JP2003225094A - Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ由来のＤ−アミダーゼ、それをコードする遺伝子、そのような核酸を含有するプラスミド、ベクターおよび微生物、ハイブリダイズする核酸、核酸を製造するためのプライマー、改良されたｒｅｃ−アミダーゼ、コードｒｅｃ−アミダーゼおよび核酸の製法、Ｄ−アミダーゼおよび核酸の使用、ならびに全細胞触媒 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 工業的手段に適し、ラセミ体からエナンチオ
リッチな化合物を得るための新規アミダーゼの提供。 【解決手段】 有機体Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｐａｒａ
ｄｏｘｕｓ由来の新規アミダーゼ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｖｏｒｉｏｖｏｒ
ａｘ属の有機体由来のアミダーゼに関し、さらに前記酵
素をコードする核酸およびその核酸を含有するビヒクル
に関する。

【０００２】本発明は、特に、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ
ｐａｒａｄｏｘｕｓ １９−３ ＤＳＭ１４４６８由来
のアミダーゼに関し、さらに、前記酵素をコードする核
酸およびその株自体に関する。

【０００３】

【従来の技術】アミダーゼおよびアミド加水分解酵素は
Ｅ．Ｃ．系で２つのサブクラスに分類され、Ｅ．Ｃ．
３．５．１．１．〜３．５．１．７７およびＥ．Ｃ．
３．５．２．１〜３．５．２．１４である。最初のサブ
クラスの代表例は、例えば、アスパラギナーゼ（Ｅ．
Ｃ．３．５．１．１）、ウレアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．
１．５）およびここでより詳細に考察されるのは、アシ
ルアミドアミド加水分解酵素（Ｅ．Ｃ．３．５．１．
４）である。

【０００４】アシルアミドアミドヒドラーゼは微生物に
広く分布しており、特にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｉ、Ｂｒｅ
ｖｉｂａｃｔｅｒｉａ、ＲｈｏｄｏｃｏｃｃｉおよびＡ
ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ等の種で生じる。これらは一般的
に誘導性の酵素であり、その特性は有機体毎にそれぞれ
大きく異なっている（Maestracci, M.; Bui, K.; Thier
y, A.; Arnaud, A.; Galzy, P. (1988), The Amidases
from a Brevibacterium Strain: Study and Applicatio
ns, Adv. Biochem, Eng. 36, 69〜115）。

【０００５】Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｅｏａｕ
ｒｕｍ ＡＴＣＣ２５７９５由来の酵素（Hermes, H.
F. M.; Tandler, R. F.; Sonke, T.; Dijkhuizen, L.;
Meifer, E. M. (1994), Purification and Characteriz
ation of an L-Amino Amidasefrom Mycobacterium neoa
urum ATCC 25795, Appl. Environ. Microbiol. 60, 153
〜159）およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ
ＡＴＣＣ１２６３３由来の酵素（Hermes, H. F. M.;
Sonke, T.: Peters, P. J. H.; van Balken, J, A. M.;
kamphuis, J.; Dijkhuizen, L.; Meijer, E. M. (199
3), Purification and Characterization of an L-Amin
opeptidase from Pseudomonas putida ATCC 12633, App
l. Environ. Microbiol. 59, 4330〜4334）は、Ｌ−ア
ミノ酸アミドの加水分解にとって工業的に特に重要であ
る。いずれの酵素もＮ−分枝アミノ酸アミドまたはジペ
プチドに比較的高い親和性を有し、従って、アミノペプ
チダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４）に分類される。Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａＡＴＣＣ １２６３３に由
来するＬ−アミノペプチダーゼは、Ｄ,Ｌ−フェニルグ
リシンアミド混合物を、Ｄ−フェニルグリシンアミドお
よびＬ−フェニルグリシンへ立体特異的に分解するため
に使用される。ＤＳＭによって開発された方法では、
Ｄ,Ｌ−アミノ酸アミドから純粋なＤ−アミノ酸および
Ｌ−アミノ酸を製造するためにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｐｕｔｉｄａの全細胞を使用する（Kamphuis, J.; Bo
esten, W. H. J.; Broxterman, Q. B.; Hermes, H. F.
M.; Balkan van, J. A. M.; Meijer, E. M.; Shoemake
r, H. E. (1990), New developments in the chemoenzy
matic production of amino acids, Adv. Biochem. En
g. Biotechnol. 42, 133〜186）。

【０００６】Ｄ,Ｌ−α−アミノニトリルからＬ−アミ
ノ酸およびアミノ酸アミドを製造する方法がまた、Ｓｃ
ｈｅｒｉｎｇＡＧによって特許されている（Klages,
U.; Weber, A. (1988), Verfahren zur Herstellung vo
n L-Aminosaeuren und Aminosaeureamiden, DE 3816063
A1; WO 8910969）。この全細胞を用いた生体内変化で
は、Ｄ,Ｌ−アミノニトリルがＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔ
ｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ ＤＳＭ ３８７５
により最初にＤ,Ｌ−アミノ酸アミドに加水分解され
る。Ｌ−アミノ酸への完全な変換は、原則的に、Ａｒｔ
ｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ. ＡＴＣＣ ３１６５２また
はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ.ＡＴＣＣ
３１６６２のＬ−アミノ酸アミダーゼおよびアミノ酸ア
ミドラセマーゼにより達成できる。

【０００７】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａお
よびＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ.中でアミノ酸アミ
ドラセマーゼが発見された結果、アミノ酸アミドをラセ
ミ化し、Ｌ−またはＤ−アミダーゼにより加水分解し
て、相当のアミノ酸を得る方法が、Ｎｏｖｏ Ｉｎｄｕ
ｓｔｉ Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ ａｎｄ Ｓｔａｍｉ
ｃａｒｂｏｎ Ｂ.Ｖ.、Ｔｈｅ Ｎｅｔｅｈｅｒｌａｎ
ｄｓ（Godtfredsen, S.E.; Clausen, K.; Ingvorsen,
K.; Hermes, H. F.; Van Balken, J. A.; Meifer, E.
M. (1989), EP 0307023, WO 8901525）によって特許さ
れ得た。Ｄ−アミダーゼ活性はここに、Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＮＣＩＢ ４００４２および
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ. ＮＣＩＢ ４００４
１中のものが記載されている。

【０００８】Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ中
の別のアミノ酸ラセマーゼの発見が、Ｈｅｒｍｅｓと同
僚により記載されている（Hermes, H. F. M.; Peeters,
W.P.; Peters, P. J. (1990), EP 0383403)。

【０００９】アミノ酸アミドに関してＤ−特異性を有す
る別のアミダーゼが、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏ
ｂｏｒａｎｓ ＥＰＯ−２７７１−４（Hayashi, T.; Y
amamoto, K.; Matsuo, A.; Otsubo, K.; Muramatsu,
S.; Matsuda, A.; Komatsu, K.-I.(1997)、 Characteri
zation and Cloning of an Enantioselective Amidasef
rom Comamonas acidoborans KPO-2771-4, J. ferment.
Bioeng. 83, 139〜145）およびＯｃｈｒｏｂａｃｔｒｕ
ｍ ａｎｔｈｒｏｐｉ、ＳＣＲＣＣ１−３８の２株（As
ano, Y.; kato, Y.; Yamada, A.; Kondo, K. (1992) St
ructural Similarity of D-Aminopeptidase to Carboxy
peptidase DD and β-Lactamases, Biochem. 31, 2316
〜2328; Asano, Y.; Nakazawa, A.; Kato, Y.; Kondo,
K. (1989), Properties of a Novel D-Stereosoecific
Aminopeptidase from Ochrobacttrum anthropi, J. Bio
l. Chem. 264, 14233〜14239）およびＳＣＲＣ−ＳＶ３
（Komeda, H. and Asano, Y. (2000), Gene cloning, m
ucleotide sequencing, andpurification and characte
risation of the D-stereospecific amino-acid amidas
e from Ochrobactrum anthropi SV3, Eur. J. Biochem.
267, 2028〜2035;Asano, Y.; Mori, T.; Hanamoto,
S.; Kato, Y.; Nakazawa, A. (1989), A NewD-Stereosp
ecific Amino Acid Amidase From Ochrobactrum anthro
pi, BiochemBiophys. Res. Commun. 162, 470〜474）に
記載される。

【００１０】にもかかわらず、特にその基質スペクトル
が１００％を網羅していないので、Ｄ−アミダーゼはさ
らに必要とされているが、現在、新規酵素の発見によ
り、以前の僅かに変換性の基質は経済的に有利な条件下
で工業規模の製造が可能となっている。

【００１１】

【特許文献１】DE 3816063 A1; WO 8910969 Klages,
U.; Weber, A. (1988), Verfahren zurHerstellung von
L-Aminosaeuren und Aminosaeureamiden

【特許文献２】EP 0307023, WO 8901525 Godtfredsen,
S. E.; Clausen, K.; Ingvorsen, K.; Hermes, H. F.;
Van Balken, J. A.; Meifer, E. M. (1989)

【特許文献３】EP 0383403 Hermes, H. F. M.; Peeter
s, W. P.; Peters, P. J. (1990)

【特許文献４】EP 0383403, WO 8901525 Hermes, H.
F. M.; Peeters, W. P.;Peters, P. J.(1990),

【特許文献５】WO 8910969 Wilms, L.; Bartsch, K.
(1995), EP 0690133; Klages, U.; Weber, A (1989)

【特許文献６】DE 19920712 Farwick, M.; London,
M.; Dohmen. J.; Dahlems, U.; Gellissen, G.; Strass
er, A. W.

【特許文献７】DE19920712 Farwick, M.; London, M.;
Dohmen, J.; Dahlems, U.; Gellissen, G.; Strasser,
A. W.

