5 'end of the nitrile hydratase ⁇ subunit (ORF2). Confirmed to do.
  • the distance between ORF2 translation stop codon and ORF3 translation start codon was 12 bp, and between ORF3 translation stop codon and ORF translation start codon located further downstream was 145 bp.
  • ORF3 encodes 112 amino acids and has very low but homology with the following proteins in the existing database.
  • the amino acid match ratios of the highly homologous sequences are 31.0% with P12K of Nutilus BR449 strain, 31.0% with Rhodococcus rhodochrous J1 strain, 31.0% with Rhodococcus rhodochrous J1
  • the shares were NhlE and 21.0%, Pseudocardia 'Thermophila JCM3095 P16 and 23.2%.
  • Step 8 Reconstruction of the nitrile hydratase subunit and ⁇ subunit and downstream gene ⁇ RF3 of E. coli strains of G. bacillus.
  • the plasmid was digested with the restriction enzyme Hindlll, dephosphorylated, and extracted with phenol black form to perform dephosphorylation.
  • This digested product was subjected to 1% by weight agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 6. lkb was obtained by a conventional method. Extracted.
  • This DNA fragment includes the pET vector and the Hindlll restriction enzyme site located at the 60th amino acid of the nitrile hydratase ⁇ subunit and the subunit of Gibacillus' thermodalcosidesis Q-6 strain.
  • the pUC 118-Q6Hin2.3 plasmid was digested with the restriction enzyme Hindlll and subjected to 1 wt% agarose electrophoresis to extract about 2.3 kb of insert DNA.
  • This insert was ligated with the previously extracted fragment, E. coli strain JM109 was transformed, and a plasmid containing insert DNA was selected from the transformant selected for resistance to namycin.
  • the pET- 28a (+) vector contains the nitrile hydratase ⁇ subunit and ⁇ subunit and the downstream gene ORF3 of the D. The contained plasmid was obtained.
  • the thus completed plasmid is hereinafter referred to as pET-28a (+)- ⁇ a12.
  • Example 7 Expression of the nitrile hydratase gene of the Q6 strain using the nitrile hydratase gene promoter in Rhodococcus rhodochrous M33
  • the nitrile hydrator gene region of the M33 strain was cloned.
  • Rhodococcus Rhodochrous M33 strain YMPD medium (glucose 1.0 wt% polypeptone 0. 5 wt 0/0, yeast Tato 0.3 wt 0/0, maltodextrin extra Tato 0.3 wt 0/0, pH 7. 2
  • the chromosomal DNA was extracted from the bacterial cells collected and collected using QIAGEN's Genomic tip system (500 / G) kit.
  • plaque hybridization was performed according to the DIG manual. First, about 1000 plaques that appeared were transferred to a membrane filter, and hybridized with the fluorescently labeled DIG probe prepared as described above, to obtain three far plaques showing a positive signal.
  • phage DNA was prepared using Wizard Lamda Prep (Promega). The obtained 3 phage DNAs were cleaved with various restriction enzymes, and then 311 was selected which contained the longest upstream portion of the nitrile hydratase gene.
  • the ⁇ 311 obtained above was cleaved with Kpnl and Sacl, and the 5.4 Kbp fragment obtained after agarose electrophoresis.
  • the recovered product was mixed with pGEM3zf (+) (manufactured by Pugue Mega) cut with Kpnl and Sacl, and ligated with T4 DNA ligase.
  • This plasmid was named M33KpnISacI / pGEM3zf, the entire base sequence of the inserted fragment was determined, and shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
  • the restriction enzyme map and gene structure are shown in FIG.
  • Promoting the nitrile hydratase gene of M33 strain on M33KpnISacl / pGEM3zf KSNH_pGEM3z was prepared by the following procedure as a vector in which Ndel, BgIII, and Clal sites were inserted for expression gene insertion in the meantime, while leaving the terminator and a part of the terminator.
  • PCR amplification was carried out on the M33KpnISacI / pGEM3zf3 ⁇ 4r type II using the primer M33-F05 described in SEQ ID NO: 26 of the Sequence Listing and M33-R18 described in SEQ ID NO: 27, and the 7007 fragment was recovered after agarose electrophoresis.
  • M33-R18 is designed so that the restriction enzymes Ndel, BglII, and Clal sites are arranged in this order at the translation start point of the nitrile hydratase i3 subunit protein of M33 strain.
  • This PCR product was cleaved with Pstl and Clal and again subjected to agarose electrophoresis. Then, a 400 bp fragment was recovered, mixed with the above 6545 bp fragment, and ligated with T4 DNA ligase to obtain KSNH-pGEM3z.
  • KSNH-pHSG298 was prepared as follows. KSNH—pG3z cut with Kpnl and Sacl and 3774 bp fragment recovered by agarose electrophoresis and pHSG298 cleaved with Kpnl and Sacl were ligated with T4 DNA ligase to obtain approximately M ⁇ 44 kb plasmid M33KSNH—pHS G298 did.
  • the Ndel restriction enzyme site designed on the translation initiation codon of the ⁇ subunit and the restriction enzyme Bglll located immediately after the translation termination codon of the 0 ⁇ ⁇ gene were deleted.
  • a 5 kb DNA fragment was recovered.
  • approximately 6.44kb plasmid M33KSNH — PHSG298 was digested with restriction enzyme Ndel, then digested with Bglll, and subjected to agarose gel electrophoresis. The DNA fragment was recovered.
  • the approximately 6.44 kb M33KSNH _pHSG298 vector region was ligated to the approximately 1.5 kb Q6-derived nitrile hydratase j3, the subunit, the downstream gene or the insert region of the downstream gene or f3 part, and approximately 7.94 kb of M33KSNH.
  • PHSG298 The Q6 ⁇ ⁇ 0 ⁇ plasmid was prepared.
  • This M33KSNH_pHSG298_Q6 j3 orf3 plasmid has a vector part of about 2.64 kb and an insert part of the M33 strain nitrile hydratase promoter region of about 3.8 kb and the Q6 strain nitrile hydratase Subunit, downstream gene orf3 about 1.5 kb combined with about 1.5 kb.
  • the translation start codon ATG of the nitrile hydratase subunit of the M33 strain was replaced with the translation start codon of the nitrile hydratase ⁇ subunit of the Q6 strain.
  • a gene unit was constructed that expressed the nitrile hydratase of the strain and the downstream gene 0 ⁇ .
  • the expression unit constructed above was introduced into an approximately 5.9 kb E. coli-resistant shuttle vector pRE-7 having kanamycin resistance as follows.
  • PRE-7 is prepared from pBluescript (Stratagne), pACYC 177 (New England Biolabs) and pOTS by the method of Zheng et al. (Plasmid 38 180-187, 1997).
  • This ⁇ TS is the same as p 103 described in TAKAI et al. (Infection and Imunity, Dec. 2000, p6848_6847), and is almost the same as P33701 in the same literature, especially used for the preparation of pRE-7.
  • the P33701 can be isolated from Rhodococcus equi A TCC33701 strain.
  • Ad5F SacKpnNotl (5′-pCCGGTACCGC described in SEQ ID NO: 30 in the sequence listing)
  • Ad5R— SacKpnNotl 5' —pGGCCGCGG TACCGGAGCT— 3 ') (p is 5, indicating phosphorylation at the end) described in SEQ ID NO: 31 in the sequence listing.
  • an adapter Ad5-SacKpnNotl was prepared.
  • the shuttle vector pRE_7 (5.9 kb) contained the nitrile hydratase promoter region (3.8 kb) of the M33 strain and the nitrile hydratase j3, the subunit and the downstream gene of the Q6 strain.
  • LB liquid medium 0.5 wt% Bacto yeast extra Tato, 1 wt% butter Toto Lipton, 0.5 by weight 0/0 NaCl (pH7. 5 )
  • the cells were collected by centrifugation at 10, OOO X g for 15 minutes at C.
  • the cells were washed twice with 25 ml of ice-cold distilled water and centrifuged (4 ° C, 10, OOO X g for 15 minutes), and 10% by weight of glycerol sterilized with filter was used.
  • Rhodococcus rhodochrous M33 in a 500 ml Erlenmeyer flask containing 100 ml
  • One strain of transformant was inoculated and cultured at 30 ° C for 2 days.
  • 90 ml of the resulting culture solution was transplanted into a 5 L volume jar mentor containing 3 L of production medium, and cultured for 48 hours at pH 7.2, stirring speed 500 ⁇ ⁇ ⁇ , 30 ° C.
  • the culture was harvested by centrifugation at 25 ° C and 10,000 xg for 15 minutes.
  • the cells were washed twice by 25 ml of water and centrifuged at 1,00 OX g for 15 minutes at 25 ° C to obtain cells for production reaction.
  • the parent strain Rhodococcus rhodochrous M33 was cultured in the same manner as in Step 4 above, except that kanamycin was not added to the medium, and acrylamide was cultured in the same manner as in Step 5 using the cells from this culture.
  • the maximum accumulation of acrylamide was 43% (weight / liquid volume). From this, it was confirmed that the amount of acrylamide accumulated in the transformant of M33 described above was significantly accumulated by introduction of the nitrile hydratase gene derived from the Q6 strain.
  • Table 3 also shows the results of FIG. 3 in which the results of the example and the comparative example are graphed in FIG.
  • the culture solution of the parent strain M33 obtained in Comparative Example 1 and the culture solution of the M33 transformant obtained in Step 4 above were collected by centrifugation at 8,000 g for 10 minutes, respectively. 80 mg of the obtained wet cells were resuspended in 2 ml of 50 mM sodium phosphate buffer (PH7). Cultivate the cells with an ultrasonic crusher under cooling, add glycerol to the cell crushing solution to 10% (weight / volume), and add each sample to a native using 10% gel. 'Analyzed by polyacrylamide electrophoresis.
  • the band located in the same position as the purified nitrile hydratase of the Q6 strain obtained from the transformant Sampnore was transferred to a PVDF membrane (MILLIPORE), stained with CBB, The portion where the target band was adsorbed was cut out from the PVDF membrane.
  • the N-terminal amino acid sequence of the protein was decoded using a fully automatic protein primary structure analyzer PPSQ-23A (Shimadzu Corporation).
  • the microorganism of the present invention can be suitably used in the field of converting a nitrile compound into a corresponding amide compound even in a reaction at a high temperature and under a high nitrile compound concentration or a high amide compound concentration.
  • FIG. 1 shows the nitrile hydratase ⁇ subunit, spleen subunit and downstream inheritance of Geobacillus thermogluc osidasius Q_6 strain. The gene composition and restriction enzyme map of the offspring group are shown. The position of the fragment (Hin 2.3) obtained by colony hybridization and the fragment ( ⁇ 1) introduced when expressed in Rhodococcus bacteria are shown.
  • FIG. 2 shows the gene structure of the nitrile hydratase gene ⁇ subunit, ⁇ subunit and downstream gene group of Rhodococcus rhodochrous M33 strain and the restriction enzyme map of the surrounding region. Both ends of the restriction enzyme map correspond to Kpnl and Sacl used for subcloning from the DNA of ⁇ 311 obtained by black hybridization.
  • the thick line is the part used for M33KSNH-pHSG298, and the linker is inserted in the part where the thick line is cut.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of acrylamide production reaction using Rhodococcus rhodochrous M33 strain and its transformants.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

　本発明の目的は、熱安定性に加え、且つ基質であるニトリル化合物や生成物であるアミド化合物の高濃度存在下でも高い活性を保つニトリルヒドラターゼを用いたアミド化合物の製造方法を提供することである。本発明では、自然界より目的のニトリルヒドラターゼを発現する新規な微生物を探索し、該酵素遺伝子を遺伝子導入したロドッカス属の形質転換菌体およびその菌体処理物を製造に用いる。

