JP2003061692A - 活性化されたｒｅｃ−ヒダントイナーゼの製造方法、該方法で得られるｒｅｃ−ヒダントイナーゼ、これをコードする核酸、それを有するプラスミド、ベクター及び微生物、ハイブリダイズする核酸、その製造のためのプライマー並びにｒｅｃ−ヒダントイナーゼ及び核酸の使用 - Google Patents
活性化されたｒｅｃ−ヒダントイナーゼの製造方法、該方法で得られるｒｅｃ−ヒダントイナーゼ、これをコードする核酸、それを有するプラスミド、ベクター及び微生物、ハイブリダイズする核酸、その製造のためのプライマー並びにｒｅｃ−ヒダントイナーゼ及び核酸の使用Info
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- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
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- C12Y305/02—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amides (3.5.2)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 活性化ヒダントイナーゼを製造し、この方法
によって活性組み換えヒダントイナーゼを得、該ヒダン
トイナーゼを使用する。 【解決手段】 発酵ブロスが、活性化をもたらす濃度の
前記金属イオンを有することを特徴とする、活性化され
たrec-ヒダントイナーゼを、ヒダントイナーゼを形成す
る微生物の２価の金属イオンの存在下での発酵によって
製造するための方法を提供する。
によって活性組み換えヒダントイナーゼを得、該ヒダン
トイナーゼを使用する。 【解決手段】 発酵ブロスが、活性化をもたらす濃度の
前記金属イオンを有することを特徴とする、活性化され
たrec-ヒダントイナーゼを、ヒダントイナーゼを形成す
る微生物の２価の金属イオンの存在下での発酵によって
製造するための方法を提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、特定の方法によっ
て活性化された形で得ることができるrec-ヒダントイナ
ーゼに関する。とりわけ本発明はアルスロバクター ク
リスタロポイエテス（Arthrobacter crystallopoiete
s）ＤＳＭ２０１１７由来のrec-ヒダントイナーゼ、か
かるタンパク質をコードする核酸及びこれらを有する運
搬体に関する。
て活性化された形で得ることができるrec-ヒダントイナ
ーゼに関する。とりわけ本発明はアルスロバクター ク
リスタロポイエテス（Arthrobacter crystallopoiete
s）ＤＳＭ２０１１７由来のrec-ヒダントイナーゼ、か
かるタンパク質をコードする核酸及びこれらを有する運
搬体に関する。
【０００２】
【従来の技術】有機化合物の合成における酵素的方法の
使用は大工業的規模で十分に確立されている。それとい
うのもこの方法は生成物の選択性及び収率に関して通常
の化学的方法を屡々凌駕するからである。まさにエナン
チオマー濃縮されたアミノ酸こそが、酵素的に作業され
る方法の使用のための有利な標的物であり、これらのプ
ロセスは自然界でも、例えばアミノ酸、タンパク質及び
蛋白の生合成において決定的な意味を有する。
使用は大工業的規模で十分に確立されている。それとい
うのもこの方法は生成物の選択性及び収率に関して通常
の化学的方法を屡々凌駕するからである。まさにエナン
チオマー濃縮されたアミノ酸こそが、酵素的に作業され
る方法の使用のための有利な標的物であり、これらのプ
ロセスは自然界でも、例えばアミノ酸、タンパク質及び
蛋白の生合成において決定的な意味を有する。
【０００３】エナンチオマー濃縮されたアミノ酸は更に
生体活性化合物の合成に関して、又は非経口栄養の場合
に重要な生成物である。
生体活性化合物の合成に関して、又は非経口栄養の場合
に重要な生成物である。
【０００４】ヒダントイナーゼは５′−置換されたヒダ
ントインを場合により立体選択的にＬ−又はＤ−Ｎ−カ
ルバモイルアミノ酸に変換できる酵素である（反応式
１）。
ントインを場合により立体選択的にＬ−又はＤ−Ｎ−カ
ルバモイルアミノ酸に変換できる酵素である（反応式
１）。
【０００５】反応式１：
【０００６】
【化１】
【０００７】ラセミ体の５′−置換されたヒダントイン
は有利には化学合成によって容易に正確に得ることがで
きる（Kleinpeter, Structural Chemistry 1997, 8, 16
1-173; Ogawa et al., Tibtech 1999, 17, 1039-43; Be
ller et al., Angew. Chem.1999, 111, 1562-65）。従
ってエナンチオマー濃縮されたアミノ酸の目的の製造方
法は有利には工業的規模で使用される（Drauz K, Kotte
nhahn M, MakryaleasK, Klenk H, Bernd M, Angew Che
m, (1991). Chemoenzymatic synthesis of D-ω-ureido
aminoacids, 103, 704-706.；反応式２）。
は有利には化学合成によって容易に正確に得ることがで
きる（Kleinpeter, Structural Chemistry 1997, 8, 16
1-173; Ogawa et al., Tibtech 1999, 17, 1039-43; Be
ller et al., Angew. Chem.1999, 111, 1562-65）。従
ってエナンチオマー濃縮されたアミノ酸の目的の製造方
法は有利には工業的規模で使用される（Drauz K, Kotte
nhahn M, MakryaleasK, Klenk H, Bernd M, Angew Che
m, (1991). Chemoenzymatic synthesis of D-ω-ureido
aminoacids, 103, 704-706.；反応式２）。
【０００８】反応式２：
【０００９】
【化２】
【００１０】ヒダントインを使用する微生物によるスク
リーニングによって、今まではグラム陽性及びグラム陰
性のいずれの原核生物を５種の異なる系統発生的な群か
ら単離していた：アルカリゲネス、アルスロバクター、
バシラス、ブラストバクター、フラボバクテリウム、ノ
カルジア、シュードモナス、コマモナス、テルムス及び
アグロバクテリウム。分割に関与する酵素をコードする
遺伝子の完全な構成は今まで３種の生物に関してのみ記
載されているにすぎない。更に酵素をコードする構造遺
伝子はいわゆるｈｙｕ−遺伝子クラスター（ｈｙｕは
“ヒダントイン利用性”を表す；Watabe et al., J. ba
cteriol. 1992, 174, 3461-66; ibid, 962-969による）
の形でゲノムＤＮＡ（アルスロバクター及びアグロバク
テリウム）又はプラスミド（シュードモナス）上に隣接
して配置されている。３種のｈｙｕ−遺伝子クラスター
の中でも、アグロバクテリウム及びシュードモナスはＤ
−選択的分割のための遺伝子を有し、かつアルスロバク
ターはＬ−選択的分割のための遺伝子を有する（Hils,
Dissertation Universitaet Stuttgart, 1998; Watabe
et al., s. o. ; Wiese, Dissertation Universitaet S
tuttgart, 2000, Verlag Ulrich Grauer）。
リーニングによって、今まではグラム陽性及びグラム陰
性のいずれの原核生物を５種の異なる系統発生的な群か
ら単離していた：アルカリゲネス、アルスロバクター、
バシラス、ブラストバクター、フラボバクテリウム、ノ
カルジア、シュードモナス、コマモナス、テルムス及び
アグロバクテリウム。分割に関与する酵素をコードする
遺伝子の完全な構成は今まで３種の生物に関してのみ記
載されているにすぎない。更に酵素をコードする構造遺
伝子はいわゆるｈｙｕ−遺伝子クラスター（ｈｙｕは
“ヒダントイン利用性”を表す；Watabe et al., J. ba
cteriol. 1992, 174, 3461-66; ibid, 962-969による）
の形でゲノムＤＮＡ（アルスロバクター及びアグロバク
テリウム）又はプラスミド（シュードモナス）上に隣接
して配置されている。３種のｈｙｕ−遺伝子クラスター
の中でも、アグロバクテリウム及びシュードモナスはＤ
−選択的分割のための遺伝子を有し、かつアルスロバク
ターはＬ−選択的分割のための遺伝子を有する（Hils,
Dissertation Universitaet Stuttgart, 1998; Watabe
et al., s. o. ; Wiese, Dissertation Universitaet S
tuttgart, 2000, Verlag Ulrich Grauer）。
【００１１】同様に、生物アルスロバクター クリスタ
ロポイエテスＤＳＭ２０１１７はＤ−ヒダントイナーゼ
を有することは知られていた（Syldatk et al. in Jahr
buchBiotechnolorgie, Band 2, 1988/1989, Ed.: P. Pr
aeve）。該酵素のｎ末端配列を既に解明することができ
た（A. Marin, Dissertation Universitaet Stuttgart,
1997）。
ロポイエテスＤＳＭ２０１１７はＤ−ヒダントイナーゼ
を有することは知られていた（Syldatk et al. in Jahr
buchBiotechnolorgie, Band 2, 1988/1989, Ed.: P. Pr
aeve）。該酵素のｎ末端配列を既に解明することができ
た（A. Marin, Dissertation Universitaet Stuttgart,
1997）。
【００１２】今までは前記のヒダントイナーゼの製造を
組換形及び活性形で実施することができなかった（M. W
erner Dissertation, Universitaet Stuttgart 200
1）。
組換形及び活性形で実施することができなかった（M. W
erner Dissertation, Universitaet Stuttgart 200
1）。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は活性ヒ
ダントイナーゼの組み換え的な製造のための方法並びに
この方法によって得られる活性組み換えヒダントイナー
ゼを提供することである。
ダントイナーゼの組み換え的な製造のための方法並びに
この方法によって得られる活性組み換えヒダントイナー
ゼを提供することである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】前記課題は特許請求の範
囲によって解決される。請求項１はヒダントイナーゼの
組み換え的な製造方法に関する。請求項２及び３は本発
明による方法のための有利な実施形に関する。請求項４
はこうして得られるrec-ヒダントイナーゼを保護してい
るが、他方で請求項５は該酵素をコードする核酸に関す
る。請求項６は本発明による核酸を有する運搬体に関
し、請求項７は本発明による核酸とハイブリダイズする
核酸に関し、請求項８は有利なプライマーを保護してい
る。請求項９は本発明による核酸から出発するヒダント
イナーゼの改善のための方法に関し、それに対して請求
項１０は特定の改善されたrec-ヒダントイナーゼを含
む。請求項１１及び１２はrec-ヒダントイナーゼもしく
は本発明による核酸の特定の使用に関する。
囲によって解決される。請求項１はヒダントイナーゼの
組み換え的な製造方法に関する。請求項２及び３は本発
明による方法のための有利な実施形に関する。請求項４
はこうして得られるrec-ヒダントイナーゼを保護してい
るが、他方で請求項５は該酵素をコードする核酸に関す
る。請求項６は本発明による核酸を有する運搬体に関
し、請求項７は本発明による核酸とハイブリダイズする
核酸に関し、請求項８は有利なプライマーを保護してい
る。請求項９は本発明による核酸から出発するヒダント
イナーゼの改善のための方法に関し、それに対して請求
項１０は特定の改善されたrec-ヒダントイナーゼを含
む。請求項１１及び１２はrec-ヒダントイナーゼもしく
は本発明による核酸の特定の使用に関する。
【００１５】活性化されたrec-ヒダントイナーゼを、２
価の金属イオンの存在下でのrec-ヒダントイナーゼを形
成する微生物の発酵によって製造するための方法におい
て、発酵ブロスは活性化をもたらす濃度の金属イオン
（例えばＣｏ、Ｍｎ、Ｚｎ）を有し、通常の条件下に発
酵されるrec-ヒダントイナーゼを発現する微生物によっ