【非特許文献１】Maestracci, M.; Bui, K.; Thiery,
A.; Arnaud, A.; Galzy, P. (1988), TheAmidases from
a Brevibacterium Strain: Study and Applications,
Adv. Biochem, Eng. 36, 69〜115

【非特許文献２】Hermes, H. F. M.; Tandler, R. F.;
Sonke, T.; Dijkhuizen, L.; Meifer, E. M. (1994), P
urification and Characterization of an L-Amino Ami
dase from Mycobacterium neoaurum ATCC 25795, Appl.
Environ. Microbiol. 60, 153〜159

【非特許文献３】Hermes, H. F. M.; Sonke, T.: Peter
s, P. J. H.; van Balken, J, A. M.; kamphuis, J.; D
ijkhuizen, L.; Meijer, E. M. (1993), Purification
and Characterization of an L-Aminopeptidase from P
seudomonas putida ATCC 12633,Appl. Environ. Microb
iol. 59, 4330〜4334

【非特許文献４】Kamphuis, J.; Boesten, W. H. J.; B
roxterman, Q. B.; Hermes, H. F. M.;Balkan van, J.
A. M.; Meijer, E. M.; Shoemaker, H. E. (1990), New
developments in the chemoenzymatic production of
amino acids, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 42, 13
3〜186

【非特許文献５】Kamphuis, J.; Boesten, W. H. J.; B
roxterman, Q. B.; Hermes, H. F. M.;Balkan van, J.
A. M.; Meijer, E. M.; Shoemaker, H. E. (1990), New
developments in the chemoenzymatic production of
amino acids, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 42, 13
3〜186

【非特許文献６】Hayashi, T.; Yamamoto, K.; Matsuo,
A.; Otsubo, K.; Muramatsu, S.; Matsuda, A.; Komat
su, K.-I.(1997)、 Characterization and Cloning of
an Enantioselective Amidase from Comamonas acidobo
rans KPO-2771-4, J. ferment. Bioeng. 83, 139〜145

【非特許文献７】Asano, Y.; kato, Y.; Yamada, A.; K
ondo, K. (1992) Structural Similarity of D-Aminope
ptidase to Carboxypeptidase DD and β-Lactamases,
Biochem. 31, 2316〜2328

【非特許文献８】Asano, Y.; Nakazawa, A.; Kato, Y.;
Kondo,K. (1989), Properties of a Novel D-Stereoso
ecific Aminopeptidase from Ochrobacttrum anthropi,
J. Biol. Chem. 264, 14233〜14239

【非特許文献９】Komeda, H. and Asano, Y. (2000), G
ene cloning, mucleotide sequencing,and purificatio
n and characterisation of the D-stereospecific ami
no-acidamidase from Ochrobactrum anthropi SV3, Eu
r. J. Biochem. 267, 2028〜2035

【非特許文献１０】Asano, Y.; Mori, T.; Hanamoto,
S.; Kato, Y.; Nakazawa, A. (1989), A New D-Stereos
pecific Amino Acid Amidase From Ochrobactrum anthr
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【非特許文献２６】Brueckner,H., Wittner R., and Go
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【非特許文献３２】Bergmeyer, H. U., and Beutler, H
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【非特許文献５１】Brueckner, H.; Wittner R. and Go
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dericatized with o-Phthaldialdehyde together with
N-isopropyl-cycteine. Application to food samples.
Anal. Biochem. 144, 204〜206

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は従っ
て、新規Ｄ−アミダーゼを提供することである。

【００１３】

【課題を解決するための手段】課題は請求項のものによ
り達成される。請求項１は、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ属由
来のＤ−アミダーゼに関する。請求項２は、より好まし
いＤ−アミダーゼに関する。請求項３は、これらの酵素
をコードする核酸を保護している。順に、請求項４は本
発明の核酸を含むビヒクルに関し、請求項５は本発明の
核酸とハイブリダイズする核酸に関し、請求項６は好ま
しいプライマーを保護する。請求項７は、本発明の核酸
を出発物質とするＤ−アミダーゼの改良法に関し、請求
項８は特に改良されたｒｅｃ−アミダーゼおよびそれを
コードする核酸に関する。請求項９および１０は、それ
ぞれ、本発明のＤ−アミダーゼおよび本発明の核酸の特
別な使用に関する。請求項１１から１３は、全細胞触媒
に関する。請求項１４は、新規有機体であるＶａｒｉｏ
ｖｏｒａｘ ｐａｒａｄｏｘｕｓ １９−３ ＤＳＭ
１４４６８を保護する。

【００１４】Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ種由来のＤ−アミダ
ーゼを提供することにより、有利な方法で記載の課題を
達成できる可能性がもたらされる。Ｖａｒｉｏｖｏｒａ
ｘｐａｒａｄｏｘｕｓ、好ましくは１９−３ ＤＳＭ
１４４６８（配列２）由来のＤ−アミダーゼの使用がこ
こでは特に非常に好ましい。

【００１５】本発明のＤ−アミダーゼは、広範囲のカル
ボン酸アミドスペクトルが相当のカルボン酸への加水分
解するのを触媒できる。この反応では、例えばアミノ酸
アミドのようなラセミ混合物が、ある場合に、厳密にＤ
−選択的に変換される。意外にも、本発明によれば、工
業的手段に適したターンオーバー頻度で、ラセミ体ｔｅ
ｒｔ−ロイシンアミドからエナンチオリッチなＤ−ｔｅ
ｒｔ−ロイシンを得ることができる。

【００１６】本発明の次の態様は、本発明のＤ−アミダ
ーゼをコードする核酸である。

【００１７】Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ株が容易に培養でき
かつクロマトグラフィー法により酵素が容易に評価でき
るとはいえ、本発明のＤ−アミダーゼをコードする核酸
を示すことにより、組換え技術を介して、エナンチオリ
ッチな化合物を製造するための酵素工業的方法に必要な
適量の酵素を確保できる物質に、より好ましい状態で到
達する。核酸を用いることにより、急速に成長する宿主
有機体から高い収量で酵素を得ることが可能になる。本
発明の遺伝子配列は、さらに、改良された変異体を製造
するために使用される。

【００１８】本発明の次の態様は、本発明の核酸を１種
以上含有するプラスミドまたはベクターに関する。

【００１９】可能なプラスミドまたはベクターは、原則
的に、この目的のために専門家が使用できる全ての形態
である。このようなプラスミドおよびベクターは、例え
ばＳｔｕｄｉｅｒとその同僚の文献（Studier, W. F.;
Rosenberg A. H.; Dunn J. J.; Dubendroff J. W.; (19
90), Use of the T7 RNA polymerase to direct expres
sion of clones genes, Methods Enzymol. 185, 61〜8
9)またはＮｏｖａｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈまた
はＧｉｂｃｏＢＲＬのパンフレットで得ることができ
る。さらに好ましいプラスミドおよびベクターは、Glov
er, D. M.(1985), DNA cloning: A Practical Approac
h, vol. I〜III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez,
R. L. andDenhardt, D. T.(eds)(1988), Vectors: a s
urvey of molecular cloning vectors and their uses,
179〜204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V.
(1990), Systems for heterologous gene expression,
Methods Enzamol. 185, 3〜7;Sambrook, J.; Fritsch,
E. F. and Maniatis, T. (1989), Molecular cloning:
a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor L
aboratory Press, NewYorkに見出される。本発明の核酸
を含む遺伝子構造体と一緒に非常に有利な方法で宿主有
機体にクローン化されたプラスミドは；ｐＵＣ１８（Ro
che Biochemicals)、ｐＫＫ−１７７−３Ｈ（Roche Bio
chemicals)、ｐＢＴａｃ３（Roche Biochemicals、ｐＫ
Ｋ−２３３−３（Stratagene）またはｐＥＴ（Novage
n）である。

【００２０】本発明は同様に、本発明の核酸を有する微
生物に関する。

【００２１】核酸をクローン化した微生物を、十分な量
の組換え酵素を増加し獲得するために使用する。この方
法は専門家に公知である（Sambrook, J.; Fritsch, E.
F. and maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a l
aboratory manual, 2nd ed.Cold Spring Harbor Labora
tory Press, New York）。使用できる微生物は原則的に
この目的のために専門家が使用可能な全ての有機体であ
り、例えば、酵母、例えばＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌ
ｙｍｏｒｐｈａ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ.およびＳａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、原核生
物、例えばＥ．ＣｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕ
ｂｔｉｌｌｉｓ または真核生物、例えばほ乳動物細胞
および昆虫細胞である。Ｅ．Ｃｏｌｉ株をこの目的に有
利に使用する。以下は特に非常に有利な株である：Ｅ．
Ｃｏｌｉ ＸＬ１ Ｂｌｕｅ、ＮＭ５２２、ＪＭ１０
１、ＪＭ１０９、ＪＭ１０５、ＲＲ１、ＤＨ５α、ＴＯ
Ｐ１０^-またはＨＢ１０１。本発明の核酸を含む遺伝子
構造体を宿主有機体に有利にクローン化するためのプラ
スミドは前記の通りである。

【００２２】本発明はまた、ストリンジェントな条件下
に、本発明の一本鎖核酸またはそれと相補的な一本鎖核
酸とハイブリダイズする核酸も包含する。例えば配列５
の遺伝子プローブがそれに該当する。

【００２３】“ストリンジェントな条件下”という表現
は、ここで、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等の記載したものと理解
される（sambrook, J.; Fritsch, E. F. and maniatis,
T.(1989), Molecular cloning: a laboratory manual,
2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New
York）。１×ＳＳＣ（１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、
１５ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７.０）および０.
１％ ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）で５０℃、有
利には５５℃、より有利には６２℃、最も有利には６８
℃で１時間、より有利には０.２×ＳＳＣおよび０.１％
ＳＤＳで５０℃、有利には５５℃、より有利には６２
℃、最も有利には６８℃で１時間洗浄した後に、陽性の
ハイブリダイゼーションシグナルがまだ観察される場
合、本発明において、ストリンジェントなハイブリダイ
ゼーションが有利に起こったとされる。