Description

明 細 書
二トリルヒドラターゼを発現する形質転換体
技術分野
[0001] 本発明は、二トリルヒドラターゼ遺伝子で形質転換されたロドコッカス（Rhodococcus) 属に属する微生物、並びに上記微生物が保持する二トリルヒドラターゼの酵素触媒 作用を用いて二トリルイ匕合物からアミド化合物を製造する方法に関する。
背景技術
[0002] 二トリル化合物の二トリル基を水和してアミド基に変換し対応するアミド化合物を製 造する技術においては、従来の銅触媒による化学的な方法に代えて、微生物の酵 素を触媒として用いる方法が主流となってきている。そのような酵素は一般に二トリル ヒドラターゼと呼ばれるが、初めての報告以来、多数の酵素が様々な微生物より発見 されている。例えば、ァノレスロノくクタ一 (Arthrobacter)属 (Agricultural and Biological Chemistry Vol.44 p.2251- 2252, 1980)、 ァグロバタテリゥム (Agrobacterium)属（特開平 05— 103681)、ァシネトパクター（Acinetobacter)属（特開昭 61— 282089)、エア ロモナス(八61~01!1011&3)属（特開平05 _ 030983)、ェンテロパクター ^61"0 & 61~)属（ 特開平 05— 236975)、ェノレウイユア (Erwinia)属（特開平 05— 161496)、キサントノ クタ一 (Xanthobacter)属（特開平 05— 161495)、クレブシエラ (Klebsiella)属（特開平 05 _ 030982)、コリネバクテリゥム（。0171½ & 61 11111)属（特開昭54_ 129190，後 にロドコッカス属と判明）、シユードモナス (Pseudomonas)属（特開昭 58— 86093)、シ トロパクター（Qtrobacter)属（特開平 05 _ 030984)ストレプトマィセス 印 11^063 )属（特開平 05— 236976)、バチルス (Bacillus)属（特開昭 51— 86186、及び特開 平 7— 255494)、フザリウム属（特開平 01— 086889)、ロドコッカス (Rhodococcus)属 (特開昭 63— 137688、特開平 02— 227069、特開 2002— 369697、及び特開平 2—470)、リゾビゥム(1¾^01^11111)属（特開平05— 236977)、シュードノカルディァ(？3 eudonocardia)属（特開平 8— 56684)等が挙げられる。これらの酵素はそのアミノ酸 配列の多様性に基づき、その理化学的性質も多様であり、各種目的に沿って研究が 進められて来た。理化学的性質の中でも、熱、あるいはアミド化合物および二トリルイ匕 合物等への安定性に関する解明が進んでいる例としては、ロドコッカス ·ロドクロウス（ Rhodococcus rhodocnrousAjl株 ίこ関す 文献 (European Journal or Biocnemistry Vol .196 p.581-589, 1991. Applied and Microbiology Biotechnology Vol.40 p.189—195, 1993、特開 2004— 215513、及び特開 2004— 222538)、シユードノ力ノレディア 'サ ーモフイラ (Pseudonocardia thermophila)JCM3095株に関する文献（特開平 8 _ 187 092、及び Journal of Fermentation and Bioengineering Vol.83 p.474-477, 1997J、バ チルス（Bacillus)属 BR449株に関する文献 (W〇 99/55719、及び Applied Biochem istry and Biotechnology Vol.77-79 P.671-679, 1999)、バチルス（Bacillus)属 RAPc8 株に関する文献（Enzyme and Microbial Technology Vol.26 p.368-373, 2000、及び E xtremophiles Vol.2 p.347- 357， 1998)、バチルス 'パリダス（Bacillus palidus) Dac521 株に関する文献 (Biochimica et Biophysica Acta Vol.1431 p.249-260, 1999)、 SC— J 05— 1株 (こ関する文献 (Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology Vol.20 220-226, 1998)、コマモナス.テストステロ二（Comamonas testosteroni) 5— MGAM— 4D株に関する文献 (WO2004/101768)、ロドコッカス ·ピリディノボランス（Rhodoc occus pyridinovorans) MW3抹に関する文献 (Biotechnology Letters 2り： 1379—1384， 2004)が挙げられる。
一方、これらユニークな二トリルヒドラターゼは酵素自体としては優秀であっても、ェ 業的に製造に用レ、る際には、酵素を生産する微生物に欠点があることも多ぐ遺伝 子工学の手法により宿主を変更する必要がある。その第一段階として、遺伝子のクロ 一ユングする試みが多数、検討されている。例えば、シユードモナス属（特開平 3— 2 51184)、ロドコッカス属（特開平 2— 119778、特開平 4— 211379、特開平 09— 0 0973、特開平 07— 099980、及び特開 2001— 069978)、ジゾビゥム属（特開平 6
— 25296)、クレブシエラ属（特開平 6— 303971)、ァクロモパクター属（特開平 08 - 266277)、シユードノカノレディァ属（特開平 9— 275978)、バチルス属 (特開平 09
— 248188)等を挙げることができる。次のステップとして、工業的な生産に最適な宿 主で、該遺伝子を発現させる必要があるが、多くの試みは遺伝子操作系が確立した 大腸菌等での発現であり、この際には微生物を培養後、菌体内より酵素を精製や固 定化するという余分な工程が必要となる。ロドコッカス属ゃコリネバタテリゥム属のよう に細胞壁が堅ぐ高濃度のアミド化合物や二トリル化合物中でも細胞内の酵素の活 性を維持できる微生物中で発現することで、この問題を解決できるが、個々の微生物 において、遺伝子操作系を開発するのは困難をともなう。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 発現させる酵素の理化学的性質としては熱安定性や基質である二トリル化合物や 生成物であるアミド化合物の高濃度存在下でも高い活性を保つ二トリルヒドラターゼ が望ましぐ同目的の報告もあるが、反応に用レ、る酵素の実施形態、二トリル化合物 の種類によりそれらの絶対値は変動することもあり、すべてを兼ね備えた酵素は見出 されていない。
[0005] また、二トリル化合物よりアミド化合物を工業的に製造する際には、アミド化合物の 製造コストに占める該酵素の製造コストが重要な問題であり、より安価でより単純な培 地における培養法の確立した微生物を用いて生産を行うことが望ましぐこれらの微 生物を宿主として用いた遺伝子組換え菌の作製が望まれる。
[0006] 該酵素の製造コストという課題の点では、培養が容易なだけでなぐ菌体あたりの該 酵素の発現量が高い遺伝子操作系を開発することも必須となる。
[0007] さらに、宿主微生物の内部に存在する二トリルヒドラターゼ酵素力 高濃度のアミド 化合物や二トリル化合物の中でも安定に存在することができるなら、該酵素を内部に 保持する固定化担体として微生物をみなすことができる。その場合、高濃度の基質（ 二トリル化合物）中での反応が可能になり、最終的なアミド化合物の蓄積濃度も上昇 する。さらには、酵素の取り出しや、固定化担体への結合といった操作を省略し、微 生物自体を反応の触媒として用いることができる。
[0008] すなわち、本発明の目的は、熱や高濃度化合物に対する安定性の高い二トリルヒド ラターゼを自然界より単離し、その酵素のアミノ酸配列および遺伝子配列を提供し、 該遺伝子を含む組換えプラスミド、該組換えプラスミドを用いて、生産時のコスト的な 優位性を持つ宿主においても、類稀な酵素の発現量を達成する形質転換体を提供 することである。さらに本発明の別の目的は、上記形質転換体を培養'増殖させること による該形質転換体を用いた該酵素の産生方法、並びに該形質転換体を用いた二 トリルイ匕合物からの対応するアミド化合物の安価な製造方法を提供することである。 課題を解決するための手段
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、埼玉県の温泉 近傍にある土壌より二トリルヒドラターゼ活性を有する微生物として、ジォバチルス 'サ
Figure imgf000005_0001
)を見出した。なお、シォバ チルス属の微生物が二トリルヒドラターゼを有し、二トリルヒドラターゼ活性を示すこと はこれまで知られておらず、さらに本微生物の培養に通常用いる 65°Cという温度は、 従来の二トリルヒドラターゼを持つ好熱菌の通常の培養温度（45°C〜60°C)を越える ものであり、酵素としてアミド化合物や二トリル化合物に対しての安定性を併せ持つ。
[0010] また、該微生物より二トリルヒドラターゼ酵素を精製し、その二トリルヒドラターゼ活性 が熱や高濃度の二トリル化合物、及びアミド化合物に対して高い安定性を兼ね備え ることを示した。また、精製した酵素の各サブユニットの N末端のアミノ酸配列をもとに 該微生物の染色体 DNAより二トリルヒドラターゼ遺伝子を単離し、そのアミノ酸配列お よび遺伝子配列を初めて明らかにした結果、既存の二トリルヒドラターゼとの相同性 は非常に低いことが判明した。また、その遺伝子下流に存在する活性化タンパク質と 推定される遺伝子配列とともに、発現することにより、該酵素を大量に発現する遺伝 子組換え菌株を作出することにも成功した。また、これをさらに完成度の高い発明と するために、細胞壁が硬ぐ微生物自体を酵素の固定化担体のように使えるロドコッ カス属に属する微生物に着目し、さらには安価な培地での培養も可能であり、工業生 産に適した微生物であるロドコッカス'ロドクロウス M33 (Rhodococcus rhodochrous M3 3)株 (VKM Ac-1515D)を宿主として、該酵素を類稀に大量発現する遺伝子組換え 株を作製することにも成功した。一方、この結果より、ロドコッカス'ロドクロウス M33株 は異種生物の二トリルヒドラターゼを発現する宿主として普遍的な価値を持つとも証 明できた。
[0011] すなわち、本発明によれば、以下の（1)から（9)に記載の発明が提供される。
(1) 下記（A)又は（B)の何れかに記載の DNAにより形質転換されたロドコッカス（R hodococcus)属に属する微生物。
(A)二トリルヒドラターゼの αサブユニットに対応する配列表の配列番号 1に記載のァ ミノ酸配列、又は配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数 個のアミノ酸の置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列と 、二トリルヒドラターゼの βサブユニットに対応する配列表の配列番号 2に記載のアミ ノ酸配列、又は配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数個 のアミノ酸の置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列とを 含有する DNAであって、二トリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする D
(Β)二トリルヒドラターゼのひサブユニットをコードする塩基配列に対応する配列表の 配列番号 3の 695〜1312番目の塩基配列、又は当該塩基配列に対してストリンジェ ントな条件下でハイブリダィズする塩基配列と、二トリルヒドラターゼの βサブユニット をコードする塩基配列に対応する配列表の配列番号 3の 1〜681番目の塩基配列、 又は当該塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列と を含有する DNAであって、二トリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする DNA。
(2) 形質転換により下記の理化学的性質を有するタンパク質を生産することができ るロドコッカス（Rhodococcus)属に属する微生物。
(a)二トリルヒドラターゼ活性を有する。
(b)基質特異性：アクリロニトリル、アジポニトリル、ァセトニトリル、イソブチロニトリノレ 、 n -バレロ二トリル、 n-ブチロニトリル、ベンゾニトリル、へキサン二トリルを基質として、 活性を示す。
(c)分子量:少なくとも下記の 2種類のサブユニットから構成されるタンパク質であつ て、各サブユニットの還元型 SDS-ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が以下の 通りである。
サブユニットひ分子量： 25000 ± 2000
サブユニット β分子量： 28000土 2000
(d)熱安定性:水液中の酵素を 70°Cの温度で 30分加熱後に、加熱前の 35%以上の 活性を残存する。
(e) 6重量％のアクリロニトリルを基質としても、それ以下の基質濃度の時に比べ、 活性が減少しない。
）35重量％のアクリルアミド水溶液中でもアクリロニトリルを基質とした活性を有す る。
[0013] (3) 形質転換により下記の理化学的性質を有するタンパク質を生産することができ る、（1)に記載の微生物。
(a)二トリルヒドラターゼ活性を有する。
(b)基質特異性：アクリロニトリル、アジポニトリル、ァセトニトリル、イソブチロニトリノレ 、 n-バレロ二トリル、 n-ブチロニトリル、ベンゾニトリル、へキサン二トリルを基質として、 活性を示す。
(c)分子量:少なくとも下記の 2種類のサブユニットから構成されるタンパク質であつ て、各サブユニットの還元型 SDS-ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が以下の 通りである。
サブユニット α分子量： 25000 ± 2000
サブユニット β分子量： 28000 ± 2000
(d)熱安定性：水液中の酵素を 70°Cの温度で 30分加熱後に、加熱前の 35%以上の 活性を残存する。
(e) 6重量％のアクリロニトリルを基質としても、それ以下の基質濃度の時に比べ、 活性が減少しない。
）35重量％のアクリルアミド水溶液中でもアクリロニトリルを基質とした活性を有す る。
[0014] (4) ロドコッカス属に属する微生物がロドコッカス'ロドクロウス M33株（Rhodococcus r hodochrous M33)株（VKM Ac_1515Dあるいは KCCM-10635)及び Z又はその変異 体である、（1)から（3)の何れかに記載の微生物。
[0015] (5) 二トリルヒドラターゼ遺伝子により形質転換されたロドコッカス'ロドクロウス M33株
(Rhodococcus rhodochrous M33)株（VKM Ac_1515Dあるいは KCCM-10635)及び
Z又はその変異体のレ、ずれかの微生物。
[0016] (6) 下記（A)又は（B)の何れかに記載の DNAによりロドコッカス（Rhodococcus)属 に属する微生物を形質転換することを含む、（1)から（5)の何れかに記載の微生物 の製造方法。
(A)二トリルヒドラターゼのひサブユニットに対応する配列表の配列番号 1に記載のァ ミノ酸配列、又は配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数 個のアミノ酸の置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列と 、二トリルヒドラターゼの βサブユニットに対応する配列表の配列番号 2に記載のアミ ノ酸配列、又は配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数個 のアミノ酸の置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列とを 含有する DNAであって、二トリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする D
(Β)二トリルヒドラターゼのひサブユニットをコードする塩基配列に対応する配列表の 配列番号 3の 695〜1312番目の塩基配列、又は当該塩基配列に対してストリンジェ ントな条件下でハイブリダィズする塩基配列と、二トリルヒドラターゼの βサブユニット をコードする塩基配列に対応する配列表の配列番号 3の 1〜681番目の塩基配列、 又は当該塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列と を含有する DNAであって、二トリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする DNA
[0017] (7) (1)から（5)の何れかに記載の微生物を、培地において培養することを含む、 二トリルヒドラターゼまたはそれを含有する菌体処理物の製造方法。
(8) (7)に記載の製造方法により製造される、二トリルヒドラターゼまたはそれを含有 する菌体処理物。
(9) (8)に記載の二トリルヒドラターゼまたはそれを含有する菌体処理物に二トリル 化合物に作用させて、該ニトリル化合物からアミド化合物を合成することを含む、アミ ド化合物の製造方法。
[0018] 本発明の微生物を用いることにより、熱や高濃度の二トリル、アミド化合物に対して 高い安定性を示す二トリルヒドラターゼを製造することが可能になり、これを利用する ことによって二トリル化合物を対応するアミド化合物に効率良ぐ安価に変換すること が可能になる。
発明を実施するための最良の形態 [0019] 以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
先ず、本発明で発現させる二トリルヒドラターゼに関して説明する。本発明において 二トリルヒドラターゼ活性を有するとは、ァセトニトリルではァセトアミド、 n—プロピオ二 トリルでは n—プロピオアミド、アクリロニトリルではアクリルアミドのように、二トリル化合 物に水分子を付加させて、アミド化合物に変換する活性を有することを意味する。ま た、生成した化合物は液体クロマトグラフィーで分取した後、ガスクロマトグラフィー Z 質量分析（GCZMS)、赤外吸収スペクトル（IR)および核磁気共鳴スペクトル（NM R)を用いて同定することができる。