て形成されるrec-ヒダントイナーゼに対してより高い比
活性（活性化）を有するrec-ヒダントイナーゼが、意想
外に容易なそのために劣らず有利な種類及び様式で得ら
れる。本来は微生物の増殖に関して発酵の間に不利（よ
り長い増殖時間が必要とされる）な亜鉛イオンの濃度を
高めることが、かなりの活性向上をもたらすことは意想
外とみなされる。
価の金属イオンの存在下でのrec-ヒダントイナーゼを形
成する微生物の発酵によって製造するための方法におい
て、発酵ブロスは活性化をもたらす濃度の金属イオン
（例えばＣｏ、Ｍｎ、Ｚｎ）を有し、通常の条件下に発
酵されるrec-ヒダントイナーゼを発現する微生物によっ
て形成されるrec-ヒダントイナーゼに対してより高い比
活性（活性化）を有するrec-ヒダントイナーゼが、意想
外に容易なそのために劣らず有利な種類及び様式で得ら
れる。本来は微生物の増殖に関して発酵の間に不利（よ
り長い増殖時間が必要とされる）な亜鉛イオンの濃度を
高めることが、かなりの活性向上をもたらすことは意想
外とみなされる。
【００１６】従って有利には、発酵ブロスは活性向上を
もたらす亜鉛イオン濃度を有する。発酵ブロスに添加さ
れる金属イオン、特に亜鉛イオンの最適な濃度は当業者
によって慣例の実験をもとに調査できる。この濃度は一
方では本発明による活性化／活性向上が達成されるほど
高く選択されるべきであり、他方では該濃度は微生物の
増殖を更なる活性増大を生じることなく過度に阻害する
ほど高くないべきである。有利には発酵における金属イ
オン、例えば亜鉛イオンの濃度は≧３０マイクロモル／
ｌ、特に有利には≧５０マイクロモル／ｌ、かつ殊に有
利には≧８０マイクロモル／ｌに高められる。
もたらす亜鉛イオン濃度を有する。発酵ブロスに添加さ
れる金属イオン、特に亜鉛イオンの最適な濃度は当業者
によって慣例の実験をもとに調査できる。この濃度は一
方では本発明による活性化／活性向上が達成されるほど
高く選択されるべきであり、他方では該濃度は微生物の
増殖を更なる活性増大を生じることなく過度に阻害する
ほど高くないべきである。有利には発酵における金属イ
オン、例えば亜鉛イオンの濃度は≧３０マイクロモル／
ｌ、特に有利には≧５０マイクロモル／ｌ、かつ殊に有
利には≧８０マイクロモル／ｌに高められる。
【００１７】特に有利には考慮されるrec-ヒダントイナ
ーゼはアルスロバクター クリスタロポイエテスＤＳＭ
２０１１７由来のヒダントイナーゼである。
ーゼはアルスロバクター クリスタロポイエテスＤＳＭ
２０１１７由来のヒダントイナーゼである。
【００１８】他の実施態様においては、本発明は本発明
による方法によって得られるrec-ヒダントイナーゼに関
する。活性化された酵素及び活性化されていない酵素の
一次構造が一致しているにもかかわらず、発酵の間に亜
鉛イオン濃度を高めることは、恐らく、生じる酵素の二
次構造又は三次構造にタンパク質の比活性の改善が達成
されるほどの影響を及ぼすと仮定されている。
による方法によって得られるrec-ヒダントイナーゼに関
する。活性化された酵素及び活性化されていない酵素の
一次構造が一致しているにもかかわらず、発酵の間に亜
鉛イオン濃度を高めることは、恐らく、生じる酵素の二
次構造又は三次構造にタンパク質の比活性の改善が達成
されるほどの影響を及ぼすと仮定されている。
【００１９】他の態様において、本発明はアルスロバク
ター クリスタロポイエテスＤＳＭ２０１１７由来のヒ
ダントイナーゼをコードする核酸に関する。
ター クリスタロポイエテスＤＳＭ２０１１７由来のヒ
ダントイナーゼをコードする核酸に関する。
【００２０】アルスロバクター クリスタロポイエテス
ＤＳＭ２０１１７由来のＤ−ヒダントイナーゼをコード
する核酸を提供することによって、有利な種類及び方法
においてＤ−アミノ酸を産生するための酵素工学的なプ
ロセスに必須の酵素を十分な量で保障できる物質が得ら
れる。組み換え技術により核酸を使用して、迅速に増殖
する宿主生物から高い収率で酵素を得ることができる。
更に本発明による遺伝子配列は改善されたヒダントイナ
ーゼ突然変異体の作成のために使用される。
ＤＳＭ２０１１７由来のＤ−ヒダントイナーゼをコード
する核酸を提供することによって、有利な種類及び方法
においてＤ−アミノ酸を産生するための酵素工学的なプ
ロセスに必須の酵素を十分な量で保障できる物質が得ら
れる。組み換え技術により核酸を使用して、迅速に増殖
する宿主生物から高い収率で酵素を得ることができる。
更に本発明による遺伝子配列は改善されたヒダントイナ
ーゼ突然変異体の作成のために使用される。
【００２１】更なる態様においては、本発明は１つ以上
の本発明による核酸を有するプラスミド又はベクターに
関する。
の本発明による核酸を有するプラスミド又はベクターに
関する。
【００２２】プラスミド又はベクターとしては、原則的
にこの目的のために当業者に利用可能な全ての実施形が
該当する。かかるプラスミド及びベクターはシュトゥデ
ィアー（Studier）他のMethods Enzymol. 1990,185, 61
-69又はノヴァゲン(Novagen）社、プロメガ（Promeg
a）、ニューイングランドバイオラブス（New England b
iolabs）、クロンテック（Clontech）又はギブコ（Gibc
o）ＢＲＬのパンフレットに参照される。更に有利なプ
ラスミド及びベクターはＤＮＡクローニング：実践的ア
プローチ（a practical approach）．第Ｉ〜ＩＩＩ巻、
Ｄ．Ｍ．グローヴァー（Glover）編、ＩＲＬ出版Ｌｔ
ｄ．、オックスフォード、ワシントンＤＣ、１９８５、
１９８７；デンハルト（Denhardt），Ｄ．Ｔ．及びコラ
サンティ（Colasanti）、Ｊ．：Ｅ．ｃｏｌｉにおける
クローニングされたＤＮＡの発現調節のためのベクター
の調査（A survey of vectors for regulating express
ion ofcloned DNA in E.coli）、ロドリゲス（Rodrigue
z），Ｒ．Ｌ及びデンハルト，Ｄ．Ｔ．（編）、ベクタ
ー、Butterworth, Stoneham, MA, 1987, pp179-204；遺
伝子発現工学、ゲーデル（Goeddel），Ｄ．Ｖ（編）、
酵素学における方法（Methods in Enzymology）、第１
８５巻、アカデミック出版（Academic Press），Ｉｎ
ｃ、サンディアゴ、１９９０；サンブローク（Sambroo
k），Ｊ．、フリッチュ（Fritsch），Ｅ．Ｆ．及びマニ
アティス（Maniatis），Ｔ．１９８９．モレキュラーク
ローニング（Molecular cloning）：研究所マニュアル
（a laboratorymanual）、第２版．コールドスプリング
ハーバー研究所（Cold Spring Harbor Laboratory）出
版、コールドスプリングハーバー、Ｎ．Ｙに見いだすこ
とができる。
にこの目的のために当業者に利用可能な全ての実施形が
該当する。かかるプラスミド及びベクターはシュトゥデ
ィアー（Studier）他のMethods Enzymol. 1990,185, 61
-69又はノヴァゲン(Novagen）社、プロメガ（Promeg
a）、ニューイングランドバイオラブス（New England b
iolabs）、クロンテック（Clontech）又はギブコ（Gibc
o）ＢＲＬのパンフレットに参照される。更に有利なプ
ラスミド及びベクターはＤＮＡクローニング：実践的ア
プローチ（a practical approach）．第Ｉ〜ＩＩＩ巻、
Ｄ．Ｍ．グローヴァー（Glover）編、ＩＲＬ出版Ｌｔ
ｄ．、オックスフォード、ワシントンＤＣ、１９８５、
１９８７；デンハルト（Denhardt），Ｄ．Ｔ．及びコラ
サンティ（Colasanti）、Ｊ．：Ｅ．ｃｏｌｉにおける
クローニングされたＤＮＡの発現調節のためのベクター
の調査（A survey of vectors for regulating express
ion ofcloned DNA in E.coli）、ロドリゲス（Rodrigue
z），Ｒ．Ｌ及びデンハルト，Ｄ．Ｔ．（編）、ベクタ
ー、Butterworth, Stoneham, MA, 1987, pp179-204；遺
伝子発現工学、ゲーデル（Goeddel），Ｄ．Ｖ（編）、
酵素学における方法（Methods in Enzymology）、第１
８５巻、アカデミック出版（Academic Press），Ｉｎ
ｃ、サンディアゴ、１９９０；サンブローク（Sambroo
k），Ｊ．、フリッチュ（Fritsch），Ｅ．Ｆ．及びマニ
アティス（Maniatis），Ｔ．１９８９．モレキュラーク
ローニング（Molecular cloning）：研究所マニュアル
（a laboratorymanual）、第２版．コールドスプリング
ハーバー研究所（Cold Spring Harbor Laboratory）出
版、コールドスプリングハーバー、Ｎ．Ｙに見いだすこ
とができる。
【００２３】本発明による核酸を有する遺伝子構築物を
殊に有利な方法で宿主生物にクローニングできるプラス
ミドは：ｐＫＫ−１７７−３Ｈ（ロッヒェバイオケミカ
ルズ（Roche Biochemicals）、ｐＢＴａｃ（ロッヒェバ
イオケミカルズ）、ｐＫＫ−２３３（ストラタジーン
（Stratagene））又はｐＥＴ（ノヴァゲン）である。但
し、カナマイシン耐性が導入されたＴＯＰＯシリーズを
除いて、全ての他のプラスミドはアンピシリン耐性のた
めのβ−ラクタマーゼを有するべきである。更に有利な
プラスミドは以下のものである：
殊に有利な方法で宿主生物にクローニングできるプラス
ミドは：ｐＫＫ−１７７−３Ｈ（ロッヒェバイオケミカ
ルズ（Roche Biochemicals）、ｐＢＴａｃ（ロッヒェバ
イオケミカルズ）、ｐＫＫ−２３３（ストラタジーン
（Stratagene））又はｐＥＴ（ノヴァゲン）である。但
し、カナマイシン耐性が導入されたＴＯＰＯシリーズを
除いて、全ての他のプラスミドはアンピシリン耐性のた
めのβ−ラクタマーゼを有するべきである。更に有利な
プラスミドは以下のものである：
【００２４】
【表１】
【００２５】また本発明は本発明による核酸を有する微
生物に関する。
生物に関する。
【００２６】核酸をクローニングした微生物は十分な量
の組み換え酵素を増大及び獲得するために役に立つ。こ
のための方法は当業者によく知られている（サンブロー
ク他．１９８９、モレキュラークローニング：研究所マ
ニュアル、第２版、コールドスプリングハーバー研究所
出版、バルバス（Balbas）Ｐ及びボリヴァール（Boliva
r）Ｆ．１９９０、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現プラスミ
ドベクターのデザイン及び構築（Design and construct
ion of expressin plasmid vectors in E.coli）、Meth
ods Enzymology185、14-37）。微生物としては、原則的
にこの目的のために当業者に該当する全ての生物を用い
ることができる。有利にはＥ．ｃｏｌｉ株がこの目的の
ために使用されうる。より特に有利には：Ｅ．ｃｏｌｉ
ＮＭ５２２、ＪＭ１０９、ＪＭ１０５、ＲＲ１、ＤＨ５
α、ＴＯＰ１０-又はＨＢ１０１である。本発明による
核酸を有する遺伝子構築物を有利に宿主生物にクローニ
ングするプラスミドは更に前記のものである。
の組み換え酵素を増大及び獲得するために役に立つ。こ
のための方法は当業者によく知られている（サンブロー
ク他．１９８９、モレキュラークローニング：研究所マ
ニュアル、第２版、コールドスプリングハーバー研究所
出版、バルバス（Balbas）Ｐ及びボリヴァール（Boliva
r）Ｆ．１９９０、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現プラスミ
ドベクターのデザイン及び構築（Design and construct
ion of expressin plasmid vectors in E.coli）、Meth
ods Enzymology185、14-37）。微生物としては、原則的
にこの目的のために当業者に該当する全ての生物を用い
ることができる。有利にはＥ．ｃｏｌｉ株がこの目的の
ために使用されうる。より特に有利には：Ｅ．ｃｏｌｉ
ＮＭ５２２、ＪＭ１０９、ＪＭ１０５、ＲＲ１、ＤＨ５
α、ＴＯＰ１０-又はＨＢ１０１である。本発明による
核酸を有する遺伝子構築物を有利に宿主生物にクローニ
ングするプラスミドは更に前記のものである。
【００２７】また本発明はストリンジェントな条件下に
本発明による一本鎖の核酸又はその一本鎖の相補的な核
酸とハイブリダイズする核酸を含む。表現“ストリンジ
ェントな条件下”は本願ではサンブローク他の（モレキ
ュラークローニング、研究所マニュアル、コールドスプ