【００２４】本発明の以下の態様は、本発明の遺伝子配
列をあらゆる種類のＰＣＲで製造するためのプライマー
に関する。これらには、相当のアミノ酸配列または相補
ＤＮＡ配列をコードするセンスおよびアンチセンスプラ
イマーが含まれる。好適なプライマーは、原則的に、専
門家に公知の方法で得られる。本発明のプライマーは、
公知のＤＮＡ配列と比較することにより、または問題の
有機体の有利なコドンの考慮下にアミノ酸配列を翻訳す
ることにより、発見される（例えばStreptomyces: Wrig
ht F. and Bibb M. J.(1992), Codon usage in the G+C
-rich Streptomyces genome, Gene 113, 55〜56）。所
謂スーパーファミリーのタンパク質のアミノ酸配列の共
通の特徴もプライマーを見出すのに役立つ（Firestine,
S. M.;Nixon, A. E.; Benkovic, S. J.(1996), Thread
ing your way to protein function, Chem. Biol. 3, 7
79〜783）。これに関する更なる情報がＧａｉｔ、Ｍ．
Ｊ．の文献に見出される（1984, Oligonucleotid synth
esis: a practical approach IRL Press Ltd., Oxford;
Innis. M. A.; Gelfound, D. H.; Sninsky, J. J.and
White, T. J. (1990), PCR Protocols: A guide to met
hods and applications, Academic Press Inc., San Di
ego）。極めて有利なプライマーは以下の通りである：

【００２５】

【外１】

【００２６】更に次の態様では、本発明は、改良された
ｒｅｃ−Ｄ−アミダーゼの製法、この方法で得られるｒ
ｅｃ−Ｄ−アミダーゼまたはそれをコードする遺伝子に
関し、ここで前記製法は、本発明のＤ−アミダーゼをコ
ードする本発明の核酸から出発し、 ａ）核酸を突然変異させ、 ｂ）ａ）で得られた核酸を好適なベクター中にクローン
化し、これを好適な発現系に移入し、 ｃ）改良された活性および／または選択性を示すタンパ
ク質を検出および単離するの工程から成る。この方法は
１回で、または連続して所望の回数で実施してよい。

【００２７】本発明の酵素を突然変異により改良する方
法について、専門家は十分に精通している。可能な突然
変異法は、この目的のために専門家が利用できる全ての
方法である。特に、飽和突然変異誘発（saturation mut
agenesis）、ランダム突然変異誘発、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
組換え法および指定部位突然変異誘発である（Eigen,M.
and Gardiner, W. (1984), Evolutionary molecular e
ngineering based onRNA replication, Pure Appl. Che
m. 56, 967〜978; Chen, K. and Arnold, F.(1991), En
zyme engineering for nonaqueous solvents: random m
utagenesisto enhance activity of subtilisin E in p
olar organic media. Bio/Technology 9, 1073〜1077;
Horwitz, M. and loeb, L. (1986). Promoters Selecte
d From Random DNA-Sequences, Proc Natl Acad Sci US
A 83, 7405〜7409; Dube, D.and L. Loeb (1989), Muta
nts Generated By The Insertion Of Random Oligonucl
eotides Into The Active-Site Of The Beta-Lactamase
Gene, Biochemistry28, 5703〜5707; Stemmer, P. C.
(1994), Rapid evolution of a protein invitro by DN
A shuffling, Nature 370, 389〜391およびStemmer, P.
C. (1994),DNA shuffling by random fragmentation a
nd reassembly: In vitro recombination for molecula
r evolution. Proc Natl Acad Sci USA 91, 10747〜107
51）。

【００２８】得られる新規核酸配列を、以下に記載の方
法により宿主有機体にクローン化し（以下の文献参
照）、この方法で発現された酵素を好適なスクリーニン
グ法で検出して単離する。検出に適した方法は、原則的
に、アンモニアおよびアンモニウムイオンを検出できる
全ての反応であり、例えばネスラー試薬（Vogel, A. I.
(1989), Vogel's textbook of quantitative chemical
analysis, John Wiley &Sons, Inc., 5th ed., 679〜6
98, New York)、ベルトロー法とも呼称されるインドフ
ェノール反応、（Wagner, R., (1969), Neue Aspekte z
ur Stickstoffanalytik in der Wasserchemie, Vom Was
ser, VCH-Verlag, vol. 36, 263〜318, Winheim）、特
にグルタメートデヒドロゲナーゼ法による酵素検出（Be
rgmeyer, H.U., and Beutler, H. -O.(1985), Ammonia,
in: Methods of Enzymatic Analysis,VCH-Verlag, 3rd
edition, vol. 8: 454〜461, Weinheim）およびアンモ
ニウム−感受性電極による検出である。ＨＰＬＣ法もア
ミノ酸の検出に利用でき、例えばｏ−フタルジアルデヒ
ドおよびＮ−イソブチリルシステインをベースとする、
アミノ酸のエナンチオ選択のための誘導法も利用できる
（Brueckner,H., Wittner R., and Godel H.(1991), Fu
lly automated high-performance liquid chromatograp
hic separation of DL-amino acids derivatized with
o-phthaldialdehyde together with N-isopropyl-cycte
ine. Application to food samples, Anal. Biochem. 1
44, 204〜206）。

【００２９】本発明はまた、突然変異により改良されい
てよい本発明のＤ−アミダーゼの、カルボン酸または任
意にキラルエナンチオリッチな有機化合物、例えばアミ
ノ酸の製造への使用に関する。

【００３０】問題のＤ−アミダーゼをコードする本発明
の核酸および更に改良された核酸は、全細胞触媒の製造
に関して有利に適している。

【００３１】本発明はまた、ニトリルヒドラターゼのク
ローン化遺伝子およびアミダーゼ、有利にはＤ−アミダ
ーゼのクローン化遺伝子、および場合によりα−アミノ
ニトリルラセマーゼ、シアノヒドリンラセマーゼ、α−
ヒドロキシカルボン酸ラセマーゼまたは（α−またはβ
−）アミノ酸アミドラセマーゼのクローン化遺伝子を含
む全細胞触媒を提供する（Hermes, H. F. M.; Peeters,
W. P.;Peters, P. J.(1990), EP 0383403;およびWO 89
01525; Wilms, L.; Bartsch, K. (1995), EP0690133; K
lages, U.; Weber, A (1989), WO 8910969）。

【００３２】本発明の全細胞触媒は有利にＶａｒｉｏｖ
ｏｒａｘ由来のＤ−アミダーゼを含有すべきである。Ｖ
ａｒｉｏｖｏｒａｘ ｐａｒａｄｏｘｕｓ、有利にはＤ
ＳＭ１４４６８由来のＤ−アミダーゼが極めて有利であ
る。このような有機体の製造については、専門家が精通
している（Farwick, M.; London, M.; Dohmen. J.; Dah
lems, U.; Gellissen, G.; Strasser, A. W.; DE 19920
712）。

【００３３】このような有機体の利点は、両方の酵素系
を同時に発現できることであり、すなわち反応に使用し
なければならないのが唯１種類のｒｅｃ−有機体である
ことを意味する。変換率にその酵素発現を合致させるた
めに、相当のコード核酸フラグメントを、異なるコピー
数および／または異なる強度で遺伝子を発現させるのに
使用される異なる効力を有するプロモーターで、異なる
プラスミド上に作用させることができる。このような合
致した酵素系では、有利に、効果を阻害する中間化合物
の蓄積が起こらず、当の反応を全体として至適な速度で
実施できる。しかし、このことは専門家が十分知ってい
る（Gellissen, G.; Piontek, M.; Dahlems, U.; Jenze
lewski, V.; Gavagan, J. W.; DiCosimo, R.; Anton,
D. L.; Janowicz, A. (1996), Recombinant Hansenula
polymorpha as a biocatalyst. Coexpression of the s
pinach glycollate oxidase (GO) and the S. cerevisi
aecatalase T (CTT1) gene, Appl. Microbiol. Biotech
nol. 46, 46〜54; Farwick, M.; London, M.; Dohmen,
J.; Dahlems, U.; Gellissen, G.; Strasser, A. W.; D
E19920712)。

【００３４】本発明の核酸は従って、有利にｒｅｃ−Ｄ
−アミダーゼの製造に使用できる。専門家が十分に知っ
ている組換え技術により（下記参照）、問題の酵素を工
業的な方法で十分な量供給できる有機体に到達する。本
発明のｒｅｃ−酵素の製造は、専門家に公知の遺伝子技
術法により実施される（Sambrook, J.; Fritsch, E.F.
and Maniatis, T.(1989), Molecular cloning: a labor
atory manual , 2nded., Cold Spring Harbor Laborato
ry Press, New York; Balbas, P. and Bolivar, F. (19
90), Design and construction of expression plasmid
vectors inE. coli, Methods Enzymol. 185, 14〜37;
Rodriguez, R. L. and Ddnhardt, D.T(eds)(1988), Vec
tors: a survey of molecular cloning vectors and th
eiruses, 205〜225, Butterworth, Stoneham）。一般的
な方法に関して（ＰＣＲ、クローニング、発現等）、以
下の文献を参照し、ここに引用する；Universal Genome
Walker ^ＴＭ Ket User Manual, Clontech, 3/2000およ
びそこに引用される文献；Triglia T.; Peterson, M.
G. and Kemp, D. J. (1988), A procedure for in vitr
o amplification of DNA segments that lie outside t
he boundariesof known sequences, Nucleic Acids Re
s. 16, 8186; Sambrook, J.; Fritsch,E. F. and mania
tis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory ma
nual,2nd ed., Cold Spring Harbor L-aboratory Pres
s, New York; Rodriguez, R. L. and Denhardt, D. T(e
ds)(1988), Vectors: a survey of molecular cloningv
ectors and their uses, Butterworth, Stoneham）。