[0020] 本発明において二トリルヒドラターゼ活性を測定するに際しては、例えば、 0. 1重量 %の二トリル化合物溶液（0.05M—リン酸バッファー ρΗ7· 7) 1mlに二トリルヒドラター ゼ酵素溶液 10 μ ΐを加え、反応温度 27°Cから 60°Cにて 10から 60分間保温後、 0. 1 mlの 1規定塩酸を加えることにより反応を停止し、反応液の一部を液体クロマトグラフ ィ一にて分析し、アミド化合物の生成の有無を検定することができる。
[0021] 本発明において基質となる二トリル化合物とは、例えば、ァセトニトリル、 n—プロピ ォニトリル、 n—ブチロニトリル、イソブチロニトリル、 n—バレロ二トリル、 n—へキサン二 トリル等の脂肪族二トリル化合物、 2—クロ口プロピオ二トリル等のハロゲン原子を含む 二トリル化合物、アクリロニトリル、クロトノニトリル、メタタリロニトリル等の不飽和結合を 含む脂肪族二トリル化合物、ラタトニトリル、マンデロニトリル等のヒドロキシュトリルイ匕 合物、 2—フエニルダリシノニトリル等のアミノニトリル化合物、ベンゾニトリル、シァノビ リジン等の芳香族二トリル化合物、マロノ二トリル、スクシノニトリル、アジポニトリル等の ジニトリル化合物等およびトリ二トリルイ匕合物を挙げることができる。
[0022] 本発明における二トリルヒドラターゼの基質特異性は、上述の測定条件において、 基質を各種変更してそれぞれの基質に対し二トリルヒドラターゼ活性を有するか否か を測定することにより判断することができる。基質特異性が広ければ、製造できる対応 するアミド化合物の種類も増え、好ましいが、本酵素は少なくとも、アクリロニトリル、ァ ジポニトリル、ァセトニトリル、イソブチロニトリル、 n_バレロ二トリル、 n—ブチロニトリル 、ベンゾニトリル、へキサン二トリルを基質とすることができる。
[0023] 本発明における二トリルヒドラターゼとして、より好ましくは、配列表の配列番号 1に 示される 205個のアミノ酸配列により示されるひサブユニットおよび配列表の配列番 号 2に示される 226個のアミノ酸配列により示される 13サブユニットにより構成されるこ とが好ましい例として挙げられる。この二つのサブニット以外にも、金属や他のぺプチ ド等を含有してもよい。金属としては、特に鉄やコバルトを含有することが多い。さらに 、このサブユニットのどちらか一方を含有する蛋白質でもよレ、。また、個々のサブュニ ットのアミノ酸配列としては、他のサブュットと複合体を形成して二トリルヒドラターゼ活 性を有する限り、上記した配列表の配列番号 1又は 2に記載したアミノ酸配列におい て、 1若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失または挿入を有していてもよぐ宿主の 種類により、翻訳後に修飾を受けることも当然予想される。特に、二トリルヒドラターゼ の αサブユニットにおいてはシスティン残基が翻訳後、システインスルフィン酸または システインスルフェン酸に修飾されることが多レ、。該アミノ酸配列のうちの 1〜30個ァ ミノ酸が置換、欠失、挿入、または翻訳後修飾されているアミノ酸配歹 IJも好ましい例と して挙げられ、置換、欠失、挿入、または翻訳後修飾を受けるアミノ酸の個数は、より 好ましくは 1〜： 10個、更に好ましくは 1〜5個、最も好ましくは 1〜3個である。なお、こ のような置換、欠失、または挿入を有するアミノ酸配列を有する二トリルヒドラターゼ酵 素は、公知の部位特異的変異導入法、例えば Molecular Cloning 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)に記載の方法により、塩基配列の対応する部 位に置換、欠失、または揷入を導入せしめた DNAを用レ、、後述の通り、宿主微生物 に導入し発現させることにより得ることができ、熱安定性や有機溶媒耐性の向上や基 質特異性の変化等の産業上望ましい性質を付加した変異酵素を作出する試みも可 能である。力かる技術水準に鑑み、それらが二トリルヒドラターゼ活性を有している場 合は本発明に包含されるものとする。
本発明における二トリルヒドラターゼとしては、還元型 SDS (ソディウムードデシルー サルフヱイト）—ポリアクリルアミド電気泳動法により、分子量 25000 ± 2000と 分子 量 28000± 2000の二つのサブユニットがクマシ一ブリリアントブルーによる染色によ つて検出されるものが例示され、前者をひサブユニット、後者を /3サブユニットと呼ぶ 二トリルヒドラターゼは、活性測定に先立ち、有機酸等の安定化剤のない状態で 70 °Cで 30分間加熱処理した後も、加熱前の活性の 35%の活性を保持することができる
[0026] また、高濃度の二トリル基質は化学的に酵素を失活させることが報告されているが、 本発明における二トリルヒドラターゼは 6重量％のアクリロニトリルを基質として用いて も、そのような現象が観察されない。
[0027] さらに、高濃度の反応生成物であるアミド化合物が反応を阻害することが報告され 、高濃度な反応産物を得る際に大きな問題となるが、該ニトリルヒドラターゼは 35重 量％のアクリルアミドを活性測定溶液に加えても、基質であるアクリロニトリル濃度の 減少が有意にみられ、活性を保持する。
[0028] 上記のような理化学的性質を有する二トリルヒドラターゼは、例えば、ジォバチルス 属に属する微生物を培養することにより取得することができ、ジォバチルス属に属す る微生物としては、ジォバチルス 'カルドキシロシリティカス（Geobacillus caldoxylosilyt icus)、ジォバチルス 'カウストフイラス（Geobacillus kaustophilus)、ジォバチルス 'リツ ァニカス（Geobacillus lituanicus)、ジォバチルス'ステアロザーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus)、 ンオノヽチルス ·サブァフネウス (Geobacillus subteraneus)、シ ォバチルス'サーモカテヌラタス (Geobacillus thermocatenulatus)、ジォバチノレス'サ ーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans) ,ジォバチルス'サーモグル コシデシウス (Geobacillus thermoglucosidasius)、ジォバチノレス 'サ一モレオボランス ( Geobacillus thermoleovorans)、ン才ノヽチノレス 'トェヒ、、■ ~ (Geobacillus toebiiリ、シ才ノ チルス.ュゼネンシス（Geobacillus uzenensis)が挙げられる。また、ジォバチルス属由 来の微生物に特に限定されるものではなぐ他の微生物株由来の二トリルヒドラター ゼ遺伝子も含まれる。そのような微生物株としては、ァグロバタテリゥム (Agrobacteriu m)属、ァクロモバクター (Achromobacter)属、ァシネトパクター (Acinetobacter)属、エア ロモナス (Aeromonas)属、ェンテロバクタ一 (Enterobacter)属、ェノレウイユア (Erwinia)属 、キサントパクター (Xanthobacter)属、クレブシエラ (Klebsiella)属、コリネバタテリゥム (C orynebactenurr 属、ンノリソビゥム (smorhizobium)リ禹、、ノュ' ~トモナス (Pseudomonas) 属、ストレプトマイセス (Streptomyces)属、ノカルディア（Nocardia)属、バチルス (Bacill us)属、ミクロコッカス (Micrococcus)属、ロドコッカス (Rhodococcus)属、ロドシユードモナ ス (Rhodopseudomonas)属、リゾビゥム (Rhizobium)属、シユードノカノレディァ (Pseudono cardia)属等が挙げられる。具体的には、本発明では下記の手法でスクリーニングを 行った。まず、様々な場所で採取した土壌を少量とつて、水または生理食塩水をいれ た試験管内に入れて、 2日から 14日の間、 65°Cの振とう培養器の中で振とう培養す る。この培養液の一部を取り、汎用的な微生物生育用培地、例えばグリセロール、ポ リペプトン、酵母エキス等を主成分とした液体培地に入れ、 65°Cの培養温度にて、 1 日力ら 7日間程度の間培養する。これにより得られる培養液の一部を、前述の微生物 生育用培地成分を含む寒天平板培地に広げて 65°Cでさらに培養しコロニーを形成 させることによって、微生物を単離することができる。このようにして得られた微生物を 、前記培地成分にさらに n—バレロ二トリル等の二トリル化合物あるいはメタクリルアミ ド等のアミド化合物を加えた液体培地を入れた試験管あるいはフラスコを用い適当な 期間、例えば約 12時間から 7日程度の間、 65°Cの培養温度で振とう培養することに よって増殖させ、上記の二トリルヒドラターゼ活性測定法に基づいて、 目的の微生物 を選択する。そのような微生物の代表的菌株の同定を 16SrRNA及び下記の生化学 的性質から行った所、ジォバチルス'サーモダルコシデシウス（Geobacillus thermoglu cosidasius)であることが判明した。この菌株は、ジォバチルス.サーモダルコシデシゥ ス Q— 6 (Geobacillus thermoglucosidasius Q_6)の名称で、独立行政法人産業技術 総合研究所特許生物寄託センター (茨城県つくば巿東 1 - 1 - 1中央第 6 (郵便番号 305— 8566) )に番号 FERM P— 19351(受理曰平成 15年 5月 16曰）として寄託さ れ、 FERM BP— 08658としてブタペスト条約に基づく寄託へ移管された（受領日 平成 16年 3月 11日）。様々な特許'文献調查を行ったが、ジォバチルス'サーモダル コシデシウスに属する微生物に関して、二トリルヒドラターゼ活性を有する事に関して は何の記載もなかった。このことからジォバチルス'サーモダルコシデシウス Q— 6 株は新菌株と認められる。なお、ジォバチルス'サーモダルコシデシウス Q— 6株の 性質は下記のとおりである。
(a)形態的性質
培養条件： Nutrient Agar (Oxoid, England, UK)培地 60°C
1.細胞の形および大きさ 形：桿菌
大きさ : 0.8 X 2.0〜3.0 μ πι
2.細胞の多形性の有無：一
3.運動性の有無： +
鞭毛の着生状態:周毛
4.胞子の有無： 一
胞子の部位:端立
[0030] (b)培養的性質
培養条件： Nutrient Agar (Oxoid, England, UK)培地 60°C
1.色：クリーム色
2.光沢： +
3.色素生産：
[0031] 培養条件： Nutrient broth (Oxoid, England, UK)培地 60°C
1.表面発育の有無：
2.培地の混濁の有無： +
[0032] 培養条件:ゼラチン穿刺培養 60°C
1.生育状態： +
2.ゼラチン液化： +
[0033] 培養条件：リトマス 'ミルク 60°C
1.凝固：—
2.液化：—
[0034] (c)生理学的性質
1.グラム染色 ：不定
2.硝酸塩の還元 ： 一
2.脱窒反応： 一
3. MRテスト ：
■1. VPテスト： 一
5.インドールの生成： 6.硫化水素の生成： 一
7.デンプンの加水分解： _
8.クェン酸の利用
Koser：―
Chnstensen: ―
[0035] 9.無機窒素源の利用
硝酸塩： 一
アンモニゥム塩： +
10.色素の生成：
11.ゥレアーゼ活性：
12.ォキシダーゼ： +
13.カタラーゼ： +
14.生育の範囲
pH： 5·5〜8.0
温度：45°C〜72°C
15.酸素に対する態度：通性嫌気性
16. O Fテスト ： —/—
[0036] (d)糖類からの酸産生/ガス産生
1. L—ァラビノース —/—
2. D—キシロース +/_
3. D—グノレコース +/_
4. D—マンノース +/_
5. D—フノレクトース +Z—
6. D—ガラクトース —/—
7.マルトース +Z—
8.サークロース +/_
9.ラタトース _/_
10.トレノヽロース +/- 11. D ソルビトーノレ 一 /—
12. D—マンニトーノレ + / _
13.イノシトール —/—
14.グリセリン _Z_
[0037] (e)その他の'性質
1. j3 _ガラクトシターゼ活性：一
2.アルギニンジヒドロラーゼ活性：一
3.リジンデカルボキシラーゼ活性：
4.トリブトファンデァミナーゼ活性：—
5.ゼラチナーゼ活性： +
[0038] 本発明における二トリルヒドラターゼのアミノ酸配列情報を取得するためには、該酵 素を微生物より精製後、還元型 SDS ポリアクリルアミド電気泳動により各サブュニッ トを分離後、ゲルより各バンドを切り出し、タンパク質シークェンサ一によりアミノ酸配 列の一部を決定することができる。
[0039] 具体的には、配列表の配列番号 3の塩基配列の 695— 1312位を含む DNAと配列 表の配列番号 3の塩基配列の 1 681位を含む DNAが例示され、各々が αサブュニ ットと ;3サブユニットをコードする力 これに限定されるものではなぐこの塩基配列を 含む DNAであればょレ、。またこれらの配列と相補的な塩基配列からなる DNAに対 して、ストリンジヱントな条件下にてハイブリダィズすることができる DNAであっても、 二トリルヒドラターゼ活性を有する限り、本発明に包含される。すなわち、これらの DN Αを用いて本発明の二トリルヒドラターゼを発現することができる。ストリンジヱントな条 件卜としては、 f列 は ECL direct nucleic acid labeling and detection systerru,マシ ャムフアルマシアバイオテク社製）を用いて、マニュアル記載の条件（wash : 42°C、 0 . 5xSSCを含む primary wash buffer)が例示される。ストリンジェントな条件下にてハ イブリダィズすることができる DNAとしては、例えば、前述のストリンジヱントな条件下 、配列表の配列番号 3の塩基配列の 695— 1312位を含む DNAとまたは配列表の配 列番号 3の塩基配列の 1— 681位を含む DNAにおける相補的な塩基配列の任意の 、通常は少なくとも 20個、好ましくは少なくとも 50個、特に好ましくは少なくとも 100個 の連続した塩基配列を検出試料として、これにハイブリダィズする DNAが例示される
[0040] 本発明に用いる二トリルヒドラターゼをコードする DNAは、以下の方法によって得る ことができる。本明細書において、特に記載がない限り当該分野で公知である遺伝 子組換え技術、組み換えタンパク質の生産技術、分析法が採用される。
[0041] 本発明に用いる二トリルヒドラターゼをコードする DNAは、本願明細書において開 示される塩基配列、またはアミノ酸配歹 lj、場合によれば前記した精製酵素から決定し たアミノ酸配列等の配列情報にしたがって、本発明の二トリルヒドラターゼを含有する 微生物、例えば ·サーモダルコシデシウス Q— 6株から取得することができる。アミノ酸 配列にしたがって合成されたオリゴヌクレオチドをプローブとして用い、二トリルヒドラタ ーゼを含有する微生物の染色体 DNAを制限酵素により消化した DNA断片をファー ジゃプラスミドに導入し、宿主を形質転換して得られるライブラリーから、プラークハイ ブリダィゼーシヨンやコロニーハイブリダィゼーシヨンなどにより本発明の二トリルヒドラ ターゼをコードする DNAを得ることもできる。また、オリゴヌクレオチドをプローブとせ ず、前記した精製酵素から決定した両サブユニットの N末端のアミノ酸配列情報等に したがってプライマーを作製し、二トリルヒドラターゼ遺伝子の一部を PCR反応により 増幅したものをプローブとして、同様の過程を行うこともできる。得られた DNAは、プ ラスミドベクター、たとえば pUC118に揷入しクローニングし、ジデォキシ 'ターミネータ 一法 (Proceedings of the National Academy of Sciences. USA, 74: 5463 - 5467， 1977) 等の周知の方法により塩基配列の決定を行うことができる。このようにして調製された 遺伝子は、該遺伝子を用いて形質転換した大腸菌宿主中の発現産物を前記記載の 活性測定法を用いることにより、二トリルヒドラターゼをコードする DNAであることを確 看忍することができる。
[0042] このような性質を持つ二トリルヒドラターゼをコードする DNAを用いて、工業生産に 適した微生物を形質転換する。より生産に適した工業微生物としてはロドコッカス（Rh odococcus)属に属する微生物が好ましレ、。形質転換には上記の DNAがベクターに 連結されていることを特徴とする組換えベクターを用いる。
[0043] 本発明に用いる組換えベクターとしては、宿主微生物に適したプロモーター領域の 下流に、上記方法で得られた DNAの 5'末端側が機能し得るように連結して、必要に 応じてその下流に転写終結配列を揷入し、適切な発現用ベクターに組み込み調製 すること力 Sできる。
[0044] 適切な発現ベクターとしては、宿主微生物内で複製可能であれば、特に限定され なレ、。ベクターとしては、 pK4、 pRF30、 pBS305、 pRE _ 7など、通常ロドコッカスで使 用されるベクターの中から選択できる。発現ベクターに用いるプロモータとしてはニト リラーゼ遺伝子、二トリルヒドラターゼ遺伝子等の高レ、発現量を期待できるプロモータ 一が望ましいが、これに限定されない。また、染色体に遺伝子挿入が可能な宿主で あれば、該宿主における自律複製可能な領域を有する必要はない。また、 αサブュ ニット遺伝子及び βサブユニット遺伝子が各々のプロモーターより独立のシストロンと して発現されてもよいし、共通のプロモーターによりポリシストロンとして発現されても よレ、。さらには、独立のシストロンの場合、各々のサブユニット遺伝子が別のベクター 上にあってもよい。この場合には、 αサブユニット遺伝子を含む第一の発現ベクター と βサブユニット遺伝子を含む第二の発現ベクターの 2種類の発現ベクターを用いて 宿主の形質転換を行うことになる。さらに上記の組換えベクターに、必要に応じてニト リルヒドラターゼの活性化に必要なアミノ酸配列（特許第 3408737号、及び Journal of Biochemistry 125 : 696— 704 ( 1999) )を発現する DNAを共存させる場合もある。具 体的には、上記と同様に発現に必要なプロモーターや転写終結因子等を含むプラス ミドベクターを用レ、、二トリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質をコードする 遺伝子、二トリルヒドラターゼの aサブユニット遺伝子及び βサブユニット遺伝子が各 々独立のシストロンとして発現されていてもよいし、共通の制御領域によりポリシスト口 ンとして発現されていてもよレ、。同様に、各々の遺伝子が別のベクター上にあっても よい。