リングハーバー研究所出版（１９８９）、１．１０１−
１．１０４）で記載されるように使用される。有利には
１×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリ
ウム）によって５０℃、有利には５５℃、より有利には
６２℃、かつ殊に有利には６８℃で１時間の洗浄並びに
０．２×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳによって５０℃、
有利には５５℃、より有利には６２℃、かつ殊に有利に
は６８℃で１時間の洗浄の後になおも陽性のハイブリダ
イゼーションシグナルが観察される場合に本発明による
ストリンジェントなハイブリダイゼーションが存在す
る。
本発明による一本鎖の核酸又はその一本鎖の相補的な核
酸とハイブリダイズする核酸を含む。表現“ストリンジ
ェントな条件下”は本願ではサンブローク他の（モレキ
ュラークローニング、研究所マニュアル、コールドスプ
リングハーバー研究所出版（１９８９）、１．１０１−
１．１０４）で記載されるように使用される。有利には
１×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリ
ウム）によって５０℃、有利には５５℃、より有利には
６２℃、かつ殊に有利には６８℃で１時間の洗浄並びに
０．２×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳによって５０℃、
有利には５５℃、より有利には６２℃、かつ殊に有利に
は６８℃で１時間の洗浄の後になおも陽性のハイブリダ
イゼーションシグナルが観察される場合に本発明による
ストリンジェントなハイブリダイゼーションが存在す
る。
【００２８】本発明の更なる態様は本発明による遺伝子
配列を全ての種類のＰＣＲによって製造するためのプラ
イマーに関する。またこれには相応のアミノ酸配列をコ
ードするセンス−プライマー及びアンチセンス−プライ
マーも含まれる。
配列を全ての種類のＰＣＲによって製造するためのプラ
イマーに関する。またこれには相応のアミノ酸配列をコ
ードするセンス−プライマー及びアンチセンス−プライ
マーも含まれる。
【００２９】適当なプライマーは原則的に当業者に公知
の方法によって得ることができる。本発明によるプライ
マーの探索は公知のＤＮＡ配列との比較又は目測したア
ミノ酸配列を考慮される生物（例えばストレプトマイセ
スについては：ライト（Wright）他、遺伝子 １９９
２、１１３、５５〜６５）のコドンに翻訳することによ
って実施する。いわゆるスーパーファミリーのタンパク
質のアミノ酸配列における共通性も本願では利用される
（フィレスチン（Firestine）他、化学及び生物学（Che
mistry & Biology 1996, 3, 779-783）。それに関する
他の情報は、オリゴヌクレオチド合成：実践的アプロー
チ、Ｍ．Ｊ．ガイト（Gait）編、ＩＲＬ出版Ｌｔｄ、オ
ックスフォード ワシントンＤＣ、１９８４；ＰＣＲプ
ロトコール：方法及び適用のためのガイド（A guide to
methods and applications）、Ｍ．Ａ．イニス（Inni
s）、Ｄ．Ｈ．ゲルファウンド（Gelfound）、Ｊ．Ｊ．
シュニンスキー（Sninsky）及びＴ．Ｊ．ホワイト編、
アカデミック出版，ｉｎｃ．、サンディアゴ、１９９０
に見いだすことができる。更に以下のプライマーが有利
である：ＩＰＣＲのためのプライマー：
の方法によって得ることができる。本発明によるプライ
マーの探索は公知のＤＮＡ配列との比較又は目測したア
ミノ酸配列を考慮される生物（例えばストレプトマイセ
スについては：ライト（Wright）他、遺伝子 １９９
２、１１３、５５〜６５）のコドンに翻訳することによ
って実施する。いわゆるスーパーファミリーのタンパク
質のアミノ酸配列における共通性も本願では利用される
（フィレスチン（Firestine）他、化学及び生物学（Che
mistry & Biology 1996, 3, 779-783）。それに関する
他の情報は、オリゴヌクレオチド合成：実践的アプロー
チ、Ｍ．Ｊ．ガイト（Gait）編、ＩＲＬ出版Ｌｔｄ、オ
ックスフォード ワシントンＤＣ、１９８４；ＰＣＲプ
ロトコール：方法及び適用のためのガイド（A guide to
methods and applications）、Ｍ．Ａ．イニス（Inni
s）、Ｄ．Ｈ．ゲルファウンド（Gelfound）、Ｊ．Ｊ．
シュニンスキー（Sninsky）及びＴ．Ｊ．ホワイト編、
アカデミック出版，ｉｎｃ．、サンディアゴ、１９９０
に見いだすことができる。更に以下のプライマーが有利
である：ＩＰＣＲのためのプライマー：
【００３０】
【表２】
【００３１】構造遺伝子のクローニングのためのプライ
マー：
マー：
【００３２】
【表３】
【００３３】ラムノース発現ベクター中のＤＮＡの配列
決定のためのプライマー：
決定のためのプライマー：
【００３４】
【表４】
【００３５】更なる態様において、本発明は改善された
rec-ヒダントイナーゼの製造方法及びこうして得られる
rec-ヒダントイナーゼ又はこれをコードする核酸に関
し、その際、rec-ヒダントイナーゼをコードする本発明
による核酸から出発して、 ａ）該核酸に突然変異誘発を起こさせ、 ｂ）ａ）から得られる核酸を適当なベクターにクローニ
ングし、かつこれを適当な発現系に移送し、かつ ｃ）改善された活性及び／又は選択性を有する形成され
たタンパク質を検出及び単離する。
rec-ヒダントイナーゼの製造方法及びこうして得られる
rec-ヒダントイナーゼ又はこれをコードする核酸に関
し、その際、rec-ヒダントイナーゼをコードする本発明
による核酸から出発して、 ａ）該核酸に突然変異誘発を起こさせ、 ｂ）ａ）から得られる核酸を適当なベクターにクローニ
ングし、かつこれを適当な発現系に移送し、かつ ｃ）改善された活性及び／又は選択性を有する形成され
たタンパク質を検出及び単離する。
【００３６】突然変異誘発法によって本発明による酵素
を改善するための方法は当業者に十分に知られている。
突然変異誘発法としては、この目的のために当業者に利
用可能な全ての方法が該当する。特にこれらの方法は飽
和突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、シャフリング
法並びに部位特異的突然変異（文献、以下参照）であ
る。得られる新規の核酸配列を前記の方法に従って宿主
生物（文献、前記参照）中にクローニングし、かつ発現
された酵素を適当なスクリーニング法（ロバーツＪ（Ro
berts J.）、ステラＶ．Ｊ．（Stella V. J.）及びデセ
デューＣ．Ｊ．（Decedue C. J.）（１９８５）膵臓リ
パーゼの比色アッセイ：ゲル濾過によって分離されたリ
パーゼ及び補リパーゼの迅速検出（A colorimetric ass
ay of pancreatic lipase: rapid detection of lipase
and colipase separated by gel filtration）脂質（L
ipids）２０（１）：４２−４５；プラットＲ．Ｆ．（P
rattR.F.）、ファラシＷ．Ｓ．（Faraci W.S.）及びゴ
ヴァルダンＣ．Ｐ．（Govardhan C.P.）（１９８５）Ｄ
−アラニンカルボキシペプチダーゼ及びβ−ラクタマー
ゼのエステラーゼ活性のための直接的な分光測光的アッ
セイ（A direct spectrophotometric assay for D-alan
ine carboxypeptidases and for the esteraseactivity
of beta-lactamases）．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
１４４（１）：２０４−２０６；ブリュックナー（Brue
ckner）、Ｈ．、Ｒ．ヴィットナー（Wittner）、及び
Ｈ．ゴーデル（Godel）（１９９１）Ｎ−イソプロピル
−システインと一緒にフタルジアルデヒドで誘導体化さ
れたＤＬ−アミノ酸の完全に自動化された高性能液体ク
ロマトグラフィーによる分離（Fully automated high-p
erformance liquid chromatographic separation of DL
-amino acids derivatized with o-Phthaldialdehyde t
ogether with N-isopropyl-cysteine）．食品試料への
適用（Application to food samples））で検出する。
を改善するための方法は当業者に十分に知られている。
突然変異誘発法としては、この目的のために当業者に利
用可能な全ての方法が該当する。特にこれらの方法は飽
和突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、シャフリング
法並びに部位特異的突然変異（文献、以下参照）であ
る。得られる新規の核酸配列を前記の方法に従って宿主
生物（文献、前記参照）中にクローニングし、かつ発現
された酵素を適当なスクリーニング法（ロバーツＪ（Ro
berts J.）、ステラＶ．Ｊ．（Stella V. J.）及びデセ
デューＣ．Ｊ．（Decedue C. J.）（１９８５）膵臓リ
パーゼの比色アッセイ：ゲル濾過によって分離されたリ
パーゼ及び補リパーゼの迅速検出（A colorimetric ass
ay of pancreatic lipase: rapid detection of lipase
and colipase separated by gel filtration）脂質（L
ipids）２０（１）：４２−４５；プラットＲ．Ｆ．（P
rattR.F.）、ファラシＷ．Ｓ．（Faraci W.S.）及びゴ
ヴァルダンＣ．Ｐ．（Govardhan C.P.）（１９８５）Ｄ
−アラニンカルボキシペプチダーゼ及びβ−ラクタマー
ゼのエステラーゼ活性のための直接的な分光測光的アッ
セイ（A direct spectrophotometric assay for D-alan
ine carboxypeptidases and for the esteraseactivity
of beta-lactamases）．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
１４４（１）：２０４−２０６；ブリュックナー（Brue
ckner）、Ｈ．、Ｒ．ヴィットナー（Wittner）、及び
Ｈ．ゴーデル（Godel）（１９９１）Ｎ−イソプロピル
−システインと一緒にフタルジアルデヒドで誘導体化さ
れたＤＬ−アミノ酸の完全に自動化された高性能液体ク
ロマトグラフィーによる分離（Fully automated high-p
erformance liquid chromatographic separation of DL
-amino acids derivatized with o-Phthaldialdehyde t
ogether with N-isopropyl-cysteine）．食品試料への
適用（Application to food samples））で検出する。
【００３７】また本発明は、カルバモイルアミノ酸もし
くはアミノ酸の製造のために、場合により突然変異誘発
によって改善された本発明によるrec-ヒダントイナーゼ
の使用することに関する。
くはアミノ酸の製造のために、場合により突然変異誘発
によって改善された本発明によるrec-ヒダントイナーゼ
の使用することに関する。
【００３８】更に本発明による及び更に改善された、考
慮されるrec-ヒダントイナーゼをコードする核酸は、有
利には全細胞触媒の製造のために適当である（ＤＥ１０
０３７１１５．９号並びにそこに引用される文献）。
慮されるrec-ヒダントイナーゼをコードする核酸は、有
利には全細胞触媒の製造のために適当である（ＤＥ１０
０３７１１５．９号並びにそこに引用される文献）。
【００３９】従って本発明による核酸はrec-ヒダントイ
ナーゼの製造のために使用できる。当業者に十分に知ら
れている組み換え技術によって、考慮される酵素を工業
的プロセスのために十分な量で利用できる生物がもたら
される。本発明によるrec-酵素の製造は当業者に公知の
遺伝子工学的方法によって実施される（サンブローク
Ｊ、フリッチュＥＦ、マニアティスＴ（１９８９）．モ
レキュラークローニング．コールドスプリングハーバー
研究所出版；ベクター：分子クローニングベクターの調
査及びその使用（A Survey of Molecular Cloning Vect
ors and Their Uses）．Ｒ．Ｌ．ロドリゲス及びＤ．
Ｔ．デンハルト編：２０５−２２５）。一般的な方法