【００３５】本発明はまた、ブダペスト条約によりＤＳ
ＭＺへ１４４６８の番号で２００１年８月２２日に寄託
された微生物Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｐａｒａｄｏｘｕ
ｓ１９−３を提供する。

【００３６】Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｐａｒａｄｏｘｕ
ｓ由来のＤ−アミダーゼはＥ．Ｃ．系によりアシルアミ
ドアミド加水分解酵素に分類される（Ｅ．Ｃ．３．５．
１．４）。Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｐａｒａｄｏｘｕｓ
由来のＤ−アミダーゼの完全な遺伝子配列を配列１に示
す。Ｄ−アミダーゼの遺伝子部位を、ゲノムＤＮＡを用
いたＰＣＲ反応によりＶａｒｉｏｖｏｒａｘ ｐａｒａ
ｄｏｘｕｓから得た。プライマー、ＡＡＨ−Ｎ１（配列
３）を、決定されたアミノ酸配列のＮ−末端から得るこ
とができた。第二のプライマー、ＡＡＨ−Ｃ１（配列
４）を、代表的ないわゆるアミダーゼファミリーのＮ−
末端との配列の類似性をベースとして、コンセンサス領
域から誘導した。これら２種類のプライマーを使用し
て、一般的に遺伝子プローブとして使用される、５０９
ｂｐの大きさのＤ−アミダーゼフラグメントをＰＣＲ技
術により増幅した。そのベースペア配列を配列５に示
す。

【００３７】このフラグメントを用い、全遺伝子を発見
するために、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製のＵｎｉｖｅｒｓａ
ｌ ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ^ＴＭ Ｋｉｔ（Univcers
al GenomeWalker TM Kit User Manual, Clontech, 3/20
00およびそこに引用される文献）の方法に必要な遺伝子
−特異的プライマー（配列６〜９）を構築した。

【００３８】Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＧｅｎｏｍｅＷａｌ
ｋｅｒ^ＴＭ−Ｋｉｔの方法により、Ｖａｒｉｏｖｏｒａ
ｘ ｐａｒａｄｏｘｕｓ由来のゲノムＤＮＡを最初に各
制限酵素、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩＩ、ＳｃａＩおよびＳ
ｔｕＩで切断した。得られたＤＮＡフラグメントを有す
るバッチを、２種類のプライマーを有するＧｅｎｏｍｅ
ＷａｌｋｅｒTMＡｄａｐｔｅｒで連結した。

【００３９】テンプレートとしてのこれらのバッチを用
い、列挙した遺伝子特異的プライマーの１つ、ＡＡＨ−
ＧＷ−Ｆ１（配列６）またはＡＡＨ−ＧＷ−Ｒ１（配列
８）およびアダプタープライマーを用いて両方向で、Ｐ
ＣＲ反応を実施した。プライマーＡＡＨ−ＧＷ−Ｆ２
（配列７）またはＡＡＨ−ＧＷ−Ｒ２（配列８）および
アダプタープライマーを有する、いわゆるネストＰＣＲ
（Universal GenomeWalker ^ＴＭ Kit User Manual, Clo
ntech, 3/2000およびそこに引用される文献）は、非特
異的ＰＣＲ産物の形成を回避すべきである。Ｄ−アミダ
ーゼの完全な遺伝子配列は、（下流）３５００ｂｐまで
および（上流）１８００ｂｐまでの得られたＰＣＲフラ
グメントに近似している。

【００４０】更なる処理および遺伝子配列の確認のため
に、開始コドンより９２ｂｐ前および停止コドンより８
０ｂｐ後まで有する全Ｄ−アミダーゼ遺伝子を、ゲノム
ＤＮＡと以下のプライマー（配列１０および１１）とか
ら出発し、プルーフリーディング機能を有する２種類の
異なるＤＮＡポリメラーゼを含有する３種の類似のバッ
チ中で、増幅した（VentR ^（Ｒ）, New England Biolab
s and Herculase ^{（Ｒ ）}, Stratagene）。

【００４１】得られたＰＣＲ産物を、平滑末端ライゲー
ションによりベクターｐＵＣ１８に導入し、Ｅ．Ｃｏｌ
ｉ ＸＬ１Ｂｌｕｅに形質転換させた。プラスミドＤＮ
Ａから始めることにより、Ｄ−アミダーゼ配列（配列
１）を保護し確認できた（Sequiserve, Vaterstetten,
Germany）。

【００４２】Ｄ−アミダーゼの発現のために、ＰＣＲ反
応によりＥｃｏＲＩ切断部位を５’末端に、ＨｉｎｄＩ
ＩＩ切断部位を３’末端に導入し（配列１２および１
３）、ＰＣＲ産物をｐＢＴＡＣベクターに結合させ、
Ｅ．Ｃｏｌｉ ＪＭ １０１を形質転換した。

【００４３】最初の発現実験において、粗抽出物中のＤ
Ｌ−Ｔｌｅ−ＮＨ_２の８０〜２１０ｍＵ／ｍｇの特異的
活性を測定できた。粗抽出物中の２０〜３０ｍＵ／ｍｇ
のＶａｒｉｏｖｏｒａｘ ｐａｒａｄｏｘｕｓの特異活
性と比較することにより、明かな過剰発現を起こすこと
ができた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより粗抽出物の可溶性お
よび不溶性フラクションを分析することにより、発現し
たＤ−アミダーゼの大部分が、細胞ペレット中に不溶性
形、いわゆる封入体形で存在することが明かになった。

【００４４】アミダーゼは、３種のクロマトグラフィー
工程で精製され、通常、第２工程後ですでに、外来タン
パク質は非常に低い含量でしか存在していない。

【００４５】１．イオン交換クロマトグラフィー：Ｑ−
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Pharmacia） ２．疎水性相互作用クロマトグラフィー：Ｂｕｔｙｌ−
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ（Pharmacia） ３．ゲル濾過：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＰＧ（Phar
macia）。

【００４６】８８％の収率が最初の２つの精製工程で算
出でき、基質としてのＤＬ−Ｔｌｅ−ＮＨ_２に対する特
異活性は０.６８Ｕ／ｍｇであった。Ｖａｒｉｏｖｏｒ
ａｘｐａｒａｄｏｘｕｓ由来の同様のＤ−アミダーゼで
は、ＤＬ−Ｔｌｅ−ＮＨ_２に対して特異活性は１.４Ｕ
／ｍｇであった。

【００４７】アミダーゼが好適であることを、以下の実
験により実証した： １．酸アミド：グルタメートデヒドロゲナーゼにより、
アンモニウムイオンを測定して活性を測定した（Bergme
yer, H. U., and Beutler, H-O.(1985), Ammonia. In :
Methods of Enzymatic Analysis. VCH-Verlag, 3rd ed
ition, vol. 8: 454〜461, Weinheim）。使用する酵素
は、第２のクロマトグラフィー工程後の部分精製Ｄ−ア
ミダーゼであり、特異活性は０.５１Ｕ／ｍｇであっ
た。基質は、コハク酸ジアミドおよびアジピン酸ジアミ
ド各１０ｍＭおよびベンジルアミド２０ｍＭ以外、４０
ｍＭで酵素試験に使用した。活性は各ケースで１種の基
質濃度でしか測定しなかったので、相対活性を記載し
た。

【００４８】

【表１】

【００４９】２．アミノ酸アミドおよびα−ヒドロキシ
カルボン酸アミド プロリンアミド、およびα−ヒドロキシカルボン酸アミ
ド、乳酸アミド（Ｌａｃ−ＮＨ_２）および２−ヒドロキ
シ−４−メチルメルカプトブチロールアミド（ＭＨＡ−
ＮＨ_２）、メチオニン類似α−ヒドロキシカルボン酸ア
ミドには、これまでのＨＰＬＣ分析による生成物の測定
は不可能である。これらの基質に対しては、ＮＨ^４＋測
定により活性を測定した。使用する酵素は、第２クロマ
トグラフィー工程後の部分的に精製したＤ−アミダーゼ
であり、特異活性は０.５６Ｕ／ｍｇであった。全ての
基質を４０ｍＭで酵素試験に使用した。更に比較するた
めの第４カラムにおいて、少ない方のエナンチオマー活
性を１に設定し、有利なエナンチオマーの相対活性をそ
こから算出した。

【００５０】

【表２】

【００５１】以下の式で表されるラセミＤＬ−Ｔｌｅ−
ＮＨ_２の動的切断にＤ−アミダーゼがどれほど適してい
るかをさらに調査した。

【００５２】

【化１】

【００５３】ラセミＤＬ−Ｔｌｅ−ＮＨ_２の動的切断の
適性を評価するために、エナンチオ選択性を変換の関数
として測定した。第１クロマトグラフィー工程後の部分
的に精製された酵素（イオン交換クロマトグラフィー：
Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Pharmacia））では、
４５％を上回る変換で、Ｄ−Ｔｌｅへの９６.６％エナ
ンチオ選択性がすでに測定された。ほぼ類似した酵素で
は、９９.４〜９９.６％のｅｅ値が、４５〜５０％の変
換の範囲で測定された。従って、両方の一連した実験に
おいて、１００を上回るＥ値（Straathof, A. J. J. an
d Jongejan, J. A. (1997), Th enantiomeric ratio: o
rigin, determination and prediction, Enzyme micro
b. Technol. 21, 559〜571）が算出される。このこと
は、所望されるほぼ完全なＤ−エナンチオマーの変換を
伴うラセミ切断の非常に好ましい根拠である。