[0045] 上記方法にて作成した発現ベクターを用い、宿主微生物を形質転換することにより 、 目的の二トリルヒドラターゼ発現させることができる。宿主微生物への遺伝子の導入 法としては、たとえば、形質転換、形質導入、接合伝達、またはエレクト口ポレーシヨン などの当技術分野で周知の任意の常法によって、好ましい宿主に導入することがで きる。 [0046] さらに、二トリルヒドラターゼまたはそれを含有する菌体処理物の製造方法としては、 前述の通り、該ニトリルヒドラターゼを生産し得る形質転換された微生物、即ち、ロドコ ッカス属の微生物、特に好ましくは、ロドコッカス'ロドクロウス M33 (Rhodococcus rhod ochrous M33)株（VKM Ac_1515Dあるいは KCCM-10635)を培養により増殖させ、そ の培養物中より二トリルヒドラターゼまたはそれを含有する菌体処理物を取得すること ができる。
[0047] 本発明の形質転換体は、これらの微生物が資化可能な栄養源を含む培地で培養 することが好ましぐ例えば、酵素や抗生物質などを生産する通常の方法で培養する ことができる。培養は、通常、液体培養でも固体培養でもよい。例えば、グノレコース、 シユークロース等の炭水化物；ソルビトール、グリセロール等のアルコール；クェン酸、 酢酸等の有機酸；大豆油等の炭素源またはこれらの混合物；酵母エキス、肉エキス、 硫安、アンモニア等の含窒素無機有機窒素源；リン酸塩、マグネシウム、鉄、コノくノレト 、マンガン、カリウム等の無機栄養源；およびビォチン、チアミン等のビタミン類を適宜 混合した培地が用いられる。より好ましくはそのような培地成分に Feイオンあるいは C oイオンを 0. 1 μ g/ml以上存在させるとよい。培養条件は、通常、好気条件下で行 うことが好ましい。培養温度は、宿主微生物が生育し得る温度であれば特に制限は ないが、通常、 5°C〜80°C、好ましくは 20〜70°C、さらに好ましくは約 37°Cで行うこと が例示される。また、培養途中の pHは宿主微生物が生育し得る pHであれば特に制 限はないが、通常、 pH3〜9、好ましくは pH5〜8、さらに好ましくは pH6〜7で行うこ とが例示される。
[0048] 本発明においては、宿主微生物としてロドコッカス（Rhodococcus)属に属する微生 物を使用する。宿主微生物として使用するロドコッカス（Rhodococcus)属に属する微 生物の種類は特に限定されず、例えば、ロドコッカス'ロドクロウス（Rhodococcus rhod ochrous) 、ロド ッカス-ノレ一ノ ー (Rhodococcus ruber)、ロド; πッカス-エリス口ポリス ( Rhodococcus erythropolis)、ロトコッカス'ノレフロへノレテンクタス (Rhodococcus rubrop ertinctus)などを挙げることができる。
[0049] ロドコッカス'ロドクロウス M33 (Rhodococcus rhodochrous M33)株（VKM Ac-1515 Dあるいは VKPM S-1268)を使用することが特に好ましレ、。宿主微生物としてロドコッ カス.ロドクロウス M33株（Rhodococcus rhodochrous M33)株（VKM Ac_1515Dあるレ、 は VKPM S-1268)が特に好ましい理由としてはロドコッカス属全般の特徴として細胞 壁が厚ぐ上記のアミド化合物の製造において、培養で得た菌体をそのままに二トリ ル化合物と反応させることにより、同菌の持つ二トリルヒドラターゼの作用で 46% (重量 Z液量）のアクリルアミドの蓄積が報告されている（米国特許第 5,827,699号)。さらに 、ロドコッカス'ロドクロウス J1株をはじめ、通常の微生物は、酵母エキス、肉エキス、ビ タミンといった高価な栄養素を含む培地を十分な生育に必要とするのに対しロドコッ カス'ロドクロウス M33株は簡単で安価な合成培地で培養できるという大きな利点を有 している。なお、便宜上、本特許では Institute of Biochemistry and Physiology of Mic roorganisms of The Russian Academy of Science (IBFM)に寄託 S寺 (1993年 12月 6日 )のロドコッカス 'ロドクロウスとレ、う名称を M33株に用いてレ、るが、 DNA-DANハイブリ ダイゼーシヨン（日本細菌学会誌 55(3) 545-584、 2000)の結果、本株はロドコッカス 'ロドクロウス種でなく、ロドコッカス'ノレーバー種に近い新種である可能性が高レ、。本 株は、韓国微生物培養所（Korean Culture Center of Microorganisms) (大韓民国 12 0-091ソウルスダェムンホンジェ 1ュリムビル 361-221) (361-221， Yurim Bldg. , Ho ngje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul 120-09丄， Republic of Korea)に受乇番 i^KCし M— 10635 (受領日： 2004年 12月 10日）としてブタペスト条約に基づき寄託された
[0050] 本発明では、ロドコッカス'ロドクロウス M33株（Rhodococcus rhodochrous M33)株（ VKM Ac_1515D、 VKPM S-1268あるいは KCCM-10635)の変異体を宿主微生物とし て使用することもできる。変異体としては、二トリルヒドラターゼ遺伝子による形質転換 を行った場合に、導入された二トリルヒドラターゼ遺伝子を発現して、二トリルヒドラタ 一ゼを産生することができる限り、上記ロドコッカス'ロドクロウス M33株から誘導される 任意の変異体を使用することができる。具体的には、 自然変異、あるいは化学的変 異剤又は紫外線等による人工変異を受けた変異体などが挙げられる。
[0051] また、本発明では、本発明の形質転換体を、培地において培養することによって製 造される二トリルヒドラターゼまたはそれを含有する菌体処理物を、二トリル化合物に 作用させ、該ニトリル化合物からアミド化合物を合成することができる。この場合、前 述の酵素を用レ、るに際しては、当該酵素の作用を阻害しないかぎり、特別に精製程 度等は限定されず、精製された本発明の酵素の他、その酵素含有物が用レ、られ、さ らには、その酵素を生産する微生物やその酵素の遺伝子を導入して形質転換された 形質転換体等を使用してもよい。微生物や形質転換体等を使用する場合には、菌体 を利用してもよく、菌体としては、生菌体、もしくはアセトンやトルエン等の溶媒処理ま たは凍結乾燥等の処理を施して、化合物の透過性を増した菌体を使用することがで きる。場合によっては、菌体破砕物ゃ菌体抽出物等の酵素含有物となっていてもよ い。該酵素を含有する菌体処理物の作成方法を例示すれば、まず培養物を固液分 離し、得られる湿菌体を必要に応じてリン酸緩衝液ゃトリス塩酸緩衝液などの緩衝液 に懸濁せしめ、次いで超音波処理、フレンチプレス処理やガラスビーズを用いる粉砕 処理、あるいはリゾチームやプロテアーゼ等の細胞壁溶解酵素による処理などの菌 体破砕処理を適宜組み合わせて、菌体内から該酵素を抽出し、粗製の二トリルヒドラ ターゼ含有液を得ることができる。この粗製の酵素含有液を、必要により、公知のタン パク質、酵素などの単離、精製手段を用いることにより、さらに精製することができる。 例えば、粗製の酵素含有液に、アセトン、エタノールなどの有機溶媒を加えて分別沈 殿せしめる力、硫安などを加えて塩析せしめるかして、水溶液から二トリルヒドラター ゼを含有する区分を沈殿せしめ回収する方法が例示される。またさらに、陰イオン交 換、陽イオン交換、ゲル濾過、抗体ゃキレートを用いたァフィ二ティーク口マトグラフィ 一などを適宜組み合わせて精製することができる。勿論、酵素ゃ菌体、酵素を含有 する菌体処理物等は、公知の方法により、カラムにおいて充填されていてもよぐ担 体に固定化されていてもよ 特に菌体の場合はポリアクリルアミドゲル等の高分子 中に抱坦されていてもよい。菌体または菌体処理物を水またはリン酸緩衝液等の緩 衝液等の水性水溶液に懸濁し、これに二トリル化合物を加えることにより、反応を進 行させる。使用する菌体もしくは菌体処理物の濃度は、 0.01重量％〜20重量％、好 ましくは、 0.1重量％〜10重量％でぁる。反応温度の上限は、好ましくは 90°C、さら に好ましくは 85°C、一層好ましくは 70°Cを、反応温度の下限は、例えば 1°C、好まし くは 4°C、さらに好ましくは 10°Cを、反応 pHは、例えば、 5-10,好ましくは、 6〜8を 、反応時間は、例えば、 10分間〜 72時間を挙げることができる。また、二トリル化合 物を徐々に滴下することによって、アミド化合物を高濃度に生成蓄積させることもでき る。反応液からのアミド化合物を回収するには、菌体ゃ菌体処理物等をろ過や遠心 分離等で取り除いた後、晶析などの手法で取り出す方法等がある。
実施例
[0052] 以下に、実施例をあげて本発明を詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の 範囲を限定するものではない。
[0053] 実施例 1 :菌体分離
埼玉県の温泉近傍で採取した土壌を少量 (約 lg)とって、生理食塩水を 5ml入れた 試験管内に入れて、 3日間、 65°Cの振とう培養器の中で振とう培養した。この培養液 の一部（0. 5ml)を取り、グルコース 1.0重量％、ポリペプトン 0.5重量0/。、イーストェ キストラタト 0.3重量％からなる培地 (pH7.0)に加え、 2日間 65°Cで往復振とう培養し た。これにより得られる培養液の一部（0.1ml)を、前述の培地成分を含む寒天平板 培地に広げて 65°Cでさらに 2日間培養しコロニーを形成させることによって、微生物 を単離した。単離した微生物を、上記と同組成の培地に 0.1重量％の11 _バレロニトリ ルを添カ卩した液体培地に接種した後、 65°Cで 24時間培養することにより、二トリル資 化性の高い微生物を有する培養液を得た。この培養液 lmlを 9mlの 1.1重量％のァク リロ二トリル溶液（0.05M—リン酸バッファー pH7. 7)に加えて、反応温度 27°Cにて 反応を開始した。 10分後、 lmlの 1規定塩酸をカ卩えることにより反応を停止した。反応 液の一部を液体クロマトグラフィー（HPLC)にて分析し、アクリルアミド生成の有無を 検定することによって、二トリルヒドラターゼ活性を有する微生物をスクリーニングした 。このようにして二トリルイ匕合物をアミド化合物に変換させる水和活性を有する微生物 としてジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株を得た。
[0054] (液体クロマトグラフィー分析条件）
本体： HITACHI D-7000(日立社製）
カラム；Inertsil ODS-3 (GLサイエンス社製）
長さ； 200mm
カラム温度；35°C
流量； lml/ min サンプル注入量；10 μ 1
溶液： 0. lwt。/。リン酸水溶液
[0055] 実施例 2 :ジォバチルス'サーモダルコシデシウス Q— 6株菌体中の二トリルヒドラター ゼ活性の測定とその温度依存性
グリセロール 0.2重量％、クェン酸 3ナトリウム 2水和物 0.2重量％、リン酸 2水素カリ ゥム 0.1重量％、リン酸水素 2カリウム 0.1重量％、ポリペプトン 0.1重量％、 酵母ェキ ス 0.1重量0/。、塩化ナトリウム 0.1重量％、 n—バレロ二トリル 0.1重量％、硫酸マグネ シゥム 7水和物 0.02重量％、硫酸鉄（Π) 7水和物 0.003重量％、塩化コバルト 6水和 物 0. 0002%を含む滅菌済培地（pH7.0) 100mlを 500ml三角フラスコに入れたもの にあらかじめ同培地で培養したジォバチルス'サーモダルコシデシウス Q— 6株の培 養液 lmlを植菌した。これを 65°Cで 1日間、 200stroke/minで回転振とう培養し、菌体 培養液を得た。このジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株の菌体培養液 30 Ondから遠心分離 (lOOOO X g, 15分）によって菌体を集め、 0.05Mリン酸緩衝液（p H7.5)にて洗浄後、同緩衝液 50mlに懸濁した。こうして調製した菌体懸濁液につい て、表 1に揚げた反応温度で二トリル化合物をアミド化合物に変換させる水和活性を 測定した。酵素活性の単位（ユニット）を、 1分間に Ι μ πιοΐのアクリロニトリルをアタリ ルアミドに変換する活性を 1ユニット（以下、 Uと記す）と定めると、 27°Cにおける湿菌 体重量当たりの二トリルヒドラターゼ活性（UZmg)は 9. 37UZmgであった。さらに 1 0°Cにおいて、 5UZmlになるように 0.5重量％のアクリロニトリルを含む菌体懸濁液 を調整し、この菌体懸濁液を用いて、 30°C、 40°C、 50°C、 60°C、 70°Cの条件で同 様に二トリルヒドラターゼ活性を求め、表 1に示した。その結果、菌体を反応に用いた 時の至適温度は 60°C近傍にあり、高温域において特に高い活性を示した。
[0056] [表 1] 表 1
Figure imgf000023_0001
[0057] 実施例 3：ジォバチルス'サーモダルコシデシウス Q— 6株菌体中の二トリルヒドラター ゼの熱安定性
ジォバチルス'サーモダルコシデシウス Q— 6株の菌体中にある二トリルヒドラターゼ の活性の熱安定性を調べるために、実施例 2の培養法で得た菌体を 10U/mlとなる ように蒸留水に懸濁し、 30分、所定温度での保温処理を行い、残存活性を測定した 。 0. 5mLの 1重量％アクリロニトリル溶液 (0. 05Mリン酸カリウム緩衝液、 ρΗ7· 5)に 0 . 5mlの保温処理後の菌体液をカ卩えて、 27°Cにて攪拌しながら反応を開始した。 5 分後、 100 /i Lの 1規定塩酸をカ卩えることにより反応を停止した。保存処理前の活性 に対する保存処理後の活性を算出し、保存処理前の活性を基準 (100)とした換算値 として表 2に示す。この結果より、ジォバチルス'サーモダルコシデシウス Q_ 6株の菌 体中の二トリルヒドラターゼの酵素活性は、高温下においても安定に保持されるとレ、 え、 70°Cという高温下においても 80%以上の活性を保持することができ、 80°Cの高 温下においても 30%以上の活性を保持することができる。
[0058] [表 2]
表 2 ：
処理温度 (°c) 活性（UZml) 残存活性 (%)
30 5 100
40 4.8 96
50 4.5 90
60 4.4 88
70 4.2 84
80 1.6 32 [0059] 実施例 4 :各種二トリル化合物に対する反応
下記表 3に記載している各種二トリル化合物を対応するアミド化合物に変換させる 二トリルヒドラターゼ活性について調べた。 9mLの 1.1%二トリル溶液 (0.05Mリン酸カリ ゥム緩衝液、 PH7.5)に ImLの菌体懸濁液を加えて、反応温度 30°Cにて反応を開始 した。 10分後、 ImLの 1規定塩酸をカ卩えることにより反応を停止した。その結果、すべ て二トリルヒドラターゼ活性を有してレヽた。
[0060] [表 3]
表 3 ： 供試二トリル化合物
アジポニトリル n -ブチロニトリル
ァセトニトリル へキサン二トリル
イソプチロニトリル ベンゾニトリル
n-バレロ二トリル
[0061] 実施例 5以降に記載のジォバチルス.サーモダルコシデシウス Q— 6株由来の二トリ ルヒドラターゼ αサブユニット（ORF2)、 βサブユニット（ORF1)及び二トリルヒドラタ ーゼ活性化因子（ORF3)のアミノ酸配列及び塩基配列を解明するに至った本発明 の流れを以下に要約した。
[0062] ジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q - 6株を培養して得られた菌体を破砕後、 硫安沈殿、陰イオン交換カラム口マトグラフィー、 DEAEカラム、ハイドロキシアパタイト カラムに供し、ゲルろ過クロマトグラフィー、透析を行い、二トリルヒドラターゼ酵素を精 製した。
[0063] 精製した二トリルヒドラターゼのひサブユニット及び βサブユニットの Ν末約 30残基 のアミノ酸配列を決定し、該菌の属に基づくアミノ酸のコドン使用を考慮して遺伝子 増幅用オリゴヌクレオチド縮重プライマーを作製し、該菌体から抽出した染色体 DNA を铸型として縮重 PCRを行い、増幅 DNA断片を取得した。増幅された DNA断片をクロ 一二ングし、挿入断片の塩基配列を決定した。該塩基配列より推定されるアミノ酸配 列と、ジォバチルス'サーモダルコシデシウス Q— 6株より精製した二トリルヒドラターゼ αサブユニット及び サブユニットの Ν末端アミノ酸配列を比較し、クローニングされ た配列が二トリルヒドラターゼをコードしていることを確認した。
[0064] その結果、ジォバチルス.サーモダルコシデシウス Q _ 6株において、 5 '末端側上 流より二トリルヒドラターゼ遺伝子は βサブユニット、 αサブユニットの順に隣接して存 在することが明らかになった。
[0065] 公知の様々な二トリルヒドラターゼひサブユニットの下流遺伝子における相同性の 高い配列から、遺伝子増幅用オリゴヌクレオチド縮重プライマーを作製し、該菌体か ら抽出した染色体 DNAを鎳型として縮重 PCRを行レ、、増幅 DNA断片を取得した。得 られた該菌の αサブユニット部分の増幅 DNA断片をクローニングし塩基配列を決定 した。
[0066] 以上より取得されたジォバチルス'サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒドラ ターゼ αサブユニット及び βサブユニットを適当な発現ベクターに導入した。構築し た発現プラスミドを用いて、適当な宿主菌を形質転換した。宿主の例としては、ロドコ ッカス属、コリネ属、大腸菌などが挙げられる。好ましくはアミダーゼを有していない宿 主が良い。更に、得られた形質転換体を培養して得た菌体とアクリロニトリルを水性媒 体中で接触させることによりアクリルアミドが生成することを確認し、その生成効率及 び二トリルヒドラターゼ活性を比較した。
[0067] 次に、上記より得られた DNA断片をプローブとして、コロニーハイブリダィゼーシヨン を行い、ジォバチルス'サーモダルコシデシウス Q6株の二トリルヒドラターゼひサブュ ニット及び βサブユニットの下流遺伝子を含む周辺遺伝子をクローユングした。
[0068] 下流遺伝子を二トリルヒドラターゼひサブユニット及び βサブユニットと共発現させ、 二トリルヒドラターゼ活性を比較した。その結果、下流遺伝子が二トリルヒドラターゼ活 性を顕著に上昇させる活性化に関与する遺伝子であることを見出した。
[0069] 実施例 5 :精製酵素の理化学的性質
〔工程 1〕二トリルヒドラターゼ酵素の精製
ジォバチルス'サーモダルコシデシウス Q— 6株を培養し、種々のカラムに供するこ とで二トリルヒドラターゼ活性画分を精製した。