（ＰＣＲ及びフュージョンＰＣＲ（FusionsPCR）、イン
バースＰＣＲ（inverse PCR）、クローニング、発現な
ど）に関しては以下の文献及びそこに引用される文献に
示される：リレイＪ（Riley J）、ブットラーＲ（Butle
r R）、フィニアールＲ（Finniear R）、イェナーＤ（J
enner D）、パウエルＳ（PowellS）、アナンドＲ（Anan
d R）、スミスＪＣ（Smith JC）、マークハムＡＦ（Mar
kham AF）（１９９０）．酵母人工染色体（ＹＡＣ）ク
ローンからの末端配列の単離のための新規の迅速な方法
（A novel, rapid method for the isolation oftermin
al sequences from yeast artificial chromosome (YA
C) clones）．Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８、８
１８６；トリグリアＴ（Triglia T）、ピーターソンＭ
Ｇ（Peterson MG）、ケンプＤＪ（Kemp DJ）（１９８
８）．公知の配列の境界外にあるＤＮＡセグメントのイ
ンビトロ増幅の手順（A procedue forin vitro amplifi
cation of DNA segments that lie outside the bounda
riesof known sequences）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．１６、８１８６；サンブロークＪ、フリッ
チュＥＦ、マニアティスＴ（１９８９）．モレキュラー
クローニング．コールドスプリングハーバー研究所出
版；ベクター：分子クローニングベクターの調査及びそ
の使用．Ｒ．Ｌ．ロドリゲス及びＤ．Ｔ．デンハルト、
ＩＩ）。
ナーゼの製造のために使用できる。当業者に十分に知ら
れている組み換え技術によって、考慮される酵素を工業
的プロセスのために十分な量で利用できる生物がもたら
される。本発明によるrec-酵素の製造は当業者に公知の
遺伝子工学的方法によって実施される（サンブローク
Ｊ、フリッチュＥＦ、マニアティスＴ（１９８９）．モ
レキュラークローニング．コールドスプリングハーバー
研究所出版；ベクター：分子クローニングベクターの調
査及びその使用（A Survey of Molecular Cloning Vect
ors and Their Uses）．Ｒ．Ｌ．ロドリゲス及びＤ．
Ｔ．デンハルト編：２０５−２２５）。一般的な方法
（ＰＣＲ及びフュージョンＰＣＲ（FusionsPCR）、イン
バースＰＣＲ（inverse PCR）、クローニング、発現な
ど）に関しては以下の文献及びそこに引用される文献に
示される：リレイＪ（Riley J）、ブットラーＲ（Butle
r R）、フィニアールＲ（Finniear R）、イェナーＤ（J
enner D）、パウエルＳ（PowellS）、アナンドＲ（Anan
d R）、スミスＪＣ（Smith JC）、マークハムＡＦ（Mar
kham AF）（１９９０）．酵母人工染色体（ＹＡＣ）ク
ローンからの末端配列の単離のための新規の迅速な方法
（A novel, rapid method for the isolation oftermin
al sequences from yeast artificial chromosome (YA
C) clones）．Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８、８
１８６；トリグリアＴ（Triglia T）、ピーターソンＭ
Ｇ（Peterson MG）、ケンプＤＪ（Kemp DJ）（１９８
８）．公知の配列の境界外にあるＤＮＡセグメントのイ
ンビトロ増幅の手順（A procedue forin vitro amplifi
cation of DNA segments that lie outside the bounda
riesof known sequences）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．１６、８１８６；サンブロークＪ、フリッ
チュＥＦ、マニアティスＴ（１９８９）．モレキュラー
クローニング．コールドスプリングハーバー研究所出
版；ベクター：分子クローニングベクターの調査及びそ
の使用．Ｒ．Ｌ．ロドリゲス及びＤ．Ｔ．デンハルト、
ＩＩ）。
【００４０】前記に示されるように本発明による核酸は
本願のヒダントイナーゼの新規の突然変異体の作成のた
めに利用できる。かかる突然変異体は、公知の突然変異
種によって本発明によるＤＮＡから得ることができる。
有利に使用される突然変異種は、以下の文献箇所に触れ
られている：（アイゲンＭ（Eigen M）及びガーディン
ガーＷ（Gardinger W）．（１９８４）ＲＮＡ複製に基
づく進化分子工学（Evolutionary molecular engineeri
ng based on RNA replication）．Ｐｕｒｅ＆Ａｐｐ
ｌ．Ｃｈｅｍ．５６（８）、９６７−９７８；チェン及
びアーノルド（Chen& Arnold）（１９９１）非水性溶剤
のための酵素工学（Enzyme engineering for nonaqueou
s solvents）：ランダム突然変異誘発による極性有機媒
体中でのサブチリシンＥ活性の増強（random mutagenes
is to enhance activity of subtilisin E in polar or
ganic media）．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９、１
０７３−１０７７；ホルヴィッツＭ（Horwitz,M）及び
Ｌ．レーブ（L. Loeb）（１９８６）“無作為なＤＮＡ
配列から選択されたプロモーター（Promotoers Selecte
d From Random DNA-Sequences）”米国国立科学アカデ
ミーの会報（ProceedingsOf The National Academy Of
Sciences Of The United States Of America）８３（１
９）：７４０５−７４０９；デューベＤ（Dube, D）及
びＬ．レーブ（１９８９）“β−ラクタマーゼの活性部
位にランダムなオリゴヌクレオチドを挿入することによ
って作成した突然変異体（Mutants Generated By The I
nsertion Of Random Oligonucleotides Into The Activ
e-Site Of The Beta-Lactamase Gene）”生化学（Bioch
emistry）２８（１４）：５７０３−５７０７；ステマ
ーＰＣ（Stemmer PC）（１９９４）．ＤＮＡシャフリン
グによるインビトロでの迅速なタンパク質の進化（Rapi
d evolusion of a protein in virto by DNA shufflin
g）．ネイチャー．３７０；３８９−３９１及びステマ
ーＰＣ（１９９４）無作為な断片化及び再整列によるＤ
ＮＡシャフリング（DNA shuffling by random fragment
ation and reassembly）：分子進化のためのインビトロ
組み換え（In vitro recombination for molecular evo
lution）．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ ＡｃａｄＳｃｉ ＵＳ
Ａ．９１；１０７４７−１０７５１）。
本願のヒダントイナーゼの新規の突然変異体の作成のた
めに利用できる。かかる突然変異体は、公知の突然変異
種によって本発明によるＤＮＡから得ることができる。
有利に使用される突然変異種は、以下の文献箇所に触れ
られている：（アイゲンＭ（Eigen M）及びガーディン
ガーＷ（Gardinger W）．（１９８４）ＲＮＡ複製に基
づく進化分子工学（Evolutionary molecular engineeri
ng based on RNA replication）．Ｐｕｒｅ＆Ａｐｐ
ｌ．Ｃｈｅｍ．５６（８）、９６７−９７８；チェン及
びアーノルド（Chen& Arnold）（１９９１）非水性溶剤
のための酵素工学（Enzyme engineering for nonaqueou
s solvents）：ランダム突然変異誘発による極性有機媒
体中でのサブチリシンＥ活性の増強（random mutagenes
is to enhance activity of subtilisin E in polar or
ganic media）．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９、１
０７３−１０７７；ホルヴィッツＭ（Horwitz,M）及び
Ｌ．レーブ（L. Loeb）（１９８６）“無作為なＤＮＡ
配列から選択されたプロモーター（Promotoers Selecte
d From Random DNA-Sequences）”米国国立科学アカデ
ミーの会報（ProceedingsOf The National Academy Of
Sciences Of The United States Of America）８３（１
９）：７４０５−７４０９；デューベＤ（Dube, D）及
びＬ．レーブ（１９８９）“β−ラクタマーゼの活性部
位にランダムなオリゴヌクレオチドを挿入することによ
って作成した突然変異体（Mutants Generated By The I
nsertion Of Random Oligonucleotides Into The Activ
e-Site Of The Beta-Lactamase Gene）”生化学（Bioch
emistry）２８（１４）：５７０３−５７０７；ステマ
ーＰＣ（Stemmer PC）（１９９４）．ＤＮＡシャフリン
グによるインビトロでの迅速なタンパク質の進化（Rapi
d evolusion of a protein in virto by DNA shufflin
g）．ネイチャー．３７０；３８９−３９１及びステマ
ーＰＣ（１９９４）無作為な断片化及び再整列によるＤ
ＮＡシャフリング（DNA shuffling by random fragment
ation and reassembly）：分子進化のためのインビトロ
組み換え（In vitro recombination for molecular evo
lution）．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ ＡｃａｄＳｃｉ ＵＳ
Ａ．９１；１０７４７−１０７５１）。
【００４１】４３％のアミノ酸の同一性に関して、本発
明によるヒダントイナーゼのための遺伝子はストレプト
マイセス コエリカラー（Streptomyces coelicolor）由
来の今まで機能が確認できなかった仮定的タンパク質に
対する非常に高いホモロジーを有する（Ｔ２８６８
５）。バシラス ステアロサーモフィルス（ＪＣ２３１
０：ムコハラ（Mukohara）他、１９９４）、アグロバク
テリウム ラジオバクターＮＲＲＬＢ１１２９１（Ｑ４
４１８４：グリファンチニ（Grifantini）他、１９９
６）及びシュードモナス（シュトヴァー（Stover）他、
２０００、ラポインテ（La Pointe）他、１９９８）由
来のジヒドロピリミジナーゼに対して４０％、４２％及
び３９％の同一性が存在する。
明によるヒダントイナーゼのための遺伝子はストレプト
マイセス コエリカラー（Streptomyces coelicolor）由
来の今まで機能が確認できなかった仮定的タンパク質に
対する非常に高いホモロジーを有する（Ｔ２８６８
５）。バシラス ステアロサーモフィルス（ＪＣ２３１
０：ムコハラ（Mukohara）他、１９９４）、アグロバク
テリウム ラジオバクターＮＲＲＬＢ１１２９１（Ｑ４
４１８４：グリファンチニ（Grifantini）他、１９９
６）及びシュードモナス（シュトヴァー（Stover）他、
２０００、ラポインテ（La Pointe）他、１９９８）由
来のジヒドロピリミジナーゼに対して４０％、４２％及
び３９％の同一性が存在する。
【００４２】真核性のジヒドロピリミジナーゼ（ムス
ムスクルス（Mus musculus）、ホモサピエンス及びラッ
タス ノルヴェギクス（Rattus norvegicus）及びコラプ
シン応答媒介タンパク質３（ＣＲＭＰ−３）に対するホ
モロジーの他に種々のアラントイナーゼ及びジヒドロオ
ロターゼに対するホモロジーも存在する。
ムスクルス（Mus musculus）、ホモサピエンス及びラッ
タス ノルヴェギクス（Rattus norvegicus）及びコラプ
シン応答媒介タンパク質３（ＣＲＭＰ−３）に対するホ
