KR101209700B1

KR101209700B1 - 메타게놈 유래 신규 저온성 에스터라제

Info

Publication number: KR101209700B1
Application number: KR1020100098414A
Authority: KR
Inventors: 송재광; 유은영; 이미애; 권민아; 최지은; 송봉근
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2010-10-08
Filing date: 2010-10-08
Publication date: 2012-12-10
Also published as: KR20120036635A

Abstract

본 발명은 국내외 다양한 환경에서 구축한 미생물 메타게놈 라이브러리에서 분리한 신규 저온성 에스터라제(esterase), 이를 암호화하는 유전자, 상기 유전자들을 포함하는 재조합 벡터, 상기 발현벡터가 형질 도입된 형질전환체 및 상기 에스테라제의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 신규 저온성 에스터라제는 PH 8 ~ 10, 바람직하게는 PH 9에서 우수한 활성을 나타내고, 0℃ ~ 20 ℃에서 우수한 저온 활성을 가지고 있으므로 다양한 산업에 이용될 수 있다.

Description

메타게놈 유래 신규 저온성 에스터라제{Novel genes encoding low temperature-adapted esterases}

본 발명은 신규 에스터라제(esterase)에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 국내외 다양한 환경의 메타게놈 라이브러리에서 분리한 신규 저온성 에스터라제, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자들은 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 미생물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

에스터라제(esterase)는 트리글리세라이드(triglyceride)의 에스터(ester) 결합을 가수분해하는 효소로, 주로 이화과정에서 에스터 결합을 가수분해하게 되는데, pH 5 ~ 8 및 30 ~ 37℃의 온도 조건에서 가장 우수한 활성을 갖으며, 그 분해산물로는 산(무기산도 포함)과 알콜(alcohol)류 또는 페놀(phenol)류(-OH 화합물) 및 티올(thiol)류 등이 있다. 에스터라제는 에스터 결합의 분해나 합성 반응에서 테트라하이드로이소퀴놀린(tetrahydroisoquinoline), 아자비싸이클로노난(azabicyclononane), 인돌마이신(indolemycine)과 같은 생리활성물질의 광학 합성에 유용하게 이용될 수 있다. 특히, 높은 기질 특이성 및 광학활성 특이성 등의 고유한 특성에 의해 폭넓게 이용되는 주요한 효소이다.

상기 에스터라제를 포함한 신규 효소를 발굴하고자 하는 노력은 주로 배양이 가능한 미생물을 대상으로 이루어졌고, 이로부터 밝혀진 다양한 미생물 효소들이 산업적으로 이용되고 있다. 그러나 최근 많은 분자미생물 생태학의 연구들은 자연계에 존재하는 99%이상의 미생물들이 실험실에서 행해지는 전통적인 배양기법을 통해서는 분리 동정되지 않는다는 사실을 증명하였다(Amann et al., Microbiol. Rev. 59: 143-169, 1995; Hugenholtz and Pace, Trends Biotechnol. 14: 190-197, 1996; Ward et al., Nature 345: 63-65, 1990). 따라서, 실제로 배양되어 동정된 적이 없는 대다수 미생물의 효소를 찾으려는 노력이 필요하며, 이는 분자생물학적인 유전자 재조합 발현을 통하여 가능하리라 여겨진다. 이러한 접근방법의 하나로 메타게놈(metagenome)에 관한 연구가 시도되고 있다.

메타게놈은 자연계에 존재하는 모든 미생물의 유전체를 통칭하는 것으로 정의된다. 일반적으로, 메타게놈 연구는 자연계 시료로부터 미생물을 배양하지 않고 메타게놈을 분리한 후, 이들을 라이브러리로 작성하여 배양가능한 대장균에 도입하는 단계로 구성된다. 이는 배양이 불가능했던 미생물로부터 유용 산물을 확보하기 위한 방법으로, 유전자의 유래가 되는 미생물에 대한 정보는 얻기가 어려우나 미생물의 산물과 유전자를 동시에 확보할 수 있는 장점이 있다.

미국 위스콘신 대학 연구팀은 처음으로 대형의 메타게놈을 성공적으로 분리하여 BAC(bacterial artificial chromosome) 벡터에 클로닝하여 메타게놈 라이브러리를 구축하였고, 이로부터 광범위한 항생물질 및 그의 생합성에 관련된 유전자들을 분리하였다(Gillespie et al., Appl . Environ . Microbiol. 68: 4301-4306, 2002; Rondon et al., Appl . Environ . Microbiol. 66: 2541-2547, 2000). TIGR(The Institute for Genomic Research) 연구팀에서도 해양 미생물의 총 미생물 메타게놈 라이브러리를 BAC 벡터에 구축하여 해양 생태계로부터 배양되지 않는 미생물의 유전자원 탐색을 시도하고 있다.