クロマトグラフィーにおける二トリルヒドラターゼ活性画分の測定方法は以下のように 行った。 HEPESバッファー（100mM、 pH7. 2)により希釈した各画分の溶出液に 1 重量％のアクリロニトリルを添加して 27°Cで 1分間反応させた。 IN HC1を 10液量％ 反応液に添加することにより反応を停止させ、生成したアクリルアミド濃度を上述の H PLC分析法により測定した。
ジォバチルス.サーモダルコシデシウス Q _ 6株由来二トリルヒドラターゼ酵素を精 製するために、まず 0. 1重量0 /0の n—バレロ二トリルを含有する V/F培地（グリセロー ル 0.2重量％、クェン酸 3ナトリウム 2水和物 0.2重量％、リン酸 2水素カリウム 0.1重量 %、リン酸水素 2カリウム 0.1重量％、ポリペプトン 0.1重量％、酵母エキス 0.1重量％ 、塩化ナトリウム 0.1重量％、 n—バレロ二トリル 0.1重量％、硫酸マグネシウム 7水和 物 0.02重量％、硫酸鉄（11) 7水和物 0.003重量％、塩化コバルト 6水和物 0. 0002 重量％)にジォバチルス.サーモダルコシデシウス Q— 6株を植菌し、 65°Cで 24時 間培養した。培養には、 96穴 2mlの深底プレート（COSTAR社）を用いた。培養終 了後、 8000g、 10分間の遠心分離により集菌し、得られた湿菌体 3gを 20mLの HE PESバッファー（100mM、 pH7. 2)に再懸濁した。菌体を冷却下で超音波破碎機 を用いて破砕し、菌体破砕液に硫酸アンモニゥム（30重量％飽和濃度）をカ卩えて 4°C で 30分間緩やかに攪拌し、 20000g、 10分間の遠心分離を行レ、、上清を得た。遠心 上清液に硫酸アンモニゥム（70重量％飽和濃度)加え 4°Cで 30分間緩やかに攪拌し た後、 20000g、 10分間の遠心分離により得られた沈殿物を 9mlの HEPESバッファ 一（100mM、 pH7. 2)に再溶解し、 1Lの同液中において 4°Cで 24時間透析し、陰 イオン交換クロマトグラフィー（アマシャムバイオサイェンセス社； HiTrap DEAE F F (カラム体積 5mL X 5本））に供した。展開液は HEPESバッファー（100mM、 pH7 . 2)を用レ、、塩化カリウム濃度を 0. 0Mから 0. 5Mまで直線的に増加させることにより 分画を溶出し、二トリルヒドラターゼ活性を含む画分を得た。その画分をアパタイトカラ ムクロマトグラフィー（BIO— RAD社製； CHT2_I (カラム体積 2mL) )に供した。 0. 01Mリン酸カリウム水溶 f夜（pH7. 2)を展開 f夜とし、リン酸カリウムを 0. 01M力ら 0. 3 Mまで直線的に増加させることにより分画を溶出し、二トリルヒドラターゼ活性を含む 画分を得た。その画分を 0. 15M NaClを含む 0. 05Mリン酸ナトリウム水溶液（pH 7. 2)を展開液としたゲルろ過クロマトグラフィー（アマシャムバイオサイェンセス社； S uperdex 200 HR 10/30)に供し、二トリルヒドラターゼ活性画分を取得した。こ うして得られたゲルろ過クロマトグラフィーの二トリルヒドラターゼ活性画分を用いて以 下の実施例を行った。
[0071] 〔工程 2〕 精製した二トリルヒドラターゼの反応温度依存性
ジォバチルス.サーモダルコシデシウス Q _ 6株由来の二トリルヒドラターゼ活性画 分溶液（3. 2mgZmL、 0.05Mリン酸緩衝液（pH7. 5) )について、表 4に示した反 応温度で二トリル化合物をアミド化合物に変換させる二トリルヒドラターゼ活性を測定 した。 lmLの 0. 5重量0 /。アクリロニトリル溶液 (0. 05Mリン酸カリウム緩衝液、 pH7. 5) に二トリルヒドラターゼ活性画分溶液を加えて、各温度にて攪拌しながら反応を開始 した。 2分後、 100 / Lの 1N塩酸をカ卩えることにより反応を停止した。酵素活性の単位 (ユニット）は、 1分間に 1 μ molのアクリロニトリルをアクリルアミドに変換する活性を 1ュ ニット（以下、 Uと記す）と定めて、酵素重量当たりの水和活性 (U/mg)を表 4に示し た。この結果より、ジォバチルス'サーモダルコシデシウス Q— 6株より精製した二トリ ルヒドラターゼ活性画分における二トリルヒドラターゼの活性は 60°Cという高温まで、 反応温度の上昇に伴い上昇している。最適温度は菌体を反応に用いた時と同様に 6 0°C近傍にあると考えられ、 70度という高温下においても大変高い二トリルヒドラター ゼ活性を示している。
[0072] [表 4コ
表 4 ：
Figure imgf000027_0001
[0073] 〔工程 3〕精製した二トリルヒドラターゼの熱安定性
ジォバチルス'サーモダルコシデシウス Q _ 6株より精製した二トリルヒドラターゼの 活性の熱安定性を調べるために、二トリルヒドラターゼ活性画分溶液（3. 2mg/ml、 0.05Mリン酸緩衝液 (PH7. 5) )を 30分、所定温度での保温処理を行い、残存活性 を測定した。 lmLの 0. 5重量0 /0アクリロニトリル溶液 (0. 05Mリン酸カリウム緩衝液、 p H7. 5)に保温処理後の二トリルヒドラターゼ溶液を 5 μ ΐ加えて、 27°Cにて攪拌しなが ら反応を開始した。 2分後、 100 z Lの 1規定塩酸をカ卩えることにより反応を停止した。 保存処理前の活性に対する保存処理後の活性 (残存活性)を算出し、保存処理前の 活性を基準 (100)とした換算値として表 5に示す。この結果より、ジォバチルス'サー モダルコシデシウス Q— 6株より精製した二トリルヒドラターゼ活性画分における水溶 液中の二トリルヒドラターゼの酵素活性は、高温下においても安定に保持されるとレ、 え、 60°Cという高温下においても 60%以上の活性を保持することができ、 70°Cの高 温下においても 35%以上の活性を保持することができる。
[表 5]
表 5 ：
Figure imgf000028_0001
〔工程 4〕精製した二トリルヒドラターゼのアクリロニトリル濃度依存性と濃度耐性 ジォバチルス'サーモダルコシデシウス Q— 6株より精製した二トリルヒドラターゼに 関して、基質であるアクリロニトリル濃度への依存性と耐性を調べるために、 4 μ 1の二 トリルヒドラターゼ活性画分溶液（3· 2mg/mL、 0.05Mリン酸緩衝液（ρΗ7· 5) )を 各種重量％のアクリロニトリルを含む 5ml溶液 (0. 05Mリン酸カリウム緩衝液、 pH7. 5 )に加えて、 27°Cにて攪拌しながら反応を開始した。 5分、 10分、 20分、 40分後に 1 mlを取り出し、 100 / Lの 1規定塩酸を加えることにより反応を停止し、生成したアタリ ルアミドの濃度を HPLCにより定量し、表 6に示した。この結果より、ジォバチルス'サ ーモダルコシデシウス Q— 6株より精製した二トリルヒドラターゼ活性画分における水 溶液中の二トリルヒドラターゼの酵素活性は、高いアクリロニトリル濃度においても安 定に保持される。 6%という高濃度のアクリロニトリル溶液中において 40分反応させて も、より低いアクリロニトリル濃度の場合に比べての活性の低下は観察されず、逆に基 質濃度の上昇に伴って活性は上昇した。
[0076] [表 6コ
表 6 ：
Figure imgf000029_0001
[0077] 〔工程 5〕ジォバチルス.サーモダルコシデシウス Q _ 6株より精製した二トリルヒドラタ ーゼのアクリルアミド濃度耐性
ジォバチルス'サーモダルコシデシウス Q— 6株より精製した二トリルヒドラターゼに 関して、生成物であるアクリルアミドの阻害を調べるために、 10 μ ΐの二トリルヒドラター ゼ活性画分溶液（3. 2mg/mL、 0.05Mリン酸緩衝液（pH7. 5) )を0. 5重量％ァク リロ二トリルと 35重量0 /0アクリルアミドを含む溶液 (0. 05Mリン酸カリウム緩衝液、 pH7 . 5)lmlに対してカ卩えて、 27°Cにて攪拌しながら 10分間反応を行レ、、反応後の液中 のアクリロニトリル濃度を HPLCで定量したところ、すべてのアクリロニトリルがアタリノレ アミドに変換されていた。この結果より、ジォバチルス'サーモダルコシデシウス Q— 6 株より精製した二トリルヒドラターゼ活性画分における水溶液中の二トリルヒドラターゼ の酵素活性は、 35%という高いアクリルアミド濃度においても活性が保持されるとレ、 える。
[0078] 実施例 6：ジォバチルス'サーモダルコシデシウス Q— 6株由来の二トリルヒドラターゼ
βサブユニット、 αサブユニットおよび ORF3部分の遺伝子のクローニング
〔工程 1〕ジォバチルス'サーモダルコシデシウス Q— 6株由来の二トリルヒドラターゼ 酵素の確認及び N末アミノ酸配列決定 実施例 5により得られたゲルろ過クロマトグラフィーでの二トリルヒドラターゼ活性画 分溶出液を還元条件下において還元型 SDS _ポリアクリルアミド電気泳動に供した 。泳動後、クマシ一ブリリアントブルー（CBB)による蛋白質染色を行レ、、脱色した結 果、約 25Kダルトン及び約 28Kダルトンの分子量を有する 2本の主要なバンドが確 認された。この 2本の主要な精製蛋白質を、ブロッテイング装置（BIO— RAD社）を用 いて PVDF膜（MILLIPORE社製）に転写し、 CBB染色し、 目的の 2本のバンドが吸 着している部分を PVDF膜力 切り出した。次に、全自動タンパク質一次構造分析装 置 PPSQ-23A (島津製作所)を用いて 2種類の蛋白質の N末端アミノ酸配列を解読し た。その結果、分子量 25Kダルトンの蛋白質の N末アミノ酸配列は、配列表の配列 番号 23に記載のアミノ酸配列であり、分子量 28Kダルトンの蛋白質の N末アミノ酸配 列は、配列表の配列番号 24に記載のアミノ酸配列であった。
[0079] 既知の二トリルヒドラターゼ酵素のアミノ酸配列と比較した結果、 25Kダルトンのポリ ペプチド鎖が二トリルヒドラターゼ αサブユニット、 28Κダルトンのポリペプチド鎖が二 トリルヒドラターゼ サブユニットと低いながらもホモロジ一を示し、該蛋白質をコード することが示唆された。
[0080] 〔工程 2〕 Ν末端アミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドプライマーの合成
上記で解読した 2種類の蛋白質の Ν末端のアミノ酸配列から、該菌属のコドン使用 に基づいて縮重 PCR用オリゴヌクレオチドプライマーを以下の 12種類合成した。配 列表の配列番号 5に記載のプライマー 1 (ひ F1)、配列表の配列番号 6に記載のプラ イマ一 2 (ひ F2)、配列表の配列番号 7に記載のプライマー 3 (ひ F3)、配列表の配列 番号 8に記載のプライマー 4 (ひ R1)、配列表の配列番号 9に記載のプライマー 5 ( a R2)、配列表の配列番号 10に記載のプライマー 6 (ひ R3)、配列表の配列番号 1 1に 記載のプライマー 7 ( j3 F1)、配列表の配列番号 12に記載のプライマー 8 ( j3 F2)、 配列表の配列番号 13に記載のプライマー 9 ( j3 F3)、配列表の配列番号 14に記載 のプライマー 10 ( j3 Rl)、配列表の配列番号 15に記載のプライマー 11 ( j3 R2)、酉己 列表の配列番号 16に記載のプライマー 12 ( j3 R3)である。尚、 yは cまたは tを表し、 r は aまたは gを表し、 mは aまたは cを表し、 kは gまたは tを表し、 sは cまたは gを表し、 w は aまたは tを表し、 dは a、 gまたは tを表し、 nは、 a、 c、 gまたは tを表している。 αサブ ユニット及び /3サブユニットをコードする遺伝子の染色体上での位置を考慮し、プラ イマ一を作成した。
[0081] 〔工程 3〕ジォバチルス.サーモダルコシデシウス Q _ 6株より染色体 DNAの抽出及び 縮重 PCR
ジォバチルス'サーモダルコシデシウス Q _ 6株を実施例 2と同様の方法により培養 、回収し、 QIAGEN社の Genomic— tip System (500/G)キットを用いて菌体から 染色体 DNAを抽出した。 TE溶液に溶解させたジォバチルス 'サーモグノレコシデシゥ ス Q— 6株の染色体 DNA0. 1 μ gを铸型として縮重 PCRを行った。縮重 PCR反応は 、配列表の配列番号 5から 10に記載のプライマー 1から 6と、配列表の配列番号 1 1か ら 16に記載のプライマー 7から 12の組み合わせ 36通りを行った。 l OOpmolのプライ マー 2種類を各々、 5Uの Takara社の Ex Taq DNAポリメラーゼ及びバッファーを 含む全量 100 μ 1の反応液を用い、縮重 PCR反応を行い DNA断片の増幅を試みた 。反応条件は以下の通りである。 96°C、 3分の熱変性後、 96°C、 30秒熱変性、 42°C 、 30秒アニーリング、 72°C、 1分 30秒伸長反応を 35サイクル行った後、 72°C、 5分 間伸長反応をさせ、 4°Cにて保冷した。各々の PCR産物を 1重量％ァガロース電気 泳動に供し、 DNAの増幅の確認を行ったところ、配列表の配列番号 9に記載のプラ イマ一 5 ( a R2)と配列表の配列番号 1 1に記載のプライマー 7 ( i3 Fl )の組み合わせ 及び配列表の配列番号 9に記載のプライマー 5 (ひ R2)と配列表の配列番号 12に記 載のプライマー 8 ( β F2)の組み合わせで行った PCR反応の場合のみ、約 700bpの DNA断片の増幅が確認された。
[0082] 〔工程 4〕縮重 PCR産物のクローニング及び増幅 DNA断片の塩基配列解読
増幅された DNA断片をゲルから切り出し、 QIAquick Gel Extraction Kit (QI AGEN社）を用いて抽出し、 pGEM _T Vector (Promega社）に T4 DNA Liga seを用いてライゲーシヨンした。 Ex Taqによる PCR反応の結果、 3'末端に Aが 1塩 基付加される性質を利用している。ライゲーシヨン反応後、大腸菌 JM109株を形質 転換し、 LB寒天培地（50 z g/mlアンピシリン、 0. 5重量0 /0バクト酵母エキストラタト 、 1重量0 /0バタトトリプトン、 0. 5重量0 /0NaCl、 2. 0重量0 /oBacto Agar (pH7. 5) ) にて 37°Cで一晩培養し、アンピシリンにて形質転換体を選択した。アンピシリンを含 む LB培地にて培養した形質転換体から定法によりプラスミド DNAを抽出し、約 700 bpのインサート配列を、ベクター上にある SP6及び T7プロモーターの配列をプライマ 一として用いて塩基配列を解読した。
[0083] その結果、増幅 DNA断片内に 681bpのオープンリーディングフレーム（以後〇RF 1と呼称）が確認された。 ORF1の翻訳停止コドンと次の翻訳開始コドン ATGの間は 13bpであった。 ORF1の塩基配列より推定される N末端側 25個のアミノ酸配列と上 記精製した 28Kダルトンのポリペプチド鎖の N末端側の 25個のアミノ酸配列は全く一 致しており、配列表の配列番号 2記載のアミノ酸配列の 1番目から 25番目までの配列 に相当している。 ORF1のアミノ酸配列は、既知の二トリルヒドラターゼの βサブュニ ットのアミノ酸配列と低いながらもホモロジ一を示し、該蛋白質をコードすることが示唆 された。
[0084] ジォバチルス'サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒドラターゼ βサブュニッ トは 226アミノ酸をコードしており、既存のデーターベース中で相同性の高い蛋白質 とのアミノ酸配列の一致度は、高い方から順に、クレブシエラ属 MC12609株の二トリ ルヒドラターゼ βサブユニットと 43%、ァグロバタテリゥム属の二トリルヒドラターゼ βサ ブユニットと 42%、ロドシユードモナス属 JCM3095株二トリルヒドラターゼ サブュニ ットと 40%と非常に低い。また、ジォバチルス属と近縁の属であるバチルス属由来の 蛋白質とのアミノ酸の一致度も、好熱菌 Bacillus BR449株の二トリルヒドラターゼ j3サ ブユニットと 35. 0%、好熱菌 Bacillus smithii SC-J05- 1株の二トリルヒドラターゼ j3サ ブユニットと 34. 5%と極めて低かった。一方、好熱菌 Bacillus BR449株の二トリルヒド ラターゼ j3サブユニットと好熱菌 Bacillus smithii SC-J05-1株の二トリルヒドラターゼ j3 サブユニットは 85. 6%という高い一致度を有している。
[0085] 〔工程 5〕ジォバチルス'サーモダルコシデシウス Q— 6株二トリルヒドラターゼひサブュ ニット部分の遺伝子のクローニング
上記にて得られたジォバチルス'サーモダルコシデシウス Q _ 6株の二トリルヒドラタ ーゼ βサブユニット部分の遺伝子の周辺遺伝子及びひサブユニット部分の遺伝子を クローニングするために、縮重 PCRを行った。既知の二トリルヒドラターゼひサブュニ ットの下流に位置する遺伝子を参考にして、以下の縮重 PCR用オリゴヌクレオチドプ ライマー以下 2種類を作成した。配列表の配列番号 17に記載のプライマー 13 (pRl )、配列表の配列番号 18に記載のプライマー 14 (pR2)である。
[0086] また、先に塩基配列を解読したジォバチルス'サーモダルコシデシウス Q_ 6株の二 トリルヒドラターゼ βサブユニット内に PCR増幅用のオリゴヌクレオチドプライマー以 下 2種類を作成した。配列表の配列番号 19に記載のプライマー 15 (Q6AposF)、配 列表の配列番号 20に記載のプライマー 16 (Q6abFl)である。ジォバチルス ·サーモ ダルコシデシウス Q— 6株の染色体 DNA0. 1 μ gを铸型として縮重 PCRを行った。 縮重 PCR反応は、アニーリング温度 50°Cにて、配列表の配列番号 17、 18に記載の プライマー 13、 14と、配列表の配列番号 18、 19に記載のプライマー 15、 16の組み 合わせ 4通りを行った。その結果、配列表の配列番号 17に記載のプライマー 13 (pR 1)と配列表の配列番号 18に記載のプライマー 15 (Q6AposF)の組み合わせで行つ た PCR反応で約 0. 8kbの増幅 DNA産物の存在が確認できた。更に、配列表の配 列番号 16に記載のプライマー 13 (pRl)と配列表の配列番号 19に記載のプライマー 16 (Q6abFl)の組み合わせで行った PCR反応で 1. 5kの増幅 DNA産物の存在が 確認できた。なお、その他の組み合わせで行った PCR反応の場合は、増幅 DNA産 物の存在が確認できなかった。