モロジーの他に種々のアラントイナーゼ及びジヒドロオ
ロターゼに対するホモロジーも存在する。
【００４３】アルスロバクター アウレッセンスＤＳＭ
３７４５（メイ（May）他、ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９
９８、３７９、７４３−７４７）及びＤＳＭ３７４７
（ヴィーゼ（Wiese）、論文 シュトゥットガルト大学、
２０００）由来のＬ−ヒダントイナーゼに対して２９％
の同一性が存在する。
３７４５（メイ（May）他、ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９
９８、３７９、７４３−７４７）及びＤＳＭ３７４７
（ヴィーゼ（Wiese）、論文 シュトゥットガルト大学、
２０００）由来のＬ−ヒダントイナーゼに対して２９％
の同一性が存在する。
【００４４】光学的に濃縮された（エナンチオマー濃縮
された、エナンチオマーを濃縮した）化合物とは本発明
の範囲においては光学対掌体ともう一方の光学対掌体＞
５０モル％との混合物の存在を意味する。
された、エナンチオマーを濃縮した）化合物とは本発明
の範囲においては光学対掌体ともう一方の光学対掌体＞
５０モル％との混合物の存在を意味する。
【００４５】ヒダントイナーゼとは、２，４−ジオキソ
イミダゾリジンから誘導される化合物を示し、これらの
化合物は５位においてアミノ酸のα−残基から誘導でき
る基によって置換されている。
イミダゾリジンから誘導される化合物を示し、これらの
化合物は５位においてアミノ酸のα−残基から誘導でき
る基によって置換されている。
【００４６】アミノ酸のα−残基とは、α−アミノ酸の
α−Ｃ原子上に存在する基を意味する。これは、天然ア
ミノ酸からベイヤー−ヴァルター（Beyer-Walter）の有
機化学の教科書（Lehrbuch der organischen Chemi
e）、Ｓ．ヒルツェル（Hirzel）出版 シュトゥットガル
ト、第２２巻、１９９１、第８２２頁以降に示されるよ
うに誘導できる。しかしながら更にまた例えばＤＥ１９
９０３２６８．８号に列挙されるような非天然α−アミ
ノ酸の相応のα−残基を示す。
α−Ｃ原子上に存在する基を意味する。これは、天然ア
ミノ酸からベイヤー−ヴァルター（Beyer-Walter）の有
機化学の教科書（Lehrbuch der organischen Chemi
e）、Ｓ．ヒルツェル（Hirzel）出版 シュトゥットガル
ト、第２２巻、１９９１、第８２２頁以降に示されるよ
うに誘導できる。しかしながら更にまた例えばＤＥ１９
９０３２６８．８号に列挙されるような非天然α−アミ
ノ酸の相応のα−残基を示す。
【００４７】生物アルスロバクター クリスタロポイエ
テスＤＳＭ２０１１７はドイツ微生物および細胞培養保
存機関（Deutschen Sammlung fuer Mikroorganismen un
d Zellkulturen）において相応の番号で寄託され、かつ
公共的に入手できる。
テスＤＳＭ２０１１７はドイツ微生物および細胞培養保
存機関（Deutschen Sammlung fuer Mikroorganismen un
d Zellkulturen）において相応の番号で寄託され、かつ
公共的に入手できる。
【００４８】概念“活性化された”又は“活性化”は特
許請求の範囲によれば本発明によるrec-酵素が活性化さ
れていないrec-酵素に対して同じＯＤ６００において少
なくとも１．５倍、有利には２倍、特に有利には５倍だ
け高い活性（例ＶＩによる測定条件）を細胞抽出物（１
５０００p.s.i.、６０秒、１００００r.p.m.での４℃に
おける１０分間の遠心分離後の上清）中で示すように理
解される。
許請求の範囲によれば本発明によるrec-酵素が活性化さ
れていないrec-酵素に対して同じＯＤ６００において少
なくとも１．５倍、有利には２倍、特に有利には５倍だ
け高い活性（例ＶＩによる測定条件）を細胞抽出物（１
５０００p.s.i.、６０秒、１００００r.p.m.での４℃に
おける１０分間の遠心分離後の上清）中で示すように理
解される。
【００４９】核酸という概念とは、一本鎖又は二本鎖の
ＤＮＡ並びにＲＮＡ又はそれらの混合物の全ての種類を
含む。
ＤＮＡ並びにＲＮＡ又はそれらの混合物の全ての種類を
含む。
【００５０】改善されたrec-ヒダントイナーゼとは、特
許請求の範囲によれば、特に改変された基質範囲を有
し、より活性であり、かつ／又は選択的であるか、又は
使用される反応条件下により安定性であるヒダントイナ
ーゼを意味する。
許請求の範囲によれば、特に改変された基質範囲を有
し、より活性であり、かつ／又は選択的であるか、又は
使用される反応条件下により安定性であるヒダントイナ
ーゼを意味する。
【００５１】特許請求の範囲により保護されたタンパク
質配列及び核酸配列の中でも、本発明によればこれらの
配列に対して、かかる配列の作用様式もしくは用途が保
持されている場合は８０％より高い、有利には９０％よ
り高い、９１％、９２％、９３％又は９４％、より有利
には９５％又は９６％より高い、かつ特に有利には９７
％より高い、９８％、９９％のホモロジー（自明の縮重
を除く）を有する。本願で使用されるような表現“ホモ
ロジー”（又は同一性）は方程式Ｈ（％）＝［１−Ｖ／
Ｘ］×１００によって定義でき、式中のＨはホモロジー
を意味し、Ｘは比較配列の核塩基／アミノ酸の総数であ
り、かつＶは比較配列に対する考慮されるべき配列の種
々の核塩基／アミノ酸配列の数である。
質配列及び核酸配列の中でも、本発明によればこれらの
配列に対して、かかる配列の作用様式もしくは用途が保
持されている場合は８０％より高い、有利には９０％よ
り高い、９１％、９２％、９３％又は９４％、より有利
には９５％又は９６％より高い、かつ特に有利には９７
％より高い、９８％、９９％のホモロジー（自明の縮重
を除く）を有する。本願で使用されるような表現“ホモ
ロジー”（又は同一性）は方程式Ｈ（％）＝［１−Ｖ／
Ｘ］×１００によって定義でき、式中のＨはホモロジー
を意味し、Ｘは比較配列の核塩基／アミノ酸の総数であ
り、かつＶは比較配列に対する考慮されるべき配列の種
々の核塩基／アミノ酸配列の数である。
【００５２】
【実施例】例：
Ｉ． アルスロバクター クリスタロポイエテスＤＳＭ
２０１１７のバイオマス採収 全細胞活性試験、染色体ＤＮＡの単離及びＤ−ヒダント
イナーゼの酵素単離のための出発材料として、まず生理
学的に均一なアルスロバクター クリスタロポイエテス
ＤＳＭ２０１１７の細胞材料を十分な量で準備すべきで
あった。ブランス（Brans）（博士論文、ＴＵ ブラウン
シュヴァイク１９９１）の操作に従って、このために炭
素源としてＤ，Ｌ−ラクテートを含有し、他の成分とし
て酵母抽出物及び培養のためのインデューサーとしてヒ
ダントインを含有する半合成培地を５０リットルのバイ
オリアクター中で使用した： 第１表：このデータは１ｌの栄養溶液に対するものであ
る
２０１１７のバイオマス採収 全細胞活性試験、染色体ＤＮＡの単離及びＤ−ヒダント
イナーゼの酵素単離のための出発材料として、まず生理
学的に均一なアルスロバクター クリスタロポイエテス
ＤＳＭ２０１１７の細胞材料を十分な量で準備すべきで
あった。ブランス（Brans）（博士論文、ＴＵ ブラウン
シュヴァイク１９９１）の操作に従って、このために炭
素源としてＤ，Ｌ−ラクテートを含有し、他の成分とし
て酵母抽出物及び培養のためのインデューサーとしてヒ
ダントインを含有する半合成培地を５０リットルのバイ
オリアクター中で使用した： 第１表：このデータは１ｌの栄養溶液に対するものであ
る
【００５３】
【表５】
【００５４】第１の前培養（Ｖ＝２０ｍｌ）を３０℃及
び１１０ｒｐｍで一晩インキュベートした。引き続きこ
の前培養全体を第２の前培養（Ｖ＝２ｌ）への接種のた
めに使用した。２日間のインキュベート後に１．５ｌの
第２の前培養を発酵（Ｖ＝２０ｌ）のための接種材料と
して使用した。増殖の間にインデューサーとしてのヒダ
ントインが消費されるので、これを供給ポンプによって
連続的に計量供給したので、ヒダントイン濃度は培地中
に一定で０．２ｇ／ｌであった。細胞の回収の後に２０
５ｇのＢＦＭのアリコートを取り、かつ−２０℃で貯蔵
した。
び１１０ｒｐｍで一晩インキュベートした。引き続きこ
の前培養全体を第２の前培養（Ｖ＝２ｌ）への接種のた
めに使用した。２日間のインキュベート後に１．５ｌの
第２の前培養を発酵（Ｖ＝２０ｌ）のための接種材料と
して使用した。増殖の間にインデューサーとしてのヒダ
ントインが消費されるので、これを供給ポンプによって
連続的に計量供給したので、ヒダントイン濃度は培地中
に一定で０．２ｇ／ｌであった。細胞の回収の後に２０
５ｇのＢＦＭのアリコートを取り、かつ−２０℃で貯蔵
した。
【００５５】ＩＩ． アルスロバクター クリスタロポ
イエテスＤＳＭ２０１１７からのＤ−ヒダントイナーゼ
の精製 アルスロバクター クリスタロポイエテスＤＳＭ２０１
１７由来のＤ−ヒダントイナーゼの精製のためのプロト
コールはマリン（博士論文、シュトゥットガルト大学１
９９７）によって記載されたＤ−ヒダントイナーゼのタ
ンパク質精製をもとに幾つかの変更を加えて定めた。精
製工程は、可能であれば４℃で実施し、かつ分画のヒダ
ントイナーゼ活性の測定はまずエールリッヒ（Ehrlic
h）による測光検査による迅速試験において実施した。
陽性の試料のアリコートを引き続きスタンダード基質
Ｄ，Ｌ−ベンジルヒダントインと一緒にインキュベート
し、かつ正確な活性をＨＰＬＣによって測定した。
イエテスＤＳＭ２０１１７からのＤ−ヒダントイナーゼ
の精製 アルスロバクター クリスタロポイエテスＤＳＭ２０１
１７由来のＤ−ヒダントイナーゼの精製のためのプロト
コールはマリン（博士論文、シュトゥットガルト大学１
９９７）によって記載されたＤ−ヒダントイナーゼのタ
ンパク質精製をもとに幾つかの変更を加えて定めた。精
製工程は、可能であれば４℃で実施し、かつ分画のヒダ
ントイナーゼ活性の測定はまずエールリッヒ（Ehrlic
h）による測光検査による迅速試験において実施した。
陽性の試料のアリコートを引き続きスタンダード基質
Ｄ，Ｌ−ベンジルヒダントインと一緒にインキュベート
し、かつ正確な活性をＨＰＬＣによって測定した。
【００５６】培養から得られるアルスロバクター クリ
スタロポイエテスＤＳＭ２０１１７のバイオマス（Ｉ参
照）をまず３０％の細胞懸濁液として、攪拌ボールミル
中でガラスビーズによって破砕した。破砕動力学を取っ
た後に２０分の破砕時間後に１６．５ｇ／ｌまでのタン
パク質濃度を達成できた。次いで細胞の残骸及び未溶解
の成分を遠心分離によって分離し、かつ澄明な上清を後
続の硫酸プロタミン沈殿のために使用した。これによっ
て、吸着流動床−ＤＥＡＥ−カラムクロマトグラフィー
の前に溶液の粘度を低下させることができた。
スタロポイエテスＤＳＭ２０１１７のバイオマス（Ｉ参
照）をまず３０％の細胞懸濁液として、攪拌ボールミル
中でガラスビーズによって破砕した。破砕動力学を取っ
た後に２０分の破砕時間後に１６．５ｇ／ｌまでのタン
パク質濃度を達成できた。次いで細胞の残骸及び未溶解
の成分を遠心分離によって分離し、かつ澄明な上清を後
続の硫酸プロタミン沈殿のために使用した。これによっ
て、吸着流動床−ＤＥＡＥ−カラムクロマトグラフィー
の前に溶液の粘度を低下させることができた。
【００５７】カラムに結合されたタンパク質を塩化ナト
リウム勾配によって溶出させた。活性のプールされた吸
着流動床分画に同じ容量の２Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４溶
液を混合して、引き続きこれらを疎水性の相互作用クロ
マトグラフィー（ＨＩＣ）を使用して更に分離した。非
常に高いヒダントイン活性を有する分画を引き続き合
し、かつＭｏｎｏＱカラムでのアニオン交換クロマトグ
ラフィーによって他のタンパク質から分離した。
リウム勾配によって溶出させた。活性のプールされた吸
着流動床分画に同じ容量の２Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４溶
液を混合して、引き続きこれらを疎水性の相互作用クロ
マトグラフィー（ＨＩＣ）を使用して更に分離した。非
常に高いヒダントイン活性を有する分画を引き続き合
し、かつＭｏｎｏＱカラムでのアニオン交換クロマトグ
ラフィーによって他のタンパク質から分離した。
【００５８】ヒダントイナーゼの精製のためのデータを
第２表にまとめ、精製されたＤ−ヒダントイナーゼのＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥによって該酵素に関して５０±５ｋＤａ
の分子量が得られた［ＭｏｎｏＱ−分画の濃縮後の精製