【００５４】ＤＬ−バリン−、ＤＬ−ロイシン−および
ＤＬ−フェニルアラニンアミドをさらにこの点で試験し
た。このために、第１クロマトグラフィー工程後の部分
的に精製されたＶａｒｉｏｖｏｒａｘ ｐａｒａｄｏｘ
ｕｓ１９−３由来の酵素を用いて、エナンチオ選択性を
変換の関数として測定した。図１は、変換の関数として
のＤ−Ｖａｌ、Ｄ−ＬｅｕおよびＤ−Ｐｈｅのエナンチ
オ選択性を示している。

【００５５】幾つかの測定値に関して、特に５０％の変
換領域とそこから算出されるＥ値を実施例を通して、以
下の表に列記した。

【００５６】

【表３】

【００５７】４０〜５０％の範囲の変換で、Ｄ−Ｖａｌ
のエナンチオ選択性は９８.１〜９５.１％であり、Ｄ−
Ｌｅｕは９６.７〜９０.８％の範囲およびＤ−Ｐｈｅは
５５％の領域という結果であった。ラセミＶａｌ−ＮＨ
_２およびＬｅｕ−ＮＨ_２では、１００を越える平均Ｅ値
が算出され、Ｐｈｅ−ＮＨ_２ではＥ値５であった。

【００５８】所望されるほぼ完全なＤ−エナンチオマー
の変換に関するラセミ体の切断の点では、従って、ＤＬ
−Ｖａｌ−ＮＨ_２およびＤＬ−Ｌｅｕ−ＮＨ_２にとって
Ｄ−アミダーゼが原則的に特に非常に好適である。

【００５９】基質スペクトラムの拡張：ラセミＮ−ホル
ミル化アミノ酸アミドの切断を、本発明のＤ−アミダー
ゼにより調査した。

【００６０】使用した酵素は、第１クロマトグラフィー
工程後の部分的に精製されたＤ−アミダーゼである。活
性はグルタメートデヒドロゲナーゼによるＮＨ^４＋イオ
ンの測量により測定された（Bergmeyer, H. U., and Be
utler, H. -O. (1985), Ammonia.. In: Methods of Enz
ymatic Analysis. VCH-Verlag, 3rd edition. vol. 8:
454〜461, Weinheim）。以下の基質は酵素試験において
１０ｍＭで使用された。

【００６１】

【表４】

【００６２】ＤＬ−Ｔｌｅ−ＮＨ_２よりも２.８倍の好
ましい範囲で変換された、ラセミＮ−ホルミル−バリン
アミドの変換は興味深い。

【００６３】

【表５】

【００６４】Ｄ−アミダーゼの至適温度およびｐＨ：図
２および図３は、温度およびｐＨに関する活性の依存性
を示している。Ｄ−アミダーゼの４７〜４８℃の範囲の
至適温度が見出された。図３では、ほぼ同一の活性で
７.５〜９.５の範囲の広い至適ｐＨが示されている。ｐ
Ｈ９の炭酸ナトリウムバッファーの場合に最も高い活性
が測定された。

【００６５】本発明のＤ−アミダーゼの全アミノ酸配列
とインターネットを介したＮＣＢＩのタンパク質データ
バンクに存在するアミダーゼ（プログラムＢＬＡＳＴＰ
２.２.１を有するhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/blas
t、データベース：nr, pat, SwissProt）の比較によ
り、多くの公知のアミダーゼとの類似性が導かれる。最
も良好なケースでは、アミノ酸配列の類似性は、Ｍｙｃ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来
の可能なアミダーゼに対して６６％（３０３／４５７Ａ
Ａ）であり、５０％同一（２２９／４５７ＡＡ）である
ことが分かった（gi: 6225047; Cole, S. T. et. al.
(1988), Deciphering the biology of Mycobacterium t
uberculosis from the complete genome sequence, Nat
ure 393, 537〜544）。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ種由来
の５２％および３７％のエナンチオ選択的アミダーゼ
は、２番目によく似たタンパク質であり（gi: 152052;
Mayaux,J. -F,; Cerbelaud, E.; Soubrier, F.; Yeh,
P.; Blanche, F.; Petre, D. (1991), Purification, C
loning, and Primary Structure of a New Enantiomer-
Selective Amidase from a Rhodococcus Strain: Struc
tural Evidence for a Conserved Genetic Coupling wi
th Nitrile Hydratase, J. Bacteriol/ 173, 6694〜670
4）、これはＮ−末端の比較においてすでにＤ−アミダ
ーゼと高い相同性を有する。

【００６６】すなわち本発明は、特に、ＤＬ−Ｔｌｅ−
ＮＨ_２を優れたｅｅ値および収量でＤ−Ｔｌｅへ変換す
ることができる新規Ｄ−アミダーゼに関する。これまで
アミノ酸の光学対掌体を得ることは困難であるとされて
きたので、新規Ｄ−アミダーゼの報告は、生物活性ペプ
チド類似体に有利に使用できる非天然アミノ酸の工業的
製造に向けての重要な一歩を意味するものである。

【００６７】使用にあたり、問題の酵素は、均質に精製
した化合物または組換え法により製造された酵素とし
て、遊離の形で使用できる。酵素はさらに、任意の所望
の程度まで精製し、未処理のゲスト有機体の成分とし
て、またはホスト有機体の破壊細胞マスと組み合わせて
使用できる。固定形での酵素の使用も可能である（Shar
maB. P.; Bailey L. F. and Messing R. A. (1982), Im
mobilisierete Biomaterialiern-Techniken und Anwend
ungen, Angew. Chem. 94, 836〜852）。固定は有利に凍
結乾燥により実施される（Paradkar, V. M.; Dordick,
J. S. (1994), Aqueous-Like Activity of α-Chymotry
psin Dissolved in Nearly Anhydrous Organic Solvent
s, J. Am. Chem. Soc. 116, 5009〜5010; Mori, T.; Ok
ahata, Y.(1997), A variety of lipi-coated glycosid
e hydrolases as effective glycosyl transfer cataly
sts in homogeneous organic solvents, Tetrahedron L
ett. 38, 1971〜1974; Otamiri M.; Adlercreutz, P.;
Matthiasson, B. (1992), Complex formation between
chymotrypsin and ethyl cellulose as a means tosolu
bilize the enzyme in active form in toluene, Bioca
talysis 6, 291〜305）。界面活性物質、例えばＡｅｒ
ｏｓｏｌ ＯＴまたはポリビニルピロリドンまたはポリ
エチレングリコール（ＰＥＧ）またはＢｒｉｊ５２（ジ
エチレングリコールモノセチルエーテル）（Kamiya,
N.; Okazaki, S. -Y.; Goto, M. (1997), Surfactant-h
orseradish peroxidase complex catalytically active
in anhydrous benzene, Biotechnol. Tech. 11, 375〜
378）の存在下での凍結乾燥が、特に非常に有利であ
る。ＣＬＥＣとしての使用も想定できる（St. Clair,
N.; Wnag, Y. -F.; Margolin, A. L. (2000), Cofactor
-bound cross-inked enzyme crystals (CLEC) of alcoh
ol dehydrogenase, Angew. Chem. Int. Ed. 39, 380〜3
83）。

【００６８】本発明の内容において、光学的にリッチな
（エナンチオリッチな、エナンチオマーリッチな）化合
物とは、他方との混合物の中で、一方の光学対掌体が＞
５０ｍｏｌ％で存在していることを意味すると理解され
る。

【００６９】核酸という用語には、一本鎖または二本鎖
ＤＮＡおよびＲＮＡのあらゆる種類またはそれらの混合
物が包含される。

【００７０】改良されたｒｅｃ−酵素とは、請求項のも
のを意味し、特に、変化した基質スペクトルを有し、よ
り活性でありかつ／または選択的でありまたは反応条件
下でより安定な酵素であると理解される。

【００７１】また、本発明において請求されるタンパク
質配列および核酸配列は、当該配列の活性または目的様
式が維持される限り、当該配列の１つに対して８０％を
上回る、有利には９０％、９１％、９２％、９３％また
は９４％を上回る、より有利には９５％または９６％を
上回る、および特に有利には９７％、９８％または９９
％を上回る相同性を有する（自然縮重を除く）。ここで
使用される用語“相同性”（または同一性）は、式Ｈ
（％）＝[１−Ｖ／Ｘ]×１００で示され、ここでＨは相
同性を表し、Ｘは比較配列の核酸塩基／アミノ酸の総数
を表し、Ｖは問題の配列の比較配列と異なる核酸塩基／
アミノ酸の数を表す。あらゆる場合に、アミノ酸配列を
コードする核酸という用語には、遺伝暗号の縮重によっ
て可能と思われる全ての配列が含まれる。

【００７２】本明細書に引用される参考文献も開示によ
り組み込まれたものと見なす。

【００７３】

【配列表】

【００７４】

【外２】

【００７５】

【外３】

【００７６】

【外４】

【００７７】

【外５】

【００７８】

【外６】

【００７９】

【外７】

【００８０】

【実施例】実施例： １. Ｄ−アミダーゼを誘導するための株Ｖａｒｉｏｖ
ｏｒａｘ ｐａｒａｄｏｘｕｓ ＤＳＭ １４４６８の
培養 Ｄ−アミダーゼを誘導するために、株Ｖａｒｉｏｖｏｒ
ａｘ ｐａｒａｄｏｘｕｓ １９−３ ＤＳＭ １４４
６８を、窒素源としてラセミＴｌｅ−ＮＨ_２を用いて、
最少培地中で培養した；最少培地の組成は以下の通りで
ある：

【００８１】

【表６】

【００８２】

【表７】

【００８３】１.２ｂａｒ下に１２１℃で２０分オート
クレーブすることにより、滅菌した。グルコース、Ｃａ
Ｃｌ_２、ＭｇＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ、ビタミン溶液およびＤ
Ｌ−Ｔｌｅ−ＮＨ_２がこの種の滅菌と敏感に反応するの
で、これらをオートクレーブ後にのみ、０.２μｍ膜（S
artorius）で濾過滅菌して栄養溶液に添加した。