[0087] 配列表の配列番号 16に記載のプライマー 13 (pRl)と配列表の配列番号 19に記 載のプライマー 15 (Q6AposF)の組み合わせで行った縮重 PCR反応により増幅さ れた 0. 8kbの DNA断片をァガロースゲルより切り出し、定法によりァガロースゲルか ら抽出し、 pGEM_T Vector (Promega社）へ組み込み、大腸菌 JM109株を形質 転換し、 50 x g/mlのアンピシリンにより組換え体を選択した。アンピシリンを含む L B培地にて形質転換体を培養し、常法によりプラスミド DNAを抽出し、約 0. 8kbのィ ンサート部分の塩基配列を解読した。その結果、 618bpのオープンリーディングフレ ーム（以後 0RF2と呼称）が確認された。 ORF2の塩基配列より推定される N末端側 2 9個のアミノ酸配列と上記にて精製した 25Kダルトンのポリペプチド鎖の N末端側の 2 9個のアミノ酸配列は完全に一致しており、配列表の配列番号 1記載のアミノ酸配列 の 1番目力 29番目までの配列に相当する。 ORF2のアミノ酸配列は、既知の二トリ ルヒドラターゼ αサブユニットのアミノ酸配列と低レ、ながらもホモロジ一を示し、該蛋白 質をコードすることが示唆された。
[0088] ジォバチルス'サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒドラターゼひサブュニッ トは 205アミノ酸をコードしており、既存のデーターベース中で相同性の高い蛋白質 とのアミノ酸配列の一致度は、高い方より順に、好熱菌 Bacillus BR449の二トリルヒドラ ターゼ /3サブユニットと 66. 3%、好熱菌 Bacillus smithii SC- J05-1の二トリルヒドラタ ーゼ /3サブユニットと 63. 9%と低レ、。一方、好熱菌 Bacillus BR449の二トリルヒドラタ ーゼ βサブユニットと好熱菌 Bacillus smithii SC- J05-1の二トリルヒドラターゼ βサブ ユニットは 88. 8%という高い相同性を有している。
[0089] 以上より、ジォバチルス 'サーモグノレコシデシウス Q— 6株では、 5'末端側上流より 28Κダルトンの二トリルヒドラターゼ サブユニットをコードする遺伝子、 25Κダルトン の二トリルヒドラターゼ αサブユニットをコードする遺伝子がこの順番で隣接して存在 していることが判明した。
[0090] 〔工程 6〕ジォバチルス'サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒドラターゼ αサブ ユニット及び ;3サブユニット部分の pET28a(+ )ベクターへの組み込み
上記にて解読した塩基配列をもとに、二トリルヒドラターゼ αサブユニット及び βサ ブユニット部分を PCRにて増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー以下 2種類を 作成した。配列表の配列番号21に記載のプラィマー17 ((36&1)—？1ー丁）、配列表 の配列番号 22に記載のプライマー 18 (Q6ABall_Rl _BglII_T)である。配列表 の配列番号 21に記載のプライマー 17は、制限酵素部位 Ndelの中に、ジォバチルス •サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒドラターゼ βサブユニットの翻訳開始コ ドンを設計した。配列表の配列番号 22に記載のプライマー 18には、ジォバチルス' サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒドラターゼひサブユニットの翻訳終止コド ンの直下に制限酵素 Bglllサイトを導入した。ジォバチルス.サーモダルコシデシウス Q— 6株の染色体 DNAを铸型とし、配列表の配列番号 21、 22に記載のプライマー 1 7、 18を各々 lOOpmol用いて PCR反応を行った。 Ex Taq DNAポリメラーゼを用 レ、、全量 ΙΟΟ μ こて 96°C、 3分の熱変十生の後、 96。C30禾少熱変十生、 60°C30禾少ァ二 一リング、 72°C1分 30秒伸長反応の条件で PCRを 30サイクル行った後、 72°Cにて 5 分間伸長反応させた後、 4°Cに冷却した。 PCR反応後の溶液を 1. 5重量％ァガロー ス電気泳動に供したところ、約 1. 3kbの DNA断片増幅が確認された。この増幅 DN A産物をァガロースゲルより常法にて抽出し、 Promega社の pGEM—T easy Vec torへライゲーシヨンし、大腸菌 JM 109株を形質転換した。形質転換体より、プラスミ ド DNAを抽出し、インサート部分の塩基配列を解読し、 PCRによる増幅のエラーの ないことを確認した。
[0091] 次に、このプラスミドを Ndel, EcoRI制限酵素で消化し、 1. 5重量％ァガロース電 気泳動に供し、約 1. 3kbのインサート DNAをァガロースゲルから切り出し、常法によ り抽出した。発現ベクターには Novagene社の pET— 28a ( + )ベクターを用いた。こ の DNAを Ndel, EcoRI制限酵素で消化し、 1重量％ァガロース電気泳動に供し、約 5. 3kbの DNA断片を常法により抽出した。これらのインサートとベクターを常法に従 レ、ライゲーシヨン反応を行い、大腸菌 JM109株を形質転換し、カナマイシン耐性で 選択した形質転換体よりプラスミド DNAを抽出し、インサートが導入されたプラスミド を選出した。以上より、ジォバチルス'サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒド ラターゼ αサブユニット及び βサブユニット部分力 Sインサートとして導入された発現プ ラスミドを取得した。完成したプラスミドを、 pET- 28a ( + ) - β aと以下呼称する。
[0092] 〔工程 7〕コロニーハイブリダィゼーシヨンによるジォバチルス'サーモダルコシデシゥ ス Q— 6株由来の二トリルヒドラターゼ周辺遺伝子の取得
( 1 )蛍光標識 DIGプローブの作成
配列表の配列番号 25に記載のジォバチルス.サーモダルコシデシウス Q _ 6株の 二トリルヒドラターゼひサブユニット部分の DNAを铸型に用いて、ロシュ社製の DIG _ DNAラベリングキットにより蛍光標識プローブを作成した。作成方法はロシュ社の DIGマニュアルに従う。
[0093] (2)クロモソームサザンハイブリダィゼーシヨン
実施例 6の工程 3にて調製したジォバチルス'サーモダルコシデシウス Q— 6株の染 色体 DNAを様々な制限酵素を用いて消化し、 1重量％ァガロースゲル電気泳動に 供した。ァガロースゲル内の DNAを、ナイロンメンブレン Hybond— N + (アマシャム 社）に転写した後、先に調製した蛍光標識 DIGプローブを用い、クロモソームサザン ハイブリダィゼーシヨンを行った。 DNAが転写、固定されたメンブレンを 1枚に当たり 10mlのハイブリダィゼーシヨンバッファー（1重量0 /。スキムミルク、 0. 1重量0 /oN—ラ ゥロイルザルコシン、 0. 02重量％SDS、 50重量0/。ホルムアミドを含有する 5 X SSC) に浸し、 42°Cで 2時間プレハイブリダィゼーシヨンを行った。上記と同様に作成した蛍 光標識プローブ lOOngを 95°Cで 10分間の煮沸及び急冷処理により熱変性をさせ、 プレハイブリゼーシヨンバッファーに添加し、 42°Cでー晚、ハイブリダィゼーシヨンを 行った。ハイブリダィゼーシヨン後のメンブレンを 150mlの 0. 1重量％303を含む 2 X SSCにて室温で 2回洗浄した。次に 65°Cにカロ熱した 150mlの 0. 1重量0 /oSDSを 含む I X SSC中で 5分間の洗浄を 2回行った。続いて 100mlのマレイン酸バッファー (0. 1Mマレイン酸、 0. 15M NaCl、 NaOHを用いて ρΗ7· 5に調整済み）で 5分間 洗浄後、 50mlのブロッキング溶液（0· 3Sfi%Tween20, 0. 15M NaCl及び 1重 量％スキミムルクを含む 0. 1Mマレイン酸バッファー； ρΗ7· 5)中にて室温で 30分間 ブロッキング処理を行った。抗ジゴキシゲニン ΑΡを 75mU/mlとなるよう 20mlの ブロッキング溶液にて希釈し、室温で 30分間の抗体反応を行った後、 100mlの洗浄 バッファー（0· 3重量0 /oTween20、 0. 15M NaClを含む 0. 1Mマレイン酸バッファ 一； pH7. 5)中でメンブレンを 5回洗浄し、結合していない抗体を洗い流した。 20ml の検出バッファー（0. 1M Tris-HCl, 0. 1M NaCl、 ρΗ9· 5)中で 5分間平後 ϊ化 処理を行った後、 10mlの検出バッファーに 100mg/mlの ΝΒΤ (ニトロブルーテトラゾ リウムクロライド）溶液を 34 μ 1、 50mg/mlの BCIP (5-ブロモ -4-クロ口- 3_インドリルフ ォスフヱイト)溶液を 35 μ 1を希釈した発色基質溶液 NBT/BCIPを作成し、メンブレ ンが完全に浸るように覆いかけ、遮光してインキュベートを 1分から 16時間行った。ィ ンキュベート中はディスクを動かしたり揺らしたりせず、発色の確認を行った。その結 果、制限酵素 Hindlllにより消化される約 2. 3kb遺伝子断片の中に、二トリルヒドラタ ーゼひサブユニット部分の下流遺伝子が含まれることが明らかになった。
(3)コロニーハイブリダィゼーシヨンによる目的クローンの取得
(i)コロニーハイブリダィゼーシヨン用のプラスミドライブラリーの作成
次に、同蛍光標識 DIGプローブを用い、コロニーハイブリダィゼーシヨンを行った。 ジォバチルス'サーモダルコシデシウス Q— 6株の染色体 DNAlO z gを 1重量0 /0ァ ガロースゲル電気泳動に供し、ァガロースゲルから約 2. Okb力ら 2. 6kbの DNA断 片を含む部分を切り出し、前記と同様の方法で DNA断片を抽出及び精製した。得ら れた DNA断片を DNAライゲーシヨンキット（宝酒造社製）を用いて pUC 118プラスミ ドベクター（宝酒造社製）のマルチクローニングサイト内にある Hindlll制限酵素部位 に導入した。ライゲーシヨンに用いた pUCl 18プラスミドベクター DNAは、制限酵素 Hindlllで消化した後にフエノール/クロ口ホルム処理及びエタノール沈澱による精 製を行い、続レ、てアルカリフォスファターゼ (Takara社製）を用いた 5，末端の脱リン 酸化処理後に再度フヱノール/クロ口ホルム処理及びエタノール沈澱を行レ、、ァガロ ース電気泳動に供し、ァガロースゲルから抽出による再精製を行ったものを使用した
[0095] 約 2· Okb力ら 2. 6kbに断片化されたジォバチルス.サーモダルコシデシウス Q— 6 株の染色体 DNAを pUC118プラスミドベクターと Hindlll制限酵素部位にてライゲ ーシヨンした溶液を用いて、大腸菌 JM109を形質転換し、 50 x g/mlのアンピシリン
、 ImMの IPTG及び 2重量0 /0X—Gal (5-ブロモ -4-クロ口- 3_インドリル- _D_ガラ タトピラノシド）を含有する LB寒天培地（0. 5重量％バクト酵母エキストラタト、 1重量
%ノくク卜卜リプ卜ン、 0. 5重量0 /0NaCl、 2. 0Sfi%Agar; pH7. 5)上に撒き、 37°Cで ー晚培養した。その結果、 1枚当たり 50個から 500個の白コロニーが出現しているシ ヤーレを多数枚取得することができた。
[0096] これらの染色体 DNAのプラスミドライブラリーに対して、先に調製した蛍光標識 DI Gプローブを用いてコロニーハイブリダィゼーシヨンを行レ、、 目的の二トリルヒドラター ゼひサブユニットの下流遺伝子を含むクローンをスクリーニングした。
[0097] (ii)コロニーハイブリダィゼーシヨンによる目的クローンの取得
まず、出現した白コロニー約 1000クローンを、滅菌済み爪楊枝を用いて新しい LB 寒天培地にストリークしなおした。この時、メンブレンをハイブリダィズさせる LB寒天 培地と、保存用の LB寒天培地に同様にストリークし、 30°Cで一晩培養した。
[0098] 次に、コロニーの生えたシャーレ上にアマシャム社製のナイロンメンブレン Hybond —N +を静かに置き、 1分後端からピンセットを用いてゆっくりと取り除いた。剥がした メンブレンを、菌体の付着している面を上にして変性溶液（1. 5Mの NaClを含む 0. 5Mの NaOH水溶液）に 7分間浸した後、中和溶液（1. 5Mの NaClと ImMの EDT A' 2Naを含む 0. 5Mトリス塩酸水溶液; pH7. 2)に 3分間浸し、新しい中和溶液に 更に 3分間浸した。次に、 2 X SSC溶 f夜（1 X SSC1リットノレ中に NaC18. 76g、クェン 酸ナトリウム 4. 41gを含む）にて 1回洗浄を行った後、乾いた濾紙上でメンブレンを風 乾した。さらに 120mj/cm2の UV照射を行うことによりメンブレン上に DNAの固定 を行った。
(iii) DIG抗体による検出及び目的クローンの単離
上記にて処理した、 DNAの固定されたメンブレンを 1枚に当たり 10mlのハイブリダ ィゼーシヨンバッファー（1重量0 /。スキムミルク、 0. 1重量0 /oN—ラウロイルザルコシン 、 0. 02重量0 /0SDS、 50重量0 /0ホノレムアミドを含有する 5 X SSC) iこ浸し、 420Gで 2 時間プレハイブリダィゼーシヨンを行った。上記と同様に作成した蛍光標識プローブ lOOngを 95°Cで 10分間の煮沸及び急冷処理により熱変性をさせ、プレハイブリゼ一 シヨンバッファーに添加し、 42°Cでー晚、ハイブリダィゼーシヨンを行った。ハイブリダ ィゼーシヨン後のメンブレンを 150mlの 0. 1重量％SDSを含む 2 X SSCにて室温で 2回洗浄した。次に 65°Cにカロ熱した 150mlの 0. 1重量0 /0SDSを含む 1 X SSC中で 5分間の洗浄を 2回行った。続いて 100mlのマレイン酸バッファー（0. 1Mマレイン酸 、 0. 15M NaCl、 Na〇Hを用いて ρΗ7· 5に調製済み）で 5分間洗浄後、 50mlの ブロッキング溶液（0. 3Sfi%Tween20, 0. 15M NaCl及び 1重量％スキミムルク を含む 0. 1Mマレイン酸バッファー； pH7. 5)中にて室温で 30分間ブロッキング処理 を行った。抗ジゴキシゲニン一APを 75mU/mlとなるよう 20mlのブロッキング溶液 にて希釈し、室温で 30分間の抗体反応を行った後、 100mlの洗浄バッファー（0. 3 重量0 /。Tween20、 0. 15M NaClを含む 0. 1Mマレイン酸バッファー； pH7. 5)中 でメンブレンを 5回洗浄し、結合していない抗体を洗い流した。 20mlの検出バッファ 一（0. 1M Tris -HCl, 0. 1M NaCl、 pH9. 5)中で 5分間平衡化処理を行った 後、 10mlの検出バッファーに 100mg/mlの ΝΒΤ溶液を 34 μ 1、 50mg/mlの BCIP 溶液を 35 μ 1を希釈した発色基質溶液 NBT/BCIPを作成し、メンブレンが完全に 浸るように覆いかけ、遮光してインキュベートを 1分から 16時間行った。インキュベー ト中はディスクを動かしたり揺らしたりせず、発色の確認を行った。その結果、該メンブ レン上の 1000クローンのうち、ポジティブなシグナルを 4箇所見いだし、その位置と 重なるポジティブクローンを元のシャーレ上で確認した。
[0100] (4)ジォバチルス'サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒドラターゼひサブュニ ット部分の下流遺伝子を含むポジティブクローンの解析
確認されたポジティブクローンをシャーレからアンピシリンを含有する LB液体培地 に植菌し、 37°C ' 250rpmで一晩振とう培養を行レ、、菌体を遠心により回収し、常法 によりプラスミド DNAを抽出した。プラスミド DNAを制限酵素 Hindlllで消化した後 に、 1. 5重量％ァガロース電気泳動に供し、揷入断片の大きさの確認を行ったところ 、約 2· 3kbの大きさであった。また、挿入断片がジォバチルス'サーモダルコシデシ ウス Q— 6株の二トリルヒドラターゼ αサブユニット部分を含むことを、数パターンの PC R及び、制限酵素による消化パターンにより確認した。
[0101] 以上より取得された本プラスミドを pUC118— Q6Hin2. 3と命名し、挿入断片の全 塩基配列を決定した。ジォバチルス'サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒドラ ターゼ及び下流遺伝子群の制限酵素地図及び遺伝子構成を図 1に記載した。
[0102] その結果、挿入断片中に 339bpの塩基配列からなるオープンリデイングフレーム（ 以下、 ORF3と呼称する）が二トリルヒドラターゼ αサブユニット（ORF2)の 5'末端側 下流に同じ向きに存在することが確認された。 ORF2の翻訳終止コドンと ORF3の翻 訳開始コドンの間は 12bpであり、 ORF3の翻訳終止コドンと更に下流に位置する OR Fの翻訳開始コドンの間は 145bpであった。 ORF3は 112アミノ酸をコードしており、 既存のデータ-ベース中の以下のタンパク質と大変低いながらも相同性を有していた 。既存のデーターベース中で相同性の高い配列とのアミノ酸の一致する割合は、ノ チルス属 BR449株の P12Kと 31. 0%、ロドコッカス ·ロドクロウス J1株の NhhGと 31. 0%、ロドコッカス'ロドクロウス J1株の NhlEと 21. 0 %、シユードノカルディア 'サーモフ イラ JCM3095株の P16と 23. 2%であった。
[0103] 〔工程 8〕ジォバチルス.サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒドラターゼひサブ ユニット及び βサブユニット及び下流遺伝子〇RF3の大腸菌プラスミド上での再構築 pET- 28a ( + ) - β ひプラスミドを制限酵素 Hindlllにて消化し、脱リン酸化反応 を行い、フエノールクロ口ホルムで抽出することにより、脱リン酸化処理を行った。この 消化産物を 1重量％ァガロース電気泳動に供し、約 6. lkbの DNA断片を常法によ り抽出した。この DNA断片には、 pETベクター及びジォバチルス'サーモダルコシデ シウス Q— 6株の二トリルヒドラターゼ βサブユニット及びひサブユニットの 60番目の アミノ酸に位置する Hindlll制限酵素部位までが含まれている。
[0104] 次に、 pUC 1 18 _ Q6Hin2. 3プラスミドを制限酵素 Hindlllにより消化し、 1重量 %ァガロース電気泳動に供し、約 2. 3kbのインサート DNAを抽出した。このインサー トを、先に抽出した断片とライゲーシヨンを行レ、、大腸菌 JM109株を形質転換し、力 ナマイシン耐性で選択した形質転換体より、インサート DNAを含むプラスミドを選出 した。インサートの向きを PCRにより確認することにより、 pET— 28a ( + )ベクターに ジォバチルス'サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒドラターゼ αサブユニット 及び βサブユニット及び下流遺伝子 ORF3と更に下流域が含まれたプラスミドを取得 した。こうして完成したプラスミドを、 pET- 28a ( + ) - β a 12と以下呼称する。