されたＤ−ヒダントイナーゼの１０％のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ、分子量マーカー プロシーヴ（ProSieve）及び４
９．７ｋＤａの内部標準としてのＡ．アウレッセンスＤ
ＳＭ３７４５由来のＬ−ヒダントイナーゼ（メイ、論文
シュトゥットガルト大学、１９９８）］。
第２表にまとめ、精製されたＤ−ヒダントイナーゼのＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥによって該酵素に関して５０±５ｋＤａ
の分子量が得られた［ＭｏｎｏＱ−分画の濃縮後の精製
されたＤ−ヒダントイナーゼの１０％のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ、分子量マーカー プロシーヴ（ProSieve）及び４
９．７ｋＤａの内部標準としてのＡ．アウレッセンスＤ
ＳＭ３７４５由来のＬ−ヒダントイナーゼ（メイ、論文
シュトゥットガルト大学、１９９８）］。
【００５９】第２表：Ｄ−ヒダントイナーゼのための精
製データ
製データ
【００６０】
【表６】
【００６１】ＩＩＩ． Ｄ−ヒダントイナーゼの典型的
な消化 Ｎ−末端配列決定は、最初の３０個のアミノ酸に関して
のみ確実な配列結果を提供する。マリンの論文に挙げら
れる配列はプライマーから誘導できなかった。従って該
タンパク質を更なる配列情報のためにタンパク質消化に
よって幾つかのペプチドに分解せねばならなかった。酵
素による断片化のためにトリプシンと一緒に、特異的に
アミノ酸のリジン及びアルギニンで切断するエンドペプ
チダーゼを使用した。但し、酸性のアミノ酸が追従する
場合に活性の低減が考えられ、かつプロリン基が追従す
る場合には加水分解が生じないことが考えられる。タン
パク質中に５．７％もしくは５．４％のリジン及びアル
ギニンが平均的に存在する場合に、完全な消化によって
約９個のアミノ酸の平均的ペプチド長が考えられる。引
き続きペプチド混合物の分離は分取ＨＰＬＣによって実
施した。
な消化 Ｎ−末端配列決定は、最初の３０個のアミノ酸に関して
のみ確実な配列結果を提供する。マリンの論文に挙げら
れる配列はプライマーから誘導できなかった。従って該
タンパク質を更なる配列情報のためにタンパク質消化に
よって幾つかのペプチドに分解せねばならなかった。酵
素による断片化のためにトリプシンと一緒に、特異的に
アミノ酸のリジン及びアルギニンで切断するエンドペプ
チダーゼを使用した。但し、酸性のアミノ酸が追従する
場合に活性の低減が考えられ、かつプロリン基が追従す
る場合には加水分解が生じないことが考えられる。タン
パク質中に５．７％もしくは５．４％のリジン及びアル
ギニンが平均的に存在する場合に、完全な消化によって
約９個のアミノ酸の平均的ペプチド長が考えられる。引
き続きペプチド混合物の分離は分取ＨＰＬＣによって実
施した。
【００６２】アルスロバクター クリスタロポイエテス
ＤＳＭ２０１１７由来のヒダントイナーゼをトリプシン
で消化するために、該ヒダントイナーゼを記載のように
ＭｏｎｏＱ−分画にまで精製し、引き続きアミコン（Am
icon）フィルタ（カットオフ３０ｋＤａ）で濃縮し、か
つＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分離した。タンパク質が
Ｄ−ヒダントイナーゼであることを確実にするために、
ゲルの一部をウェスタンブロットを介してメンブレン上
にトランスファーし、切り出し、かつＮ−末端で最初の
８個のアミノ酸を規定した。部位２を除いて全ての測定
されたアミノ酸はマリン（論文、シュトゥットガルト大
学、１９９７）によって記載されたＮ−末端と一致する
ので、ここで単離されたタンパク質がマリンによって既
に記載され、特徴付けられた酵素であるということから
出発した。
ＤＳＭ２０１１７由来のヒダントイナーゼをトリプシン
で消化するために、該ヒダントイナーゼを記載のように
ＭｏｎｏＱ−分画にまで精製し、引き続きアミコン（Am
icon）フィルタ（カットオフ３０ｋＤａ）で濃縮し、か
つＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分離した。タンパク質が
Ｄ−ヒダントイナーゼであることを確実にするために、
ゲルの一部をウェスタンブロットを介してメンブレン上
にトランスファーし、切り出し、かつＮ−末端で最初の
８個のアミノ酸を規定した。部位２を除いて全ての測定
されたアミノ酸はマリン（論文、シュトゥットガルト大
学、１９９７）によって記載されたＮ−末端と一致する
ので、ここで単離されたタンパク質がマリンによって既
に記載され、特徴付けられた酵素であるということから
出発した。
【００６３】従ってヒダントイナーゼ−バンドを分離さ
れたＭｏｎｏＱ分画のポリアクリルアミドゲルから直接
切り出し、かつその場で製造元（シグマ、シュタインハ
イム）の指示に従ってトリプシンによって消化させた。
これらのペプチドをアセトニトリルによってゲルから抽
出し、かつ分取ＨＰＬＣを使用して互いに分離させた。
これらの分画をＳｐｅｅｄ-ｖａｃ中で乾燥させ、かつ
引き続きＮ−末端でエドマン分解によって配列決定し
た。
れたＭｏｎｏＱ分画のポリアクリルアミドゲルから直接
切り出し、かつその場で製造元（シグマ、シュタインハ
イム）の指示に従ってトリプシンによって消化させた。
これらのペプチドをアセトニトリルによってゲルから抽
出し、かつ分取ＨＰＬＣを使用して互いに分離させた。
これらの分画をＳｐｅｅｄ-ｖａｃ中で乾燥させ、かつ
引き続きＮ−末端でエドマン分解によって配列決定し
た。
【００６４】全体的にＮ−末端の他に新規のペプチドを
一義的に配列決定できた。ペプチド断片の１つは、活性
中心における亜鉛原子の結合に関与する環式アミダーゼ
のコンセンサスモチーフＧＸＸＤＸＨＸＨを有する（Ab
endroth et al., Acta Cryst. 2000, D56, 1166-116
9）。リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で終わってい
ないペプチド配列の場合に、配列決定は技術的問題又は
試料の不適な質もしくは量に基づいて早期に中断する。
一義的に配列決定できた。ペプチド断片の１つは、活性
中心における亜鉛原子の結合に関与する環式アミダーゼ
のコンセンサスモチーフＧＸＸＤＸＨＸＨを有する（Ab
endroth et al., Acta Cryst. 2000, D56, 1166-116
9）。リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で終わってい
ないペプチド配列の場合に、配列決定は技術的問題又は
試料の不適な質もしくは量に基づいて早期に中断する。
【００６５】ＩＶ． ｈｙｕ−遺伝子クラスターのクロ
ーニング １． アルスロバクター クリスタロポイエテスＤＳＭ
２０１１７由来の染色体ＤＮＡの単離 ラクテート培地上でのアルスロバクター クリスタロポ
イエテスＤＳＭ２０１１７の培養によって得られる湿式
生体材料（Ｉ参照）は染色体ＤＮＡの単離のためにも使
用した。細胞溶解及び塩化セシウム−密度勾配遠心分離
による精製の後に、高純度のゲノムＤＮＡを単離でき
た。この質は吸収スペクトルを取ることによって調査
し、前記のように不純物をフェノールによって排除でき
た。測光的に測定されたＤＮＡ濃度は６０μｇＤＮＡ／
ｍｌであった。
ーニング １． アルスロバクター クリスタロポイエテスＤＳＭ
２０１１７由来の染色体ＤＮＡの単離 ラクテート培地上でのアルスロバクター クリスタロポ
イエテスＤＳＭ２０１１７の培養によって得られる湿式
生体材料（Ｉ参照）は染色体ＤＮＡの単離のためにも使
用した。細胞溶解及び塩化セシウム−密度勾配遠心分離
による精製の後に、高純度のゲノムＤＮＡを単離でき
た。この質は吸収スペクトルを取ることによって調査
し、前記のように不純物をフェノールによって排除でき
た。測光的に測定されたＤＮＡ濃度は６０μｇＤＮＡ／
ｍｌであった。
【００６６】ｃＤＮＡを制限消化のために使用し、かつ
ＰＣＲのための鋳型として使用した。
ＰＣＲのための鋳型として使用した。
【００６７】２． 縮重したプライマーでのＰＣＲ
トリプシンによる消化によって生じたペプチド（ＩＩＩ
参照）の配列決定によって、Ｄ−ヒダントイナーゼのＮ
−末端の他に更なる配列情報を得ることができた。これ
らのペプチドをプログラムＣｌｕｓｔａｌＸによってア
グロバクテリウム種ＩＰ Ｉ−６７１の公知のタンパク
質配列に適合させた（Thompson et al. 1997, Ｃｌｕｓ
ｔａｌＸウィンドウズ（登録商標）インターフェース：
クオリティー分析ツールによって支援される多重配列ア
ライメントのためのフレキシブルな戦略（ＴｈｅＣｌｕ
ｓｔａｌＸ ｗｉｎｄｏｗｓ （登録商標）ｉｎｔｅｒ
ｆａｃｅ： ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ
ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌ
ｉｇｎｍｅｎｔ ａｉｄｅｄ ｂｙ ｑｕａｌｉｔｙ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌｓ）．核酸リサーチ（Nucl
eic Acids Research. 24, 4876-4882）。
参照）の配列決定によって、Ｄ−ヒダントイナーゼのＮ
−末端の他に更なる配列情報を得ることができた。これ
らのペプチドをプログラムＣｌｕｓｔａｌＸによってア
グロバクテリウム種ＩＰ Ｉ−６７１の公知のタンパク
質配列に適合させた（Thompson et al. 1997, Ｃｌｕｓ
ｔａｌＸウィンドウズ（登録商標）インターフェース：
クオリティー分析ツールによって支援される多重配列ア
ライメントのためのフレキシブルな戦略（ＴｈｅＣｌｕ
ｓｔａｌＸ ｗｉｎｄｏｗｓ （登録商標）ｉｎｔｅｒ
ｆａｃｅ： ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ
ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌ
ｉｇｎｍｅｎｔ ａｉｄｅｄ ｂｙ ｑｕａｌｉｔｙ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌｓ）．核酸リサーチ（Nucl
eic Acids Research. 24, 4876-4882）。
【００６８】公知のペプチド配列から、縮重されたプラ
イマーを誘導するために、配列断片をアミノ酸組成にお
いて低い縮重度を有する２種のペプチドから選択すべき
である。このためにペプチド６１．６１及び７３．３１
を選択した。プライマー６１．６１ａはプラス鎖とペア
になり、かつプライマー７３．３１ｂはＤＮＡのマイナ
ス鎖とペアになる。
イマーを誘導するために、配列断片をアミノ酸組成にお
いて低い縮重度を有する２種のペプチドから選択すべき
である。このためにペプチド６１．６１及び７３．３１
を選択した。プライマー６１．６１ａはプラス鎖とペア
になり、かつプライマー７３．３１ｂはＤＮＡのマイナ
ス鎖とペアになる。
【００６９】第３表：縮重されたプライマーの構築
【００７０】
【表７】
【００７１】プライマー６１．６１ａの縮重度を更に低
減させるために、データバンクＣＵＴＧをベースにして
アルスロバクター種由来のコドンの頻度分布を考慮した
（Nakamura et al., Nucl. Acids Res. 1999, 27, 29
2）。そのため、このオリゴヌクレオチドの３位におい
て塩基トリプレット“ＧＴＡ”を、バリンに関するその
１０．４％という低いコドンの確率に基づいてプライマ
ー構築の際には無視した。
減させるために、データバンクＣＵＴＧをベースにして
アルスロバクター種由来のコドンの頻度分布を考慮した
（Nakamura et al., Nucl. Acids Res. 1999, 27, 29
2）。そのため、このオリゴヌクレオチドの３位におい
て塩基トリプレット“ＧＴＡ”を、バリンに関するその
１０．４％という低いコドンの確率に基づいてプライマ
ー構築の際には無視した。
【００７２】ＰＣＲアンプリコンの長さを見積もるため
に、アグロバクテリウム種ＩＰ Ｉ−６７１由来のＤ−
ヒダントイナーゼの両方のプライマーのアライメントを
実施した。アライメントにおいて、両方のオリゴの間の
間隔は６９個のアミノ酸であるので、これらの縮重プラ
イマー６１．６１ａ及び７３．３１ｂによるＰＣＲは約
２０７ｂｐのＰＣＲ産物をもたらすべきである。
に、アグロバクテリウム種ＩＰ Ｉ−６７１由来のＤ−
ヒダントイナーゼの両方のプライマーのアライメントを
実施した。アライメントにおいて、両方のオリゴの間の
間隔は６９個のアミノ酸であるので、これらの縮重プラ
イマー６１．６１ａ及び７３．３１ｂによるＰＣＲは約