【００８４】２. Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｐａｒａｄ
ｏｘｕｓおよびＥ.Ｃｏｌｉ由来の粗抽出物の獲得 遠心により回収した後、培養物をリン酸カリウムバッフ
ァー、１００ｍＭ ｐＨ７.５で一度洗浄し、２０％の
細胞懸濁液に調節した。分析規模での細胞破壊を、Ｒｄ
ｔｓｃｈ社製の振動ミルでの湿破砕（Hummel, W.; Kul
a, M. -R.(1989), A Simple Method for Small Scale D
isruption of Bacteria and Yeasts, J.Microbiol. Met
hods 9, 201〜209）またはＢｒａｎｓｏｎ社製のＰｕｌ
ｓｅｓＳｏｎｉｆｉｅｒを用いた超音波により実施し
た。

【００８５】プロテアーゼ活性を低めるために、全ての
処理工程を４℃までの冷却下で実施した。粗抽出物のブ
ラッドフォードのタンパク質含量測定（Bradford, M.
M. (1976), A Rapid and Sensitive Method for the Qu
antitation of Microgram Quantities of Protein Util
izing the Principle of Protein Dye Binding, Anal.B
iochem. 72, 248〜254）により、破壊物の質が評価でき
る。

【００８６】振動ミルによる湿破砕：ガラスビーズ１.
２ｇ（直径０.３３ｍｍ）および細胞懸濁液０.６ｍｌを
１.５ｍｌのエッペンドルフカップに導入し、振動ミル
により、最大振動速度で１０分破壊した。ガラスビーズ
および細胞破壊屑を、１００００ｒｐｍで４℃で１０分
遠心分離することにより、細胞ホモジネートから分離
し、上清を酵素試験の粗抽出物として使用した。

【００８７】超音波破砕：Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｐａ
ｒａｄｏｘｕｓ培養液を、最大１０ｍづつ、それぞれ６
０秒の中間冷却を実施しながら、７０％パルス、８０％
強度で８×６０秒バーストして破壊した。Ｅ.Ｃｏｌｉ
培養液を、１ｍｌづつ、それぞれ６０秒の中間冷却を実
施しながら、７０％パルス、８０％強度で４×６０秒バ
ーストして破壊した。細胞ホモジネートを遠心分離し、
粗抽出物を回収した。

【００８８】Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｐａｒａｄｏｘｕ
ｓからＤ−アミダーゼを精製するための破壊を、２０〜
２００ｍｌの体積で、ＩＭＡ社製Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａ
ｔｏｒ Ｓ 中で実施した。このために、細胞懸濁液と
ガラスビーズ（直径０.３ｍｍ）とを、１：１.５の割合
で混合し、細胞を３５００ｒｐｍで２０分破壊した。

【００８９】２. ＤＳＭＺ完全培地Ｎｏ.１中でのＶａ
ｒｉｏｖｏｒａｘ ｐａｒａｄｏｘｕｓ ＤＳＭ １４
４６８株の培養およびゲノムＤＮＡの製造 このために、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｐａｒａｄｏｘｕ
ｓ株をＤＳＭＺ完全培地Ｎｏ.１中で培養し、約１.０の
光学密度ＯＤ_６６０とした；組成（DSMZ, Catalogue of
Strains (1998), Braunschweig）：

【００９０】

【表８】

【００９１】培養物を滅菌条件下に回収し、滅菌リン酸
カリウムバッファー２０ｍＭ ｐＨ６.５で一度洗浄し
た。

【００９２】ゲノムＤＮＡをＤｎｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕ
ｅ Ｋｉｔ（Qiagen）で製造した。Ｑｉａｇｅｎ Ｄｎ
ｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ Ｈａｎｄｂｏｏｋ
（４／９９）のグラム陰性菌に関するプロトコールに従
って製造した。

【００９３】

【表９】

【００９４】記号Ｓは、ＡＡＨ−Ｎ１およびＡＡＨ−Ｃ
１（重複の同一性に関するＩＵＢグループコード）の配
列中のＧ＋Ｃを表す。

【００９５】４. 遺伝子操作法 ここで使用される全ての遺伝子操作法は、特に記載のな
い限り、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等の記載（Sambrook, J.; Fr
itsch, E. F. and Maniatis, T. (1989), Molecular cl
oning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring H
arbor Laboratory Press, New York）Ｈｏｐｗｏｏｄ等
の記載（Hopwood, D. A.; Bibb, M. J.;Chater, K. F.;
Kieser, T.; bruton, C. J.; Kieser, H. M.; Lydiat
e, D. J.; Smith, C. P.; Ward, J. M.; Schrempf, H.
(1985), Genetic manipulation of Streptomycetes: A
laboratory manual, The John Innes Foundation, Norw
ich）に従うものとする。全ての酵素および相当のバッ
ファーを製造者の指示に従って使用した。シークエンス
は、Ｓｅｑｕｉｓｅｒｖｅ、Ｖａｔｅｒｓｔｅｔｔｅｎ
により実施した。

【００９６】５. ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） ポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ増幅を、Ｓａｉｋｉ
等の方法によりＢｉｏｍｅｔｒａ Ｐｅｒｓｏｎａｌ
Ｃｙｃｌｅｒ^ＴＭ（Goettingen）で実施した（Saiki,
R. K.; Gelfand, D. H.; Stoffel, S.; Scharf, S. J.;
Higuchi, R.; Horn, G. T.; Mullis, K. B.; Ehrilic
h, H. A. (1988), Primer-directed enzymatic amplifi
cation of DNA with a thermostable DNA polymerase,
Science 239; 487〜491）。

【００９７】製造者の提供する熱安定ポリメラーゼＶｅ
ｎｔ_Ｒ ^（Ｒ）（New England Biolabs）およびＨｅｒｃ
ｕｌａｓｅ^ＴＭ（Stratagene）ならびにバッファーを使
用した。使用したプライマーペアを表１０に列挙する。

【００９８】ＰＣＲにより、ＧｅｎｏｍｅＷｌａｋｅｒ
法（Stratagene）によるゲノムＤＮＡから、最初に５０
９ｂｐの大きさを有するＤ−アミダーゼ遺伝子のフラグ
メントを増幅し、Ｄ−アミダーゼの全遺伝子配列が存在
した後に、全Ｄ−アミダーゼ遺伝子を増幅した。ベクタ
ーｐＵＣ１８中でのＤ−アミダーゼ遺伝子配列の保護お
よび確認後、プラスミドＤＮＡをテンプレートとして使
用した。

【００９９】

【表１０】

【０１００】ＰＣＲバッチを、軽油約５０μｌの層で覆
った。ＰＣＲプログラムのために、アニーリング温度Ｔ
Ａを、オリゴヌクレオチドのＤＮＡ溶融温度（Ｔｍ）に
より決定した。ＤＮＡポリメラーゼの連鎖反応時間Ｘ
は、原則として１ｋｂ＝１分であった。

【０１０１】

【表１１】

【０１０２】工程２〜４を１０回実施し、工程３のアリ
ーリング温度は１サイクル毎に−１℃低下させた。工程
５〜７を２０回実施した。

【０１０３】

【表１２】

【０１０４】工程２〜３を１０回実施し、次いで工程４
〜５を２０回実施した。

【０１０５】

【表１３】

【０１０６】工程２〜４を１２回実施し、工程３のアニ
ーリング温度を１サイクル毎に−１℃低下させた。工程
５〜７を２０回実施した。

【０１０７】ＰＣＲ産物の精製および単離を、ＰＣＲ
Ｐｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Qiagen）または全Ｐ
ＣＲバッチのアガロースゲル電気泳動により直接実施
し、次いで、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｒａｋｔ
ｉｏｎ Ｋｉｔ（Qiagen）によりＤＮＡフラグメントを
単離した。

【０１０８】６. 全Ｄ−アミダーゼ遺伝子を見出すた
めのＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ
^ＴＭ法（Clontech） すでに公知の５０９ｂｐの大きさを有するＤ−アミダー
ゼフラグメント（配列５）の助成により、Ｕｎｉｖｅｒ
ｓａｌ ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ^ＴＭＫｉｔは、Ｖａ
ｒｉｏｖｏｒａｘ ｐａｒａｄｏｘｕｓ由来のゲノムＤ
ＮＡから出発して、全Ｄ−アミダーゼのＰＣＲ−仲介ク
ローニングを可能にした。

【０１０９】いわゆる“ＧｅｎｏｍｅＷｌａｋｅｒライ
ブラリー”のために、ゲノムＤＮＡを４種の異なる制限
酵素で加水分解した（ＥｃｏＲ Ｖ、Ｓｃａ Ｉ、Ｐｖ
ｕＩＩおよびＳｔｕ Ｉ）。ＤＮＡ制限バッチの精製後
に、含有のＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒアダプターを用い
てそれぞれ平滑末端結合させるが、このために２つのア
ダプタープライマー（ＡＰ１およびＡＰ２）が存在す
る。ゲノムＤＮＡ制限およびアダプターの結合を、Ｕｎ
ｉｖｅｒｓａｌ ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ^{Ｔ Ｍ}Ｋｉｔ
Ｕｓｅｒ Ｍａｎｕａｌ（３／２０００、Clontech）
に従って実施した。

【０１１０】ライブラリーは、最初のＰＣＲ反応（プラ
イマリーＰＣＲ）のためのテンプレートとして機能し
た。両方向のＰＣＲ反応のそれぞれに、プライマーペア
ＡＰ１／ＡＡＨ−ＧＷ−Ｆ１（下流）およびＡＰ１／Ａ
ＡＨ−ＧＷ−Ｒ１（上流）を使用した。Ｈｅｒｃｕｌａ
ｓｅ^（Ｒ）（Stratagene）ＤＮＡポリメラーゼとして使
用して、大きなＤＮＡフラグメント（“長鎖ＰＣＲ”）
の増幅を可能にした。