[0105] 実施例 7 :二トリルヒドラターゼ遺伝子プロモーターを用いた Q6株の二トリルヒドラター ゼ遺伝子のロドコッカス'ロドクロウス M33株での発現
〔工程 1〕M33株の二トリルヒドラターゼ遺伝子領域のクローニング
M33株中で Q6株の二トリルヒドラターゼを発現させるために、 M33株の二トリルヒドラ ター遺伝子領域をクローニングした。
( 1 ) M33株より染色体 DNAの抽出
ロドコッカス.ロドクロウス M33株を YMPD培地（グルコース 1. 0重量％、ポリペプトン 0 . 5重量0 /0、イーストエキストラタト 0. 3重量0 /0、マルトエキストラタト 0. 3重量0 /0、 pH7 . 2)で培養し、回収した菌体より、 QIAGEN社の Genomic— tip System (500/G )キットを用いて染色体 DNAを抽出した。
[0106] (2) M33株のラムダファージライブラリーの作製
ロドコッカス.ロドクロウス M33株の染色体 DNA30 x gを制限酵素 Sau3Alにより部 分消化した後、 0. 7重量％ァガロースゲル電気泳動に供し、ァガロースゲル力 約 2 Okbの DNA断片を含む部分を切り出し、抽出及び精製した。この染色体 DNAを DN Aライゲーシヨンキット Ver. 1 (宝酒造社製）を用いて Lamda DASH II/BamHI Vecto r kits (Stratagene社製）中のベクター DNAと結合させ、同キットのマニュアルに従い、 コスミドライブラリーを作製した。これらの染色体 DNAのラムダファージライブラリーに 対して、以下に調製した蛍光標識 DIGプローブを用いてプラークハイブリダィゼーシ ヨンを行った。
[0107] (3)蛍光標識 DIGプローブの作成
配列表の配列番号 32に記載のプライマー NH5と配列表の配列番号 33に記載の プライマー NH3を用いて、ロドコッカス.ロドクロウス M33株の染色体 DNAより二トリル ヒドラターゼ遺伝子の約 530bpの DNAを PCR反応により増幅後、ロシュ社製の DIG _DNAラベリングキットにより蛍光標識プローブを作成した。作成方法はロシュ社の DIGマニュアルに従った。
[0108] (4)プラークサザンハイブリダィゼーシヨンによる目的クローンの取得
次に、同 DIGマニュアルに従い、プラークハイブリダィゼーシヨンを行った。まず、出 現した約 1000プラークをメンブレンフィルターに写し、上記で調整された蛍光標識 D IGプローブを用いてハイブリダィゼーシヨンを行い、ポジティブシグナルを示すファー ジプラークを 3個取得した。
[0109] (5)二トリルヒドラターゼ遺伝子上流を含むポジティブクローンの解析
それぞれのプラークを単離、純化した後、 Wizard Lamda Prep (プロメガ社製）を用 いてファージ DNAを調整した。得られた 3つのファージ DNAを各種制限酵素で切断 後、二トリルヒドラターゼ遺伝子の上流部分を最長に含むえ 311を選択した。
[0110] 〔工程 2〕二トリルヒドラターゼ発現べクタ一の構築
(1) M33KpnISacI/pGEM3zfの作製
M33株の二トリルヒドラターゼ遺伝子及びその周辺域をプラスミドベクターにサブク ローニングするために、上記で得られた λ 311を Kpnlと Saclで切断することにより得 られる約 5. 4Kbp断片をァガロース電気泳動後回収したものと、 pGEM3zf ( + ) (プ 口メガ社製）を Kpnlと Saclで切断したものと混合し、 T4DNAリガーゼで連結した。こ のプラスミドを M33KpnISacI/pGEM3zfと命名し、揷入断片の全塩基配列を決定し、配 列表の配列番号 4に示した。また、その制限酵素地図及び遺伝子構成を図 2に記載 した。
[0111] (2) KSNH_pGEM3zの作製
M33KpnISacl/pGEM3zf上に M33株の二トリルヒドラターゼ遺伝子のプロモー ターおよびターミネータ一部分を残し、その間に発現遺伝子揷入のための Ndel、 Bg III、 Clalサイトを揷入したベクターとして KSNH _ pGEM3zを以下の手順で作製し た。 M33KpnISacl/pGEM3zfを用いて INV101株に形質転換を行い damメチル 化しなレ、プラスミドを得て Clalで切断後 Pstlで部分分解を行レ、、二トリルヒドラターゼ 構造遺遺伝子を含む Pstl— Clal断片を除いた 6545bp断片をァガロース電気泳動 後回収した。一方、 M33KpnISacI/pGEM3zf¾r鎳型に配列表の配列番号 26に記載の プライマー M33— F05と配列番号 27に記載の M33— R18を用いて PCR増幅し、 7 07bp断片をァガロース電気泳動後回収した。 M33— R18は M33株の二トリルヒドラ ターゼ i3サブユニット蛋白質の翻訳開始点に制限酵素 Ndel、 BglII、 Clalサイトがこ の順序で並ぶように設計されている。この PCR産物を Pstlと Clalで切断した後に再 度、ァガロース電気泳動後、 400bpの断片を回収し、上記 6545bpの断片と混合し、 T4DNAリガーゼで連結し KSNH— pGEM3zを得た。
[0112] (3) M33KSNH— pHSG298の作製
KSNH— pG3zからベクターを pHSG298 (タカラバイオ社製）に置換するために、 KSNH— pHSG298を以下の要領で作製した。 KSNH— pG3zを Kpnlと Saclで切 断し 3774bpの断片をァガロース電気泳動回収したものと、 Kpnlと Saclで切断した p HSG298を T4DNAリガーゼで連結し、約 6 · 44kbのプラスミド M33KSNH— pHS G298を取得した。
[0113] (4)ジォバチルス'サーモダルコシダシウス Q6株の二トリルヒドラターゼ β、 aサブュ ニット及び下流遺伝子 orf3の M33KSNH _ pHSG298への導入
配列表の配列番号 28に記載の alpha-maeFl及び、配列表の配列番号 29に記載の orfl- atoRlをプライマーとして用レ、、実施例 6で作製した pET— 28a ( + ) - β a 12を 錡型 DNAとして、ジォバチルス'サーモダルコシダシウス Q6株の二トリルヒドラターゼ β ひサブユニット及びその下流遺伝子 0Γβを含む約 1. 5kb断片を増幅した。増幅 によるエラーが無いことを確認し、 βサブユニットの翻訳開始コドン上に設計した Ndel 制限酵素部位及び、 0Γβ遺伝子の翻訳終始コドン直後に位置する制限酵素 Bglllに て消ィ匕し、約 1. 5kbDNA断片を回収した。一方、約 6. 44kbのプラスミド M33KSNH — PHSG298を制限酵素 Ndelで消化した後 Bglllで消化し、ァガロースゲル電気泳動 に供し、 DNA断片を回収した。この約 6. 44kbの M33KSNH _pHSG298のべクタ 一領域と、約 1. 5kbの Q6由来二トリルヒドラターゼ j3、 ひサブユニット、下流遺伝子 or f3部分のインサート領域をライゲーシヨンし、約 7. 94kbの M33KSNH— pHSG298 — Q6 β α 0Γβプラスミドを作製した。
[0114] この M33KSNH _ pHSG298 _ Q6 j3 ひ orf3プラスミドは、ベクター部分が約 2. 64 kb、インサート部分は M33株の二トリルヒドラターゼのプロモーター領域約 3. 8kbと Q 6株の二トリルヒドラターゼひ、 サブユニット、下流遺伝子 orf3約 1. 5kbを合わせた 約 5. 3kb力ら構成される。この結果、 M33株の二トリルヒドラターゼ サブユニットの 翻訳開始コドン ATG部分で Q6株の二トリルヒドラターゼ βサブユニットの翻訳開始コ ドンに置き換わり、 Μ33株の二トリルヒドラターゼのプロモーターを用いて Q6株の二トリ ルヒドラターゼ及び下流遺伝子 0Γβが発現する遺伝子ユニットが構築された。
[0115] (5)大腸菌とロドコッカス属間のシャトルベクター pRE— 7上での二トリルヒドラターゼ 発現ユニットの構築
上記で構築した発現ユニットを、カナマイシン耐性を有する約 5. 9kbの大腸菌と口 ドコッカス属間用シャトルベクター pRE— 7に以下の要領で導入した。
なお、 pRE-7は Zhengらの方法（Plasmid 38 180-187, 1997)で pBluescript(Stratagne 社製)、 pACYC 177 (New England Biolabs社製）および pOTSから作成される。この ρθ TSは TAKAIらの文献（Infection and Imunity, Dec.2000, p6848_6847)に記載の p l03 と同一であり、また、同文献中の P33701とほぼ同一であり、特に pRE-7の作製に用い られる部分は完全に同一であり、 P33701はロドコッカス'ェクイ（Rhodococcus equi) A TCC33701株より単離できる。
[0116] まず、配列表の配列番号 30に記載の Ad5F— SacKpnNotl (5 ' - pCCGGTACCGC
_ 3 ' )及び配列表の配列番号 31に記載の Ad5R— SacKpnNotl (5 '—pGGCCGCGG TACCGGAGCT— 3 ' ) (pは 5，末端のリン酸化を示す）の 2種類の 1本鎖オリゴヌタレ ォチドをアニーリングさせて制限酵素部位 Sadを Notl部位に変換するためアダプター Ad5— SacKpnNotlを作製した。
[0117] 上記にて構築した約 7. 94kbの M33KSNH _pHSG298 _ Q6 i3 ひ orf3プラスミド を制限酵素 Sad、 Kpnlにて消化し、約 5. 3kbのインサート部分を切り出し、 DNA断片 を抽出した。この Sacl制限酵素部位にアダプター Ad5_SacKpnNotIを連結した。シャ トルベクター pRE_ 7のマルチクローニングサイトを利用し、制限酵素 Kpnl、 Notlにて 消ィ匕し、ァガロースゲル電気泳動に供し、約 5. 9kbのベクター部分の DNA断片を取 得した。制限酵素部位 NotI、 Kpnlにてベクターとインサートをライゲーシヨンし、大腸 菌 JM109株を形質転換し、カナマイシン入りの LB培地にて形質転換体を選択した。
[0118] その結果、シャトルベクター pRE_ 7 (5. 9kb)に M33株の二トリルヒドラターゼプロモ 一ター領域（3. 8kb)及び Q6株の二トリルヒドラターゼ j3、 ひサブユニット及び下流遺 伝子 orf3領域（1. 5kb)が導入された約 11. 2kbの pRE— 7-M33pro-Q6 i3 a orf3プ ラスミドを取得した。
[0119] 〔ェ程3〕 1^ー 7— 1^33 ^ー06；3 a orf3プラスミドを用いた M33株の形質転換
LB液体培地（0. 5重量％バクト酵母エキストラタト、 1重量％バタトトリプトン、 0. 5重 量0 /0NaCl (pH7. 5) ) 100mlを含む 500ml容積の三角フラスコにロドコッカス'口ドク 口ウス M33株を 1白金耳、植菌し 30。Cで、 17時間培養後、 4。Cにて 10, OOO X gで 15分間、遠心分離することにより集菌した。同菌体を氷冷した蒸留水 25mlで 2回、 遠心分離 (4°Cにて 10, OOO X gで 15分間）することにより洗浄し、フィルター滅菌し た 10重量％のグリセロールを用いて、波長 600nmの濁度が 40になるように懸濁した。 同グリセロール懸濁液 50 μ 1を、 1 μ 1の水に懸濁した 2 μ gの pRE— 7— M33pro— Q6 β ひ orf3と混合し、速やかに、 1mm幅のエレクト口ポーレーシヨン用のキュベットに入 れ、 1. 5KV， 25 z F, 800 Ωの条件で、 BTX社製の ECM630を用いて遺伝子導 入を行った。その後、 10分間、氷中で保持し、全量を lmlの LB液体培地に加え 30°C 、 4時間培養し、 100 z g/mlのカナマイシンを含む LB寒天培地にまき、 30°Cで 3日 力 5日間培養し、出現するカナマイシン耐性コロニーを選択し、ロドコッカス'ロドクロ ウス M33株の形質転換体を得た。
[0120] 〔工程 4〕 M33株形質転換体の培養
生産用培地（KH PO 0.5 g/L、 K HPO 0.4 g /し CoCl 6H O 0.02 g/L、 FeS
2 4 2 4 2 2
O 7H O 0.003 g/L、 EDTA_ 2Na 0.006 g/L、 NaCl 0.01 g/L、 CaCl 2H O 0.
4 2 2 2
01 g/L、 Glucose 20 g/L、 MgSO 7H〇 1.2 g/L、 Urea 7.5 g/L、カナマイシン 10
4 2
mg/L) 100mlを入れた 500ml用量の三角フラスコにロドコッカス'ロドクロウス M33 株の形質転換体を 1白金耳、植菌し、 30°Cで 2日間培養した。これより得られる培養 液 90mlを生産用培地 3Lを含む 5L容積のジャーフアーメンターに移植し、 pH7. 2、 撹拌速度 500ι·ριη、 30°Cで 48時間培養した。培養液を 25°Cにて 10, 000 X gで 15 分間、遠心分離することにより集菌した。同菌体を水 25mlで 2回、 25°Cにて 10, 00 O X gで 15分間、遠心分離することにより洗浄し、生産反応用の菌体を得た。
[0121] 〔工程 5〕 M33株形質転換体を用いたアクリルアミド生産反応
上記の工程 4の培養で得られたロドコッカス'口ドク口ウス M33株の形質転換体 0. 9g (菌体乾燥重量相当量）を含む蒸留水 800mlを 1. 5L反応器に入れて、 20°Cから 25°Cに容器内温度を調整しつつ、撹拌した。そこに、液体であるアクリロニトリルを濃 度が 2%を超えぬように滴下し、適宜、サンプルを取り出し、遠心分離後の上清を希 釈し、高速液体クロマトグラフィーでアクリルアミド濃度を測定した。その結果、 Q6株 の二トリルヒドラターゼ遺伝子を持つロドコッカス'ロドクロウス M33株の形質転換体 は 52% (重量/溶液）のアクリルアミドを蓄積した。
[0122] 比較例 1
比較例として、培地にカナマイシンを添加しない以外は上記の工程 4と同様の方法 で親株であるロドコッカス'ロドクロウス M33株を培養し、この培養液よりの菌体を用い 工程 5と同様の方法でアクリルアミド生産反応を行ったところ、アクリルアミドの最高蓄 積量は 43% (重量/液量）であった。このことより、上記の M33の形質転換体では、 Q6 株由来の二トリルヒドラターゼ遺伝子の導入により、アクリルアミド蓄積量が顕著に蓄 積したことが確認された。実施例と比較例の結果を図 3でグラフとした図 3の結果を表 3にも示す。
[0123] [表 7]
反応時間（Hrs) 口ドコッカス■口ドク口ウス M33株 形質転換されたロドコッカス'ロドクロウス M33株
0 0.0 0.0
1 14.2 19.4
2 25.8 32.6
3 34.0 39.2
4 38.5 43.0
5 40.8 45.7
6 41.9 47.8
7 42.9 49.6
3 43.2 50.fi
9 43.2 51 ,3
10 43,2 51 ,8 [0124] 比較例 2 :ネイティブ ·ポリアクリルアミドゲル電気泳動による各菌体内二トリルヒドラタ ーゼ量の確認
比較例 1で得られた親株である M33株の培養液および上記の工程 4で得られた M3 3株の形質転換体の培養液を、それぞれ、 8, 000g、 10分間の遠心分離集菌し、得 られた湿菌体 80mgを 2mlの 50mMリン酸ナトリウムバッファー（PH7)に再懸濁した。 菌体を冷却下で超音波破砕機を用いて破砕し、菌体破砕液に 10% (重量/液量） になるようにグリセロールを添カ卩し、各サンプノレを 10%ゲルを用いたネイティブ 'ポリ アクリルアミド電気泳動により解析した。泳動後、クマシ一ブリリアントブルーによる蛋 白質染色を行い、脱色した結果、 M33株の形質転換体中には、親株である M33株の 二トリルヒドラターゼと同位置のバンドとともに、より泳動度の少ない位置に Q6株の精 製した二トリルヒドラターゼと同位置のバンドが存在し、それぞれが細胞内全蛋白質 の 30%以上を占めるという類稀な、高発現を達成していることが判明した。形質転換 体のサンプノレより得られた Q6株の精製した二トリルヒドラターゼと同位置バンドをブロ ッティング装置（BIO— RAD社）を用いて PVDF膜（MILLIPORE社製）に転写し、 CBB染色し、 目的のバンドが吸着している部分を PVDF膜から切り出した。次に、全 自動タンパク質一次構造分析装置 PPSQ-23A (島津製作所)を用いて蛋白質の N末 端アミノ酸配列を解読した。その結果、配列表の配列番号 23に記載の酸配列と配列 表の配列番号 24に記載の配列が混合して、検出され、形質転換体は間違いなく Q6 株由来の二トリルヒドラターゼを著量生産していることが判明した。一方、親株である M33株のサンプルには当然ながら、 Q6株由来の二トリルヒドラターゼの位置に相当す るバンドはなかった。
産業上の利用可能性
[0125] 本発明の微生物は、高温、および高二トリル化合物濃度や高アミド化合物濃度下の 反応においても、二トリル化合物を対応するアミド化合物に変換する分野で好適に利 用すること力 Sできる。
図面の簡単な説明
[0126] [図 1]図 1は、ジォバチルス'サーモダルコシデシウス Q_ 6 (Geobacillus thermogluc osidasius Q_6)株の二トリルヒドラターゼ βサブユニット、 ひサブユニット及び下流遺伝 子群の遺伝子構成及び制限酵素地図を示す。コロニーハイブリダィゼーシヨンで取 得した断片（Hin2. 3)及び、ロドコッカス属細菌にて発現させた際に導入した断片（ β ひ 1)の位置を示した。
[図 2]図 2は、ロドコッカス'ロドクロウス M33 (Rhodococcus rhodochrous M33)株の 二トリルヒドラターゼ遺伝子 βサブユニット、 αサブユニット及び下流遺伝子群の遺伝 子構成及びその周辺領域の制限酵素地図を示す。制限酵素地図の両末端がブラー クハイブリダィゼーシヨンで得た λ 311の DNAよりサブクローユングに用いた Kpnlと Sa clに相当する。太線部が M33KSNH— pHSG298に用いた部分であり、太線の切れ た部分にリンカ一が挿入されている。
[図 3]図 3は、ロドコッカス'ロドクロウス M33 (Rhodococcus rhodochrous M33)株およ びその形質転換体を用いたアクリルアミド生産反応の結果を示すグラフである。