２０７ｂｐのＰＣＲ産物をもたらすべきである。
【００７３】ＰＣＲはスタンダードバッチによる温度プ
ロフィールにおいて４２℃のアニーリング温度で処理
し、マグネシウム含量に関しては２ｍＭの濃度に最適化
した。ＰＣＲバッチを引き続き３％のアガロースゲルで
分離し、バンドのサイズをイメージ分析ソフトウェアＩ
ｍａｇｅｍａｓｔｅｒを使用して測定した（分子量マー
カー Ｄ−１５ ノヴェックス社（Firma Novex））。２
１８ｂｐの見積もられたサイズを有するバンドをゲルか
ら溶出させ、かつｐＣＲ ＴＯＰＯ ＢｌｕｎｔＩＩベク
ター（図１）にライゲーションした。得られるプラスミ
ドをｐＪＷ１と呼称する。引き続いてのベクターの配列
決定によって既に公知のジヒドロピリミジナーゼに対す
るホモロジーが得られるので、それによって第１のＤＮ
Ａ断片はＤ−ヒダントイナーゼの構造遺伝子にクローニ
ングされて存在する。
ロフィールにおいて４２℃のアニーリング温度で処理
し、マグネシウム含量に関しては２ｍＭの濃度に最適化
した。ＰＣＲバッチを引き続き３％のアガロースゲルで
分離し、バンドのサイズをイメージ分析ソフトウェアＩ
ｍａｇｅｍａｓｔｅｒを使用して測定した（分子量マー
カー Ｄ−１５ ノヴェックス社（Firma Novex））。２
１８ｂｐの見積もられたサイズを有するバンドをゲルか
ら溶出させ、かつｐＣＲ ＴＯＰＯ ＢｌｕｎｔＩＩベク
ター（図１）にライゲーションした。得られるプラスミ
ドをｐＪＷ１と呼称する。引き続いてのベクターの配列
決定によって既に公知のジヒドロピリミジナーゼに対す
るホモロジーが得られるので、それによって第１のＤＮ
Ａ断片はＤ−ヒダントイナーゼの構造遺伝子にクローニ
ングされて存在する。
【００７４】３． インバースＰＣＲによるｈｙｕ−遺
伝子クラスターの配列決定 隣接したＤＮＡ領域の更なる配列情報を得るために、イ
ンバースＰＣＲ（ＩＰＣＲ）の技術を使用した。
伝子クラスターの配列決定 隣接したＤＮＡ領域の更なる配列情報を得るために、イ
ンバースＰＣＲ（ＩＰＣＲ）の技術を使用した。
【００７５】アルスロバクター クリスタロポイエテス
ＤＳＭ２０１１７由来のゲノムＤＮＡの消化のために、
制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、Ｐｓｔ
Ｉ、ＢｇｌＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩ、ＭｕｎＩ
及びＭｌｕＩを使用した。これらの消化物を１％のアガ
ロースゲル上で分離し、サザンブロットによってナイロ
ンメンブレン上に固定した。
ＤＳＭ２０１１７由来のゲノムＤＮＡの消化のために、
制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、Ｐｓｔ
Ｉ、ＢｇｌＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩ、ＭｕｎＩ
及びＭｌｕＩを使用した。これらの消化物を１％のアガ
ロースゲル上で分離し、サザンブロットによってナイロ
ンメンブレン上に固定した。
【００７６】適当なプローブの製造ために、ＭｕｎＩで
直鎖状にされたプラスミドｐＪＷ１をニックトランスレ
ーション（ロッヒェ ディアグノスティックス（Roche D
iagnostics）のニックトランスレーションキット）によ
って３２Ｐ−α−ＡＴＰで放射線標識し、前記のブロッ
トとのハイブリダイゼーションのために使用した（分子
量マーカー ＭＷＭ ＶＩＩ）。
直鎖状にされたプラスミドｐＪＷ１をニックトランスレ
ーション（ロッヒェ ディアグノスティックス（Roche D
iagnostics）のニックトランスレーションキット）によ
って３２Ｐ−α−ＡＴＰで放射線標識し、前記のブロッ
トとのハイブリダイゼーションのために使用した（分子
量マーカー ＭＷＭ ＶＩＩ）。
【００７７】サザンブロットから得られるハイブリダイ
ゼーションシグナルのサイズに基づいて、ゲノムのＰｓ
ｔＩ消化物（約２０００ｂｐ）を後続のＩＰＣＲにおい
て鋳型として使用した。このために、該消化物をアガロ
ースゲル上で分離し、１５００〜２８００ｂｐの領域で
ゲルから溶出させ（分子量マーカー ＭＷＭ ＶＩＩ）、
引き続き再ライゲーションさせ、かつＭｕｎＩで直鎖状
にさせた。公知のヒダントイナーゼ遺伝子の配列から、
ＩＰＣＲのためのプライマーＩＰＣＲ１+（配列３）及
びＩＰＣＲ１-（配列４）を導き出すことができた。オ
リゴの溶融温度からアニーリング温度６０℃を導き出し
た。
ゼーションシグナルのサイズに基づいて、ゲノムのＰｓ
ｔＩ消化物（約２０００ｂｐ）を後続のＩＰＣＲにおい
て鋳型として使用した。このために、該消化物をアガロ
ースゲル上で分離し、１５００〜２８００ｂｐの領域で
ゲルから溶出させ（分子量マーカー ＭＷＭ ＶＩＩ）、
引き続き再ライゲーションさせ、かつＭｕｎＩで直鎖状
にさせた。公知のヒダントイナーゼ遺伝子の配列から、
ＩＰＣＲのためのプライマーＩＰＣＲ１+（配列３）及
びＩＰＣＲ１-（配列４）を導き出すことができた。オ
リゴの溶融温度からアニーリング温度６０℃を導き出し
た。
【００７８】アンプリコンとして単一のバンドが生じる
ことがあり、引き続きこれを溶出させ、かつＴＯＰＯ−
系（図１）にクローニングした。得られたプラスミドを
名称ｐＪＷ２とした。ｐＪＷ２の配列決定の後に再構築
されたｈｙｕ−遺伝子クラスターはＤ−ヒダントイナー
ゼｈｙｕＨのオープンリーディングフレーム及びＤ−カ
ルバモイラーゼｈｙｕＣＤのオープンリーディングフレ
ームの一部を有する。
ことがあり、引き続きこれを溶出させ、かつＴＯＰＯ−
系（図１）にクローニングした。得られたプラスミドを
名称ｐＪＷ２とした。ｐＪＷ２の配列決定の後に再構築
されたｈｙｕ−遺伝子クラスターはＤ−ヒダントイナー
ゼｈｙｕＨのオープンリーディングフレーム及びＤ−カ
ルバモイラーゼｈｙｕＣＤのオープンリーディングフレ
ームの一部を有する。
【００７９】Ｖ． Ｄ−ヒダントイナーゼの発現
Ｄ−ヒダントイナーゼの構造遺伝子のクローニングをラ
ムノース発現ベクターｐＪＯＥ４０３６のプラスミド誘
導体で実施した（図２）。両方のカルバモイラーゼをア
ルスロバクター クリスタロポイエテスのゲノムＤＮＡ
からの相応のプライマーによって増幅した。その際、こ
れらのＮ−末端のプライマーはＣ−末端においてＮｄｅ
Ｉ切断部位もしくはＢａｍＨＩ切断部位のための付加的
な配列を備えていた。Ｈｉｓタグを有する酵素において
は、Ｃ−末端プライマーで停止コドンを省いた。
ムノース発現ベクターｐＪＯＥ４０３６のプラスミド誘
導体で実施した（図２）。両方のカルバモイラーゼをア
ルスロバクター クリスタロポイエテスのゲノムＤＮＡ
からの相応のプライマーによって増幅した。その際、こ
れらのＮ−末端のプライマーはＣ−末端においてＮｄｅ
Ｉ切断部位もしくはＢａｍＨＩ切断部位のための付加的
な配列を備えていた。Ｈｉｓタグを有する酵素において
は、Ｃ−末端プライマーで停止コドンを省いた。
【００８０】ヒダントイナーゼが２つの内部ＮｄｅＩ切
断部位を有するので、カルバモイラーゼで使用されるク
ローニング戦略をｐＪＯＥ４０３６において使用しなか
った。その代わりに、Ｎ−末端のＤＮＡ配列の他に５′
末端でシャインダルガーノ配列及びＢａｍＨＩ切断部位
をコードするプライマーを使用した。Ｃ−末端プライマ
ーは停止コドンもしくはＳｔｒｅｐタグのための配列を
有するＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を含む。このようにゲノ
ムＤＮＡから増幅されたＤＮＡを引き続きｐＪＯＥ３０
７８中にクローニングした。生じる構築物をｐＭＷ１０
と呼称した（図４）。
断部位を有するので、カルバモイラーゼで使用されるク
ローニング戦略をｐＪＯＥ４０３６において使用しなか
った。その代わりに、Ｎ−末端のＤＮＡ配列の他に５′
末端でシャインダルガーノ配列及びＢａｍＨＩ切断部位
をコードするプライマーを使用した。Ｃ−末端プライマ
ーは停止コドンもしくはＳｔｒｅｐタグのための配列を
有するＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を含む。このようにゲノ
ムＤＮＡから増幅されたＤＮＡを引き続きｐＪＯＥ３０
７８中にクローニングした。生じる構築物をｐＭＷ１０
と呼称した（図４）。
【００８１】プラスミドｐＭＷ１０（図４）を含むＥ．
ｃｏｌｉを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する
ＬＢ培地中で以下のように培養した：− 個々のコロニ
ーを１００ｍｌの振盪フラスコ中の１０ｍｌのＬＢ培地
中に移し、かつ３７℃で一晩インキュベートした− 前
記の量のアンピシリンを有する１００ｍｌのＬＢ培地を
５００ｍｌの振盪フラスコ中で一晩インキュベートされ
た培養の２ｍｌと混合した（バッチ１）− 第２の振盪
フラスコ（５００ｍｌ）中で同量のオーバーナイト培
養、ＬＢ培地及びアンピシリンを準備し、かつ更に１０
０ｍＭのＺｎＳＯ４*７Ｈ２Ｏ溶液１ｍｌと混合した
（培養中のＺｎ２＋濃度 １ｍＭ）（バッチ２）− バ
ッチ１を３７℃で２時間、ＯＤ６００が〜０．４になる
までインキュベートした。バッチ２は同一のＯＤ値のた
めには３時間を要した− 発現の誘導のために、両方の
バッチをＬ−ラムノースと、０．１ｇ／Ｌの濃度が達成
されるまで混合した。引き続きこれらのバッチを更に３
０℃で６時間培養した− 引き続き細胞を４℃及び７０
００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。得られたペレット
を−１０℃で保存した。
ｃｏｌｉを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する
ＬＢ培地中で以下のように培養した：− 個々のコロニ
ーを１００ｍｌの振盪フラスコ中の１０ｍｌのＬＢ培地
中に移し、かつ３７℃で一晩インキュベートした− 前
記の量のアンピシリンを有する１００ｍｌのＬＢ培地を
５００ｍｌの振盪フラスコ中で一晩インキュベートされ
た培養の２ｍｌと混合した（バッチ１）− 第２の振盪
フラスコ（５００ｍｌ）中で同量のオーバーナイト培
養、ＬＢ培地及びアンピシリンを準備し、かつ更に１０
０ｍＭのＺｎＳＯ４*７Ｈ２Ｏ溶液１ｍｌと混合した
（培養中のＺｎ２＋濃度 １ｍＭ）（バッチ２）− バ
ッチ１を３７℃で２時間、ＯＤ６００が〜０．４になる
までインキュベートした。バッチ２は同一のＯＤ値のた
めには３時間を要した− 発現の誘導のために、両方の
バッチをＬ−ラムノースと、０．１ｇ／Ｌの濃度が達成
されるまで混合した。引き続きこれらのバッチを更に３
０℃で６時間培養した− 引き続き細胞を４℃及び７０
００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。得られたペレット
を−１０℃で保存した。
【００８２】ＶＩ． 活性の測定
Ｖからの貯蔵された細胞１ｇをそれぞれ１０ｍＬの０．
１Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ７．５）中で再懸濁し
た。引き続きこれらの細胞を１５０００ｐｓｉで６０秒
以内に破砕し、かつ得られた懸濁液を１００００ｒｐｍ
で４℃において１０分間遠心分離した。２５μｌの上清
をそれぞれ、８ｍＭのＤ−ベンジルヒダントインを含有
する１００μＬの０．１Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ
７．５）の予熱された試料中に添加した。反応を５０℃
での５分間の試料のインキュベートの後に１００μｌの
１０％のＨ３ＰＯ４の添加によって停止させた。１００
００ｒｐｍでの１０分間の再度の遠心分離の後に、それ
ぞれ１００μｌの上清をＨＰＬＣ溶離剤（Laufmittel）
の移動相で１０倍に希釈した（０．３％（v/v）リン酸
（８０％）、メタノール（２０％v/v））。ＨＰＬＣに
よって次いで相応のＮ−カルバモイルアミノ酸の濃度を
測定した。
１Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ７．５）中で再懸濁し
た。引き続きこれらの細胞を１５０００ｐｓｉで６０秒
以内に破砕し、かつ得られた懸濁液を１００００ｒｐｍ
で４℃において１０分間遠心分離した。２５μｌの上清
をそれぞれ、８ｍＭのＤ−ベンジルヒダントインを含有
する１００μＬの０．１Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ
７．５）の予熱された試料中に添加した。反応を５０℃
での５分間の試料のインキュベートの後に１００μｌの
１０％のＨ３ＰＯ４の添加によって停止させた。１００
００ｒｐｍでの１０分間の再度の遠心分離の後に、それ
ぞれ１００μｌの上清をＨＰＬＣ溶離剤（Laufmittel）