【０１１１】

【０１１２】

【表１４】

【０１１３】ＰＣＲバッチを、軽油約５０μｌの層で覆
った。

【０１１４】

【表１５】

【０１１５】工程２〜３を１０回繰り返した。工程４〜
５を２５回繰り返し、工程５の時間を、１サイクル毎に
１０秒間延長した（時間の延長）。

【０１１６】第２ＰＣＲ（セカンダリーまたはネストＰ
ＣＲ）を、得られたＰＣＲ産物により、プライマーペア
ＡＰ２／ＡＡＨ−ＧＷ−Ｆ２（下流）およびＡＰ２／Ａ
ＡＨ−ＧＷ−Ｒ２（上流）を用いて実施し、これによ
り、非特異的ＰＣＲ産物の形成が最小化できた。ＰＣＲ
増幅産物を濃度に応じて、脱塩水（aq. demin.）により
１：５０以上に希釈し、この形でテンプレートとして使
用した。

【０１１７】

【表１６】

【０１１８】ＰＣＲバッチを軽油約５０μｌの層で覆っ
た。

【０１１９】

【表１７】

【０１２０】工程２〜３を１０回実施し、次いで工程４
〜５を２０回実施した。

【０１２１】第２のＰＣＲで得られたＰＣＲ産物をアガ
ロースゲル中で分離し、主要な増幅産物を精製し、記載
のようにして配列決定した。要約すると、Ｇｅｎｏｍｅ
Ｗａｌｋｅｒライブラリーから出発して、第２のＰＣＲ
後に以下のようなＰＣＲ増幅産物が得られた。

【０１２２】

【表１８】

【０１２３】６. ＰＣＲ産物のベクターｐＵＣ１８へ
の結合およびその後のＥ.ＣｏｌｉＸＬ１Ｂｌｕｅへの
クローニング 更なる処理のために、開始コドンの前に９２ｂｐを有し
かつ停止コドンの後に８０ｂｐを有する３種の類似バッ
チ由来のＰＣＲ産物をベクターｐＵＣ１８（Rochie Bio
chemicals）へ結合し、Ｅ.ＣｏｌｉＸｌ１Ｂｌｕｅを形
質転換した。これらの技術はＳａｍｂｒｏｏｋ等（Samb
rook, J.; Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989),
Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., C
old Spring Harbor Laboratory Press, New York）およ
びＨｏｐｗｏｏｄ等（Hopwood, D. A.; Bibb, M. J.; C
hater, K. F.; Kieser, T.; Bruton, C. J.; Kieser,
H.M; Lydiate, D. J.; Smith, C. P.; Ward, J. M.; Sc
hrempf, H.(1985), Genetic manipulation of Streptom
ycetes: A laboratory manual, The John Innes Founda
tion, Norwich）が詳細しており、従って専門家が精通
している。

【０１２４】プラスミドのＤ−アミダーゼ遺伝子配列
（配列１）をシークエンスにより確認したところ、３種
のバッチで同一であった。プラスミドをｐＵＣ−ＡＡＨ
と呼称した（図４）。ｐＵＣ−ＡＡＨのプラスミドマッ
プを図４に示す。ｐＵＣ１８中の、ａａｈ遺伝子を含み
１.６ｋｂの大きさで、開始コドンの前に９２ｂｐおよ
び停止コドンの後に８０ｂｐを有するＰＣＲ産物を示す
（プライマーペア：ＡＡＨ−Ｋ−Ｎ２／ＡＡＨ−Ｋ−Ｃ
２）。

【０１２５】７. Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｐａｒａｄ
ｏｘｕｓ由来のＤ−アミダーゼ酵素のＥ.ＣｏｌｉＪＭ
１０１中での異種発現 すでに項目５で述べたように、ＰＣＲ反応によりＤ−ア
ミダーゼの発現のためにプラスミドｐＵＣ−ＡＡＨから
出発し、ＥｃｏＲＩ切断部位を５’末端に導入し、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ切断部位を３’末端に導入し、ＰＣＲ産物を
ｐＢＴＡＣベクターに結合させ、発現株Ｅ.ＣｏｌｉＪ
Ｍ１０１に形質転換させた。

【０１２６】標準的な異種発現をＳａｍｂｒｏｏｋ等の
方法により実施した（Sambrook, J.; Fritsch, E. F. a
nd Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a labor
atory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laborato
ry Press, New York）。

【０１２７】形質転換したＥ.ＣｏｌｉＪＭ１０１誘導
体をＬＢ培地（０.１ｍｇ／ｍｌ）で３７℃で一晩イン
キュベートした。培地３０ｍｌ（バッフルフラスコ中の
アンピシリン０.１ｍｇ／ｍｌを含むＬＢ培地）を、一
晩培養した培養物（１：１００）０.３ｍｌと一緒にイ
ンキュベートした。アミダーゼの発現を１Ｍ ＩＰＴＧ
溶液（培養物１ｍＭ中の濃度；ＩＰＴＧ＝イソプロピル
チオガラクトシド）０.３μｌを用いて、細胞密度ＯＤ
_{６００ｎｍ}＝０.４〜０.６で誘導した。３０℃で４〜６
時間インキュベートした後、細胞を回収した。

【０１２８】前記の方法で培養した発現クローンの粗抽
出物では、基質としてＤＬ−Ｔｌｅ−ＮＨ_２を用いて測
定して、総タンパク質に対するＤ−アミダーゼの活性が
８０〜２１０ｍＵ／ｍｇであった。

【０１２９】８. Ｄ−アミダーゼ活性の実証 Ｄ−アミダーゼによるｔｅｒｔ−ロイシンアミド（gen.
acid amides）の変換において、アンモニアまたはアン
モニウムイオンおよびｔｅｒｔ−ロイシン（gen. aci
d）が等量で形成される。ＨＰＬＣによるアンモニウム
イオンおよびｔｅｒｔ−ロイシン形成の増加の測定は、
従って、アミダーゼ活性を実証するのに利用できた。含
有される成分の濃度変化は、酵素試験で測定でき、この
試験では、試験バッチを３０℃で１０〜６０分インキュ
ベーションする。

【０１３０】

【表１９】

【０１３１】酵素試験は、基質を添加することにより開
始され、反応は、９５℃で３分加熱することにより停止
した。反応生成物の分析は、アンモニウムイオンに関し
てグルタメートデヒドロゲナーゼにより（Bergmeyer,
H., U., and Beutler, H. -O.(1985) Ammonia, In: Met
hods of Enzymatic Analysis. VCH- Verlag, 3rd editi
on, vol. 8: 454〜461, Weinheim）ならびにＤ−ｔｅｒ
ｔ−ロイシンおよびＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに関してＨ
ＰＬＣにより（Brueckner, H., Wittner R., and Godel
H., (1991) Fully automated high-performance liqui
d chromatographic separation of DL-amino acids der
ivatized with 0-phthaldialdehyde together with N-i
sopropyl-cysteine. Application to food samples. An
al. Bioche,. 144(1): 204〜206）実施された。基質を
添加していないバッチをコントロールとした。

【０１３２】９. グルタメートデヒドロゲナーゼによ
るアンモニウムイオンの酵素測定 酵素グルタメートデヒドロゲナーゼ（ＧｌｕＤＨ；Ｅ.
Ｃ.１.４.１.３）は、２−オキソグルタレートをＬ−グ
ルタメートに変換し、この際アンモニウムイオンを消費
し、ＮＡＤＨを酸化してＮＡＤ^＋を生じる（Bergmeyer,
H., U. and Beutler, H. -O. (1985), Ammonia. In: m
ethods of Enzymatic Analysis. VCH-Verlag, 3rd edit
ion, vol. 8: 454〜461, Weinhaeim）。

【０１３３】反応中に消費されるＮＡＤＨの量はアンモ
ニウムイオンの量に等しい。ＮＡＤＨ濃度の変化が測定
パラメーターであり、３４０ｎｍの波長で分光光度計に
より測定できる。

【０１３４】試験溶液：２−オキソグルタレート／ＡＤ
Ｐ／ＴＥＡバッファー：脱塩水１００ｍｌ中、ＴＥＡ
９.３ｇ、ＡＤＰ ９５ｍｇ、２−オキソグルタレート
６７０ｍｇ、ｐＨ８.０。

【０１３５】ＮＡＤＨ溶液：ＮＡＤＨ ３０ｍｇ、ＮＡ
ＨＣＯ_３ ６０ｍｇを脱塩水６ｍｌに溶解。

【０１３６】グルタメートデヒドロゲナーゼ：５０％グ
リセロール中の子牛肝臓に由来するもの、１２０Ｕ／ｍ
ｇ。

【０１３７】

【表２０】

【０１３８】試験成分をプラスチック製のセルにピペッ
トで分注し（少量の使い捨てセル、Brand、１.５ｍ
ｌ）、混合し、３４０ｎｍでの吸光度を５分後に測定し
た。ＧｌｕＤＨ１０μｌを添加し、反応終了後（原則と
して３０分後）に、吸光度を再度測定した。

【０１３９】吸光度の変化ΔＥを、最初の値から２回目
の値を引くことにより算出した。特定のサンプルでは２
ｍＭまでの範囲のアンモニウムイオンの測定値が得られ
た。

【０１４０】サンプルバッチとコントロールとの比較
で、計測値が、Ｄ,Ｌ−Ｔｌｅ−ＮＨ _２から遊離したア
ンモニウムに対して計測されたものであるかまたは粗抽
出物中にすでに存在したアンモニウムに対して計測され
たものであるのかが分かる。