Claims

請求の範囲
[1] 下記（A)又は（B)の何れかに記載の DNAにより形質転換されたロドコッカス（Rhodo coccus)属に属する微生物。
(A)二トリルヒドラターゼの αサブユニットに対応する配列表の配列番号 1に記載のァ ミノ酸配列、又は配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数 個のアミノ酸の置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列と 、二トリルヒドラターゼの βサブユニットに対応する配列表の配列番号 2に記載のアミ ノ酸配歹 IJ、又は配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数個 のアミノ酸の置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列とを 含有する DNAであって、二トリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする D
(Β)二トリルヒドラターゼのひサブユニットをコードする塩基配列に対応する配列表の 配列番号 3の 695〜： 1312番目の塩基配列、又は当該塩基配列に対してストリンジェ ントな条件下でハイブリダィズする塩基配列と、二トリルヒドラターゼの βサブユニット をコードする塩基配列に対応する配列表の配列番号 3の 1〜681番目の塩基配列、 又は当該塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列と を含有する DNAであって、二トリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする DNA。
[2] 形質転換により下記の理化学的性質を有するタンパク質を生産することができるロド コッカス（Rhodococcus)属に属する微生物。
(a)二トリルヒドラターゼ活性を有する。
(b)基質特異性：アクリロニトリル、アジポニトリル、ァセトニトリル、イソプチロニトリル 、 n-バレロ二トリル、 n-ブチロニトリル、ベンゾニトリル、へキサン二トリルを基質として、 活性を示す。
(c)分子量:少なくとも下記の 2種類のサブユニットから構成されるタンパク質であつ て、各サブユニットの還元型 SDS-ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が以下の 通りである。
サブユニット α分子量： 25000 ± 2000 サブユニット β分子量： 28000土 2000
(d)熱安定性:水液中の酵素を 70°Cの温度で 30分加熱後に、加熱前の 35%以上の 活性を残存する。
(e) 6重量％のアクリロニトリルを基質としても、それ以下の基質濃度の時に比べ、 活性が減少しない。
）35重量％のアクリルアミド水溶液中でもアクリロニトリルを基質とした活性を有す る。
[3] 形質転換により下記の理化学的性質を有するタンパク質を生産することができる、請 求項 1に記載の微生物。
(a)二トリルヒドラターゼ活性を有する。
(b)基質特異性：アクリロニトリル、アジポニトリル、ァセトニトリル、イソプチロニトリル 、 n-バレロ二トリル、 n-ブチロニトリル、ベンゾニトリル、へキサン二トリルを基質として、 活性を示す。
(c)分子量:少なくとも下記の 2種類のサブユニットから構成されるタンパク質であつ て、各サブユニットの還元型 SDS-ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が以下の 通りである。
サブユニット α分子量： 25000 ± 2000
サブユニット β分子量： 28000土 2000
(d)熱安定性:水液中の酵素を 70°Cの温度で 30分加熱後に、加熱前の 35%以上の 活性を残存する。
(e) 6重量％のアクリロニトリルを基質としても、それ以下の基質濃度の時に比べ、 活性が減少しない。
）35重量％のアクリルアミド水溶液中でもアクリロニトリルを基質とした活性を有す る。
[4] ロドコッカス属に属する微生物がロドコッカス.ロドクロウス M33 (Rhodococcus rhodoch rous M33)株（VKM Ac_1515Dあるいは KCCM-10635)及び Z又はその変異体であ る、請求項 1から 3の何れかに記載の微生物。
[5] 二トリルヒドラターゼ遺伝子により形質転換されたロドコッカス'ロドクロウス M33 (Rhodo coccus rhodochrous M33)株（VKM Ac_1515Dあるいは KCCM-10635)及び Z又はそ の変異体のレ、ずれかの微生物。
[6] 下記（A)又は（B)の何れかに記載の DNAによりロドコッカス（Rhodococcus)属に属 する微生物を形質転換することを含む、請求項 1から 5の何れかに記載の微生物の 製造方法。
(A)二トリルヒドラターゼのひサブユニットに対応する配列表の配列番号 1に記載のァ ミノ酸配列、又は配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数 個のアミノ酸の置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列と 、二トリルヒドラターゼの βサブユニットに対応する配列表の配列番号 2に記載のアミ ノ酸配歹 IJ、又は配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数個 のアミノ酸の置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列とを 含有する DNAであって、二トリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする D
(Β)二トリルヒドラターゼのひサブユニットをコードする塩基配列に対応する配列表の 配列番号 3の 695〜1312番目の塩基配列、又は当該塩基配列に対してストリンジェ ントな条件下でハイブリダィズする塩基配列と、二トリルヒドラターゼの βサブユニット をコードする塩基配列に対応する配列表の配列番号 3の 1〜681番目の塩基配列、 又は当該塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列と を含有する DNAであって、二トリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする DNA
[7] 請求項 1から 5の何れかに記載の微生物を、培地において培養することを含む、二トリ ルヒドラターゼまたはそれを含有する菌体処理物の製造方法。
[8] 請求項 7に記載の製造方法により製造される、二トリルヒドラターゼまたはそれを含有 する菌体処理物。
[9] 請求項 8に記載の二トリルヒドラターゼまたはそれを含有する菌体処理物に二トリル化 合物に作用させて、該ニトリル化合物からアミド化合物を合成することを含む、アミド 化合物の製造方法。
PCT/JP2005/022647 2004-12-09 2005-12-09 ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体 WO2006062189A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006546771A JPWO2006062189A1 (ja) 2004-12-09 2005-12-09 ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004-357035 2004-12-09
JP2004357035 2004-12-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006062189A1 true WO2006062189A1 (ja) 2006-06-15

Family

ID=36578009

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/022647 WO2006062189A1 (ja) 2004-12-09 2005-12-09 ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体

Country Status (4)

Country Link
JP (1) JPWO2006062189A1 (ja)
KR (1) KR20070085922A (ja)
TW (1) TW200634151A (ja)
WO (1) WO2006062189A1 (ja)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008118959A (ja) * 2006-11-15 2008-05-29 Tatsuhiko Kobayashi タンパク質改変方法、ニトリルヒドラターゼ成熟化方法、成熟化ニトリルヒドラターゼ生産方法、成熟化ニトリルヒドラターゼ、該成熟化ニトリルヒドラターゼを用いたアミド化合物生産方法
JP2011200132A (ja) * 2010-03-24 2011-10-13 Mitsubishi Rayon Co Ltd ニトリルヒドラターゼ遺伝子を欠失又は不活性化させた微生物
JP2011217665A (ja) * 2010-04-08 2011-11-04 Mitsubishi Rayon Co Ltd ニトリルヒドラターゼ遺伝子を置換した微生物
WO2013129179A1 (ja) * 2012-02-28 2013-09-06 三菱レイヨン株式会社 酵素の保存方法
JP2015154785A (ja) * 2015-05-28 2015-08-27 三菱レイヨン株式会社 ニトリルヒドラターゼ遺伝子を置換した微生物
WO2019096677A1 (en) * 2017-11-14 2019-05-23 Columbia Srl Microbiological process for the preparation of amides
CN110139930A (zh) * 2016-12-28 2019-08-16 三井化学株式会社 突变型腈水合酶、编码该突变型腈水合酶的核酸、含有该核酸的表达载体及转化体、该突变型腈水合酶的制造方法、及酰胺化合物的制造方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111334495B (zh) * 2020-03-12 2022-04-29 宜昌东阳光生化制药有限公司 制备右旋酰胺酮洛芬的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08504599A (ja) * 1993-08-10 1996-05-21 ローヌ−プーラン シミ ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素、それらの製造のための遺伝学的ツール及び宿主微生物、並びに該酵素を用いる加水分解工程
JPH09248188A (ja) * 1996-03-18 1997-09-22 Sumitomo Chem Co Ltd ニトリルヒドラターゼ、その遺伝子及びその利用
WO1999055719A1 (en) * 1998-04-29 1999-11-04 Michigan State University Method for producing amide compounds using a nitrile hydratase from a thermophilic bacillus
KR20010047310A (ko) * 1999-11-19 2001-06-15 이상현 로도코커스 로도크로스(Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ) Ｍ33 ＶＫＭ Ａｃ-1515Ｄ로부터유래된 니트릴 히드라타제를 코딩하는 유전자 및 이유전자를 함유한 형질전환체
WO2004108942A1 (ja) * 2003-06-10 2004-12-16 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha 新規なニトリルヒドラターゼ

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63137688A (ja) * 1986-12-01 1988-06-09 Res Assoc Util Of Light Oil アミド化合物の製造法
JPH0753104B2 (ja) * 1989-02-28 1995-06-07 秀明 山田 細菌の培養法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08504599A (ja) * 1993-08-10 1996-05-21 ローヌ−プーラン シミ ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素、それらの製造のための遺伝学的ツール及び宿主微生物、並びに該酵素を用いる加水分解工程
JPH09248188A (ja) * 1996-03-18 1997-09-22 Sumitomo Chem Co Ltd ニトリルヒドラターゼ、その遺伝子及びその利用
WO1999055719A1 (en) * 1998-04-29 1999-11-04 Michigan State University Method for producing amide compounds using a nitrile hydratase from a thermophilic bacillus
KR20010047310A (ko) * 1999-11-19 2001-06-15 이상현 로도코커스 로도크로스(Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ) Ｍ33 ＶＫＭ Ａｃ-1515Ｄ로부터유래된 니트릴 히드라타제를 코딩하는 유전자 및 이유전자를 함유한 형질전환체
WO2004108942A1 (ja) * 2003-06-10 2004-12-16 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha 新規なニトリルヒドラターゼ

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KOMEDA H ET AL: "Characterization of the gene cluster of high-molecular-mass nitrile hydratase (H-NHase) induced by its reaction product in Rhodococcus rhodochrous J1.", PROC NATL ACAD SCI USA., vol. 93, no. 9, 1996, pages 4267 - 4272, XP002266195 *
NAZINA T N ET AL: "Taxonomic study of aerobic thermophilic bacilli: descriptions of Geobacillus subterraneus gen nov.sp.nov.and Geobacillus uzenensis sp.nov.from petroleum reservoirs and transfer of Bacillus stearothermophilus, Bacillus thermocatenulatus Bacillus Bacillus", INT J SYST EVOL MICROBIOL., vol. 51, 2001, pages 433 - 446, XP002999431 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008118959A (ja) * 2006-11-15 2008-05-29 Tatsuhiko Kobayashi タンパク質改変方法、ニトリルヒドラターゼ成熟化方法、成熟化ニトリルヒドラターゼ生産方法、成熟化ニトリルヒドラターゼ、該成熟化ニトリルヒドラターゼを用いたアミド化合物生産方法
JP2011200132A (ja) * 2010-03-24 2011-10-13 Mitsubishi Rayon Co Ltd ニトリルヒドラターゼ遺伝子を欠失又は不活性化させた微生物
JP2011217665A (ja) * 2010-04-08 2011-11-04 Mitsubishi Rayon Co Ltd ニトリルヒドラターゼ遺伝子を置換した微生物
WO2013129179A1 (ja) * 2012-02-28 2013-09-06 三菱レイヨン株式会社 酵素の保存方法
US9353348B2 (en) 2012-02-28 2016-05-31 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. Method for preserving enzyme
JP2015154785A (ja) * 2015-05-28 2015-08-27 三菱レイヨン株式会社 ニトリルヒドラターゼ遺伝子を置換した微生物
CN110139930A (zh) * 2016-12-28 2019-08-16 三井化学株式会社 突变型腈水合酶、编码该突变型腈水合酶的核酸、含有该核酸的表达载体及转化体、该突变型腈水合酶的制造方法、及酰胺化合物的制造方法
CN110139930B (zh) * 2016-12-28 2023-08-25 三井化学株式会社 突变型腈水合酶及其应用
WO2019096677A1 (en) * 2017-11-14 2019-05-23 Columbia Srl Microbiological process for the preparation of amides
CN111757940A (zh) * 2017-11-14 2020-10-09 哥伦比亚有限公司 用于制备酰胺的微生物学方法
US11261468B2 (en) 2017-11-14 2022-03-01 Columbia Srl Microbiological process for the preparation of amides
CN111757940B (zh) * 2017-11-14 2023-11-07 哥伦比亚有限公司 用于制备酰胺的微生物学方法

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2006062189A1 (ja) 2008-06-12
TWI327596B (ja) 2010-07-21
KR20070085922A (ko) 2007-08-27
TW200634151A (en) 2006-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2006062189A1 (ja) ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体
KR101586132B1 (ko) 개량형 니트릴 히드라타제
JP2010284170A (ja) 新規アルドラーゼおよび置換α−ケト酸の製造方法
JP5915649B2 (ja) 改良型ニトリルヒドラターゼ
JP6741093B2 (ja) 改良型ニトリルヒドラターゼ
JP6048850B2 (ja) Ｄ−サクシニラーゼ、およびこれを用いたｄ−アミノ酸の製造方法
WO2004078973A1 (ja) 微生物トランスグルタミナーゼの製造法
KR100806991B1 (ko) 신규 니트릴 히드라타아제
WO2006022239A1 (ja) 耐熱性l-ラムノースイソメラーゼ遺伝子配列とその用途
JP4489598B2 (ja) Ｄ−アミノアシラーゼ
JP2006055131A (ja) 新規なｄ−アミノアシラーゼおよびその遺伝子
JP5096911B2 (ja) ５−置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするｄｎａ、組換えｄｎａ、形質転換された細胞、および、光学活性ｎ−カルバミルアミノ酸または光学活性アミノ酸の製造方法
AU1568900A (en) Method for isolating and selecting genes coding for enzymes, and suitable culture medium
WO2006008872A1 (ja) Ｌ体アミノ酸アミド不斉加水分解酵素及びそれをコードするｄｎａ
JP4563789B2 (ja) Ｄ−アミノアシラーゼ遺伝子
WO2005075650A1 (ja) アミダーゼ活性を有するポリペプチド及びその遺伝子
JP4276886B2 (ja) シロ−イノソースとｄ−キロ−１−イノソースとの相互変換作用を有する酵素とその製造および応用
JP2003061692A (ja) 活性化されたｒｅｃ−ヒダントイナーゼの製造方法、該方法で得られるｒｅｃ−ヒダントイナーゼ、これをコードする核酸、それを有するプラスミド、ベクター及び微生物、ハイブリダイズする核酸、その製造のためのプライマー並びにｒｅｃ−ヒダントイナーゼ及び核酸の使用
JP2011200182A (ja) ５−（アミノメチル）−２−クロロチアゾールの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KM KN KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV LY MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NG NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006546771

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020077012947

Country of ref document: KR

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 05814758

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1