の移動相で１０倍に希釈した（０．３％（v/v）リン酸
（８０％）、メタノール（２０％v/v））。ＨＰＬＣに
よって次いで相応のＮ−カルバモイルアミノ酸の濃度を
測定した。
【００８３】ＨＰＬＣ法：
熱分離製品（Thermoseparation Product）、ダルムシュ
タット、ドイツ グロムシル（Gromsil）ＯＤＳ１ＰＥカラム（５μｍ、
２５０×４．６ｍｍ、グロム（Grom）、ヘーレンベルク
（Herremberg）、ドイツ） ２１０ｎｍでのＵＶ吸収 １．０ｍＬ／分の流速 比活性はブラッドフォード（Bradford）による全体のタ
ンパク質１ｍｇあたりの単位で定義されている。Ｄ−ヒ
ダントイナーゼ１単位はｐＨ７．５及び５０℃において
１分間あたりＤ−ベンジルヒダントインから出発して１
マイクロモルのカルバモイルアミノ酸の形成を触媒す
る。図５はｈｙｄ遺伝子を含有しない微生物と比較した
両方のバッチについての細胞抽出物中のＤ−Ｈｙｄの比
活性の結果を示している。
タット、ドイツ グロムシル（Gromsil）ＯＤＳ１ＰＥカラム（５μｍ、
２５０×４．６ｍｍ、グロム（Grom）、ヘーレンベルク
（Herremberg）、ドイツ） ２１０ｎｍでのＵＶ吸収 １．０ｍＬ／分の流速 比活性はブラッドフォード（Bradford）による全体のタ
ンパク質１ｍｇあたりの単位で定義されている。Ｄ−ヒ
ダントイナーゼ１単位はｐＨ７．５及び５０℃において
１分間あたりＤ−ベンジルヒダントインから出発して１
マイクロモルのカルバモイルアミノ酸の形成を触媒す
る。図５はｈｙｄ遺伝子を含有しない微生物と比較した
両方のバッチについての細胞抽出物中のＤ−Ｈｙｄの比
活性の結果を示している。
【００８４】高められた亜鉛濃度の存在下に発酵された
試料は＞１２倍だけより活性なヒダントイナーゼを含む
ことが確認できる。
試料は＞１２倍だけより活性なヒダントイナーゼを含む
ことが確認できる。
【００８５】
【００８６】
【外１】
【００８７】
【外２】
【００８８】
【外３】
【００８９】
【外４】
【００９０】
【外５】
【００９１】
【外６】
【００９２】
【外７】
【００９３】
【外８】
【００９４】
【外９】
【図１】図１はプラスミドｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩの構
造を示している。
造を示している。
【図２】図２はプラスミドｐＪＯＥ４０３６の構造を示
している。
している。
【図３】図３はプラスミドｐＪＯＥ３０７８．４の構造
を示している。
を示している。
【図４】図４はプラスミドｐＭＷ１０の構造を示してい
る。
る。
【図５】図５はｈｙｄ遺伝子を含有しない微生物と比較
した両方のバッチについての細胞抽出物中のＤ−Ｈｙｄ
の比活性の結果を示している。
した両方のバッチについての細胞抽出物中のＤ−Ｈｙｄ
の比活性の結果を示している。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 9/86 Ｃ１２Ｒ 1:06
Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
//(Ｃ１２Ｎ 9/86 5/00 Ａ
Ｃ１２Ｒ 1:06）
(72)発明者 アンドレアス ボンマリウス
アメリカ合衆国 ジョージア アトランタ
ヴァーノン スプリングス コート
1105
(72)発明者 カールハインツ ドラウツ
ドイツ連邦共和国 フライゲリヒト ツア
マリーエンルーエ 13
(72)発明者 マルティン ジーマン−ヘルツベルク
ドイツ連邦共和国 ヴィルトベルク レー
テヴェーク 24／２
(72)発明者 クリストフ ジルダトゥク
ドイツ連邦共和国 シュトゥットガルト
ラインベックシュトラーセ 29ベー
(72)発明者 マルクス ヴェルナー
ドイツ連邦共和国 ヴァインスベルク フ
ァルケンシュトラーセ ６
(72)発明者 ヨーゼフ アルテンブーフナー
ドイツ連邦共和国 ヌフリンゲン ヒンデ
ンブルクシュトラーセ ６
Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA11 BA71 CA03 DA06
EA04 GA11
4B050 CC03 DD02 EE02 EE10 FF11E
LL05
4B064 AE03 CA02 CA19 CB06 CC09
CC24 CD02 CD12 DA16
4B065 AA13X AA13Y AA26X AB01
BA02 BB02 BC10 CA17 CA31
CA60
(54)【発明の名称】 活性化されたｒｅｃ−ヒダントイナーゼの製造方法、該方法で得られるｒｅｃ−ヒダントイナー
ゼ、これをコードする核酸、それを有するプラスミド、ベクター及び微生物、ハイブリダイズす
る核酸、その製造のためのプライマー並びにｒｅｃ−ヒダントイナーゼ及び核酸の使用
Claims (12)
- 【請求項１】 活性化されたrec-ヒダントイナーゼを、
rec-ヒダントイナーゼを形成する微生物の２価の金属イ
オンの存在下での発酵によって製造するための方法にお
いて、発酵ブロスが、活性化をもたらす濃度の前記金属
イオンを有することを特徴とする方法。 - 【請求項２】 金属イオン、特に亜鉛イオンの濃度が≧
３０マイクロモル／ｌである、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 rec-ヒダントイナーゼがアルスロバクタ
ー クリスタロポイエテスＤＳＭ２０１１７由来のヒダ
ントイナーゼである、請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 請求項１記載の方法によって得られるre
c-ヒダントイナーゼ。 - 【請求項５】 アルスロバクター クリスタロポイエテ
スＤＳＭ２０１１７由来のＤ−ヒダントイナーゼをコー
ドする核酸。 - 【請求項６】 請求項５記載の１種以上の核酸を有する
プラスミド、ベクター、微生物。 - 【請求項７】 ストリンジェントな条件下に請求項５記
載の一本鎖核酸又は相補的な一本鎖核酸とハイブリダイ
ズする核酸。 - 【請求項８】 ＰＣＲによって請求項５記載の核酸を製
造するためのプライマー。 - 【請求項９】 請求項４記載のrec-ヒダントイナーゼを
コードする核酸から出発して改善されたrec-ヒダントイ
ナーゼを製造するための方法において、 ａ）核酸に突然変異誘発を起こさせ、 ｂ）ａ）から得られる核酸を適当なベクターにクローニ
ングし、かつ該ベクターを適当な発現系に移送し、かつ ｃ）改善された活性及び／又は選択性を有する形成され
たタンパク質を検出及び単離することを特徴とする方
法。 - 【請求項１０】 請求項９記載の方法によって得られ
る、rec-ヒダントイナーゼ又はこれをコードする核酸。 - 【請求項１１】 Ｎ−カルバモイルアミノ酸もしくはア
ミノ酸の製造のための、請求項４又は１０記載のrec-ヒ
ダントイナーゼの使用。 - 【請求項１２】 全細胞触媒の製造のための、請求項５
又は１０記載の核酸の使用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10130169.3 | 2001-06-22 | ||
| DE10130169A DE10130169A1 (de) | 2001-06-22 | 2001-06-22 | Aktivierte rec-D-Hydantoinasen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003061692A true JP2003061692A (ja) | 2003-03-04 |
Family
ID=7689092
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002179033A Pending JP2003061692A (ja) | 2001-06-22 | 2002-06-19 | 活性化されたｒｅｃ−ヒダントイナーゼの製造方法、該方法で得られるｒｅｃ−ヒダントイナーゼ、これをコードする核酸、それを有するプラスミド、ベクター及び微生物、ハイブリダイズする核酸、その製造のためのプライマー並びにｒｅｃ−ヒダントイナーゼ及び核酸の使用 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20030143677A1 (ja) |
| EP (1) | EP1270720A3 (ja) |
| JP (1) | JP2003061692A (ja) |
| KR (1) | KR20030001269A (ja) |
| CN (1) | CN1393556A (ja) |
| DE (1) | DE10130169A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA200204985B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006103995A1 (ja) * | 2005-03-25 | 2006-10-05 | Kaneka Corporation | 光学活性α－アミノ酸誘導体の製造方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110396484A (zh) * | 2019-06-12 | 2019-11-01 | 中国科学技术大学 | 一种海因酶和氨甲酰水解酶产生菌及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS55104890A (en) * | 1979-02-06 | 1980-08-11 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | Production of d-alpha-aminoacids |
| EP0261836B1 (en) * | 1986-09-17 | 1993-07-14 | Beecham Group Plc | Immobilised enzyme preparation and its use |
| DE4021571A1 (de) * | 1990-07-06 | 1992-01-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | N-methylhydantoinase, kloniert |
| US6524837B1 (en) * | 1999-03-29 | 2003-02-25 | California Institute Of Technology | Hydantoinase variants with improved properties and their use for the production of amino acids |
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2001
- 2001-06-22 DE DE10130169A patent/DE10130169A1/de not_active Withdrawn
-
2002
- 2002-06-06 EP EP02012593A patent/EP1270720A3/de not_active Withdrawn
- 2002-06-19 JP JP2002179033A patent/JP2003061692A/ja active Pending
- 2002-06-20 CN CN02122696A patent/CN1393556A/zh active Pending
- 2002-06-20 ZA ZA200204985A patent/ZA200204985B/xx unknown
- 2002-06-20 KR KR1020020034521A patent/KR20030001269A/ko not_active Application Discontinuation
- 2002-06-24 US US10/176,584 patent/US20030143677A1/en not_active Abandoned
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006103995A1 (ja) * | 2005-03-25 | 2006-10-05 | Kaneka Corporation | 光学活性α－アミノ酸誘導体の製造方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| KR20030001269A (ko) | 2003-01-06 |
| US20030143677A1 (en) | 2003-07-31 |
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