【０１４１】塩化アンモニウムの量による検定線のプロ
ットから、吸光度変化に由来するアンモニウムイオン濃
度を測定できる。

【０１４２】１０. ＨＰＬＣでＤ−およびＬ−ｔｅｒ
ｔ−ロイシンを測定するためのＯＰＡ／ＩＢＣ誘導化 エナンチオマーＤ−およびＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの分
離および定量的測定を、ｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰ
Ａ）／Ｎ−イソブチリル−Ｌ−システインまたはＮ−イ
ソブチリル−Ｄ−システインをベースとする“キラル誘
導化”により実施した（Brueckner, H.; Wittner R. an
d Godel H. (1991), Fully automated high-performanc
e liquid chromatographic separation of DL-amino ac
ids dericatized with o-Phthaldialdehyde together w
ith N-isopropyl-cycteine. Application to food samp
les. Anal. Biochem. 144, 204〜206）。形成されたジ
アステレオマーイソインドール誘導体をＲＰ−１８（逆
相）カラムで分離し、蛍光検出した。水性酢酸バッファ
ーおよびアセトニトリル／水混合物の２種類のバッファ
ー系を移動相に使用した。

【０１４３】クロマトグラフィー条件： 固定相：Ｋｒｏｍａｓｉｌ^ＴＭＨＰＬＣカラム、２５０
×４ｍｍ、５μｍ、１００Å（Eka Nobel） 移動相： 移動相Ａ：酢酸ナトリウム２３ｍＭ、ｐＨ６.０ 移動相Ｂ：アセトニトリル（ＨＰＬＣ用）および脱塩
水： １０：１.５（ｖ／ｖ） 流速：１ｍｌ／ｍｉｎ サンプル体積：２０μｌ 検出：蛍光：励起３４０ｎｍ／発光４４０ｎｍ。

【０１４４】

【表２１】

【０１４５】１１. Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｐａｒａ
ｄｏｘｕｓ由来のＤ−アミダーゼの精製 Ｄ−アミダーゼの精製を、細胞破壊後の３種のクロマト
グラフィー工程で実施した。

【０１４６】１. イオン交換クロマトグラフィー： カラム材料：Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Pharmaci
a） バッファーＡ：リン酸カリウムバッファー、２０ｍＭ、
ｐＨ６.５ バッファーＢ：バッファーＡ＋１５０ｍＭ Ｎａ_２ＳＯ
_４ 直線勾配により溶離。

【０１４７】２. 疎水性相互作用クロマトグラフィー カラム材料：Ｂｕｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆ
Ｆ（Pharmacia） バッファーＡ：リン酸カリウムバッファー、２０ｍＭ、
ｐＨ６.５＋１５０ｍＭ Ｎａ_２ＳＯ_４ バッファーＢ：リン酸カリウムバッファー、２０ｍＭ、
ｐＨ６.５ 直線勾配により溶離。

【０１４８】３. ゲル濾過クロマトグラフィー カラム材料：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＰＧ（Pharma
cia） バッファー：リン酸カリウムバッファー、２０ｍＭ、ｐ
Ｈ６.５＋１８０ｍＭ ＮａＣｌ 第２工程後には一般的に外来タンパク質は低含量でしか
存在しない。最初の２段階の精製工程で８８％の収率が
算出でき、ＤＬ−Ｔｌｅ−ＮＨ_２に対して０.６８Ｕ／
ｍｇの特異活性が存在した。均質に精製したＶａｒｉｏ
ｖｏｒａｘ ｐａｒａｄｏｘｕｓ由来のＤ−アミダーゼ
では、ＤＬ−Ｔｌｅ−ＮＨ_２に対して１.４Ｕ／ｍｇの
特異活性が得られた。

【０１４９】１２. Ｄ−アミダーゼの至適温度の決定 実質的に均質に精製された特異活性約１.３Ｕ／ｍｇの
酵素を、至適温度の決定に使用した。項目８のように、
ＤＬ−Ｔｌｅ−ＮＨ_２を基質として使用した活性の測定
を、２０℃〜５０℃で５℃毎に実施し、４０℃〜５５℃
で更に測定して詳細を調査した。選択したインキュベー
ション時間は比較的短く１５分であった。温度の関数と
しての一連の活性を図２に示す。

【０１５０】１３. Ｄ−アミダーゼの至適ｐＨの決定 このために、イオン交換クロマトグラフィー後の部分的
に精製された酵素を用いて、以下のバッファー物質を使
用し、３.５〜１１の範囲のｐＨ値で活性を測定した。

【０１５１】

【表２２】

【０１５２】項目８のように、ＤＬ−Ｔｌｅ−ＮＨ_２を
基質としかつ３０℃で３０分インキュベートすることに
より活性を測定した。ｐＨおよび特異的バッファー物質
の関数としての一連の活性を図３に示す。

【図面の簡単な説明】

【図１】変換の関数としてのＤ−Ｖａｌ、Ｄ−Ｌｅｕお
よびＤ−Ｐｈｅのエナンチオ選択性を示す図である。

【図２】温度に関する活性の依存性を示す図である。

【図３】ｐＨに関する活性の依存性を示す図である。

【図４】ｐＵＣ−ＡＡＨのプラスミドマップを示す図で
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 9/90 9/80 Ｃ１２Ｐ 7/40 9/90 13/04 Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 13/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 5/00 Ａ (72)発明者 アンドレアス ボンマリウス アメリカ合衆国 ジョージア アトランタ ヴァーノン スプリングス コート 1105 (72)発明者 マリア−レギーナ クラ ドイツ連邦共和国 ニーダーツィール ゼ ルゲンブッシュ 12 (72)発明者 ルッツ クリーク ドイツ連邦共和国 ユーリッヒ ミュンヒ ナー シュトラーセ ５ (72)発明者 ハイケ スルザルツィク ドイツ連邦共和国 ユーバッハ−パーレン ベルク ウアヴェーク ８ (72)発明者 マリオン アンゾルゲ−シューマッハー ドイツ連邦共和国 アーヘン レレナー シュトラーセ 81−83 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 BA07 BA11 CA03 CA20 DA06 EA04 GA11 GA19 GA25 HA03 4B050 CC01 CC04 DD02 EE01 FF09E FF11E FF12E GG01 HH01 LL03 LL05 4B063 QA01 QQ30 QQ42 QQ52 QR08 QR32 QR35 QR39 QR42 QR55 QR62 QS16 QS25 QS34 QS36 QX01 QX02 4B064 AD01 AE03 CA21 CB06 CC01 CE07 CE10 CE11 DA01 DA16 4B065 AA01Y AA26X AA58X AA72X AA87X AB01 AC14 BA02 BA16 CA27 CA31 CA44 (54)【発明の名称】 Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ由来のＤ−アミダーゼ、それをコードする遺伝子、そのような核酸を含有 するプラスミド、ベクターおよび微生物、ハイブリダイズする核酸、核酸を製造するためのプラ イマー、改良されたｒｅｃ−アミダーゼ、コードｒｅｃ−アミダーゼおよび核酸の製法、Ｄ−ア ミダーゼおよび核酸の使用、ならびに全細胞触媒

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ由来のＤ−アミダ
   ーゼ。
2. 【請求項２】 Ｖ．ｐａｒａｄｏｘｕｓ１９−３ＤＳＭ
   １４４６８を起源とすることを特徴とする、請求項１に
   記載のＤ−アミダーゼ。
3. 【請求項３】 請求項１または２に記載のアミダーゼを
   コードする核酸。
4. 【請求項４】 請求項３に記載の核酸を１種以上含有す
   ることを特徴とする、プラスミド、ベクターおよび微生
   物。
5. 【請求項５】 ストリンジェントな条件下に請求項３に
   記載の一本鎖核酸または相補的な一本鎖核酸とハイブリ
   ダイズすることを特徴とする、核酸。
6. 【請求項６】 請求項３または５に記載の核酸をＰＣＲ
   により製造するためのプライマー。
7. 【請求項７】 請求項１に記載のアミダーゼをコードす
   る核酸を出発物質とする、改良されたｒｅｃ−アミダー
   ゼの製法において、該方法が、 ａ）核酸を突然変異させ、 ｂ）ａ）で得られた核酸を好適なベクター中にクローン
   化し、これを好適な発現系に移入し、 ｃ）改良された活性および／または選択性を示すタンパ
   ク質を検出および単離するの工程から成ることを特徴と
   する、改良されたｒｅｃ−アミダーゼの製法。
8. 【請求項８】 請求項７のようにして得られるｒｅｃ−
   アミダーゼまたはそれらをコードする核酸。
9. 【請求項９】 カルボン酸またはキラルエナンチオリッ
   チな有機化合物、例えばアミノ酸を製造するための、請
   求項１または７に記載のＤ−アミダーゼの使用。
10. 【請求項１０】 全細胞触媒を製造するための、請求項
    ２または７に記載の核酸の使用。
11. 【請求項１１】 クローン化したニトリルヒドラターゼ
    の遺伝子およびクローン化したアミダーゼの遺伝子およ
    び場合によりクローン化したα−アミノニトリルラセマ
    ーゼ、シアノヒドリンラセマーゼ、α−ヒドロキシカル
    ボン酸ラセマーゼまたは（α−またはβ−）アミノ酸ア
    ミドラセマーゼの遺伝子を含有することを特徴とする、
    全細胞触媒。
12. 【請求項１２】 Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ由来のＤ−アミ
    ダーゼであることを特徴とする、請求項１１に記載の全
    細胞触媒。
13. 【請求項１３】 Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｐａｒａｄｏ
    ｘｕｓ、有利にＤＳＭ１４４６８由来のＤ−アミダーゼ
    であることを特徴とする、請求項１２に記載の全細胞触
    媒。
14. 【請求項１４】 Ｖｏｒｉｏｖｏｒａｘ ｐａｒａｄｏ
    ｘｕｓ１９−３ ＤＳＭ１４４６８。