이에 본 발명자들은 다양한 미생물이 존재하는 환경에서 구축된 다양한 메타게놈 라이브러리로부터 신규 에스터라제 유전자를 분리하여 상기 유전자를 포함하는 벡터를 제작하고, 상기 벡터를 대장균에 형질전환한 후, 상기 형질전환체로부터 생산된 단백질이 우수한 에스터라제 활성을 나타내며, 또한 저온에서 효과적으로 활성을 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 다양한 환경에서 구축한 미생물 메타게놈에서 유래한 신규 저온성 에스터라제(esterase), 이를 암호화하는 유전자, 상기 유전자들을 포함하는 재조합 벡터, 상기 발현벡터가 형질 도입된 형질전환체 및 상기 에스터라제의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 에스터라제(esterase) 활성을 갖는 하기 a 내지 c 중 어느 하나의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 변이체 또는 이의 활성 단편 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다:

a) 서열번호 5로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드;

b) 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건에서 혼성되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드; 및,

c) 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.

또한, 본 발명은 에스터라제(esterase) 활성을 갖는 하기 d 내지 f 중 어느 하나의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 변이체 또는 이의 활성 단편 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다:

d) 서열번호 6으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드;

e) 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건에서 혼성되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드; 및,

f) 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터가 숙주세포에 형질 도입된 형질전환체를 제공한다.

아울러, 1) 상기 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;

2) 상기 재조합 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및,

3) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계로 구성되는 재조합 에스터라제의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 국내외 다양한 환경에서 구축한 미생물 메타게놈 라이브러리에서 분리한 신규 저온성 에스터라제(esterase)는 pH 8 ~ 10, 바람직하게는 pH 9에서 우수한 활성을 나타내고, 0℃ ~ 20 ℃에서 우수한 저온 활성을 가지고 있으므로 다양한 산업에 이용될 수 있다.

도 1은 선별된 저온 활성 콜로니의 온도에 따른 활성을 나타낸 그림이다.
도 2는 본 발명의 에스터라제 EstM-N1의 염기서열과 아미노산 서열을 나타낸 그림이다(*: 정지코돈).
도 3은 본 발명의 에스터라제 EstM-N1과 유사한 아미노산 서열의 상동성 분석을 비교 분석한 것이다.
도 4는 본 발명의 에스터라제 EstM-N1의 계통발생트리(phylogenetic tree)를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 에스터라제 EstM-N2의 염기서열과 아미노산 서열을 나타낸 그림이다(*: 정지코돈).
도 6은 본 발명의 에스터라제 EstM-N2과 유사한 아미노산 서열의 상동성 분석을 비교 분석한 것이다.
도 7은 본 발명의 에스터라제 EstM-N2의 계통발생트리를 나타낸 도이다.
도 8은 EstM-N1, EstM-N2, 리파제 패밀리 8, 베타 락타메이즈 및 PBP의 계통발생트리를 나타낸 도이다.
도 9는 EstM-N1, EstM-N2, 유사한 서열의 에스터라제 및 에스터라제 패밀리 8에서 보존된 아미노산 서열의 상동성 분석을 나타낸 도이다.
도 10은 메타게놈 유래 에스터라제 유전자로 형질전환된 대장균에서 에스터라제의 정제를 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 에스터라제 EstM-N1의 특성을 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명의 에스터라제 EstM-N2의 특성을 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명의 에스터라제 EstM-N1의 온도 특이성 및 열 안정성을 나타낸 도이다.
도 14는 본 발명의 에스터라제 EstM-N1의 pH 특이성 및, 금속이온 및 계면활성제 특이성을 나타낸 도이다.
도 15는 본 발명의 에스터라제 EstM-N2의 온도 특이성 및 열 안정성을 나타낸 도이다.
도 16은 본 발명의 에스터라제 EstM-N2의 pH 특이성 및, 금속이온 및 계면활성제 특이성을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 에스터라제(esterase) 활성을 갖는 하기 a 내지 c 중 어느 하나의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 변이체 또는 이의 활성 단편 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다:

a) 서열번호 6으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드;

b) 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건에서 혼성되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드; 및,

c) 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 우수한 저온 활성을 나타내는 신규 에스터라제의 발굴을 위해 제주도, 목재폐기장, 주유소의 토양 샘플로부터 DNA를 추출하여 제작한 메타게놈 라이브러리를 대상으로 트리뷰티린(tributtyrin)을 효과적으로 분해하는, 우수한 에스터라제 활성을 나타내는 콜로니를 탐색하였다. 상기 콜로니의 재조합 플라스미드를 분리하여 염기서열을 분석한 결과, 서열번호 3으로 기재되는 340개 아미노산서열 및 서열번호 4로 기재되는 408개의 아미노산서열을 갖는 베타 락타메이즈(Beta-lactamase)와 유사한 에스터라제 ORF(open reading frame)를 찾을 수 있었다(도 2 및 도 5 참조). 상기 에스터라제의 아미노산 서열을 블라스트(BLAST) 프로그램을 이용하여 GenBank 및 SWISSPROT에 있는 아미노산 서열과 비교 분석한 결과, 본 발명의 2가지 유전자중 EstM-N1의 유전자는 Geodermatophilus obscurus DSM 43160의 베타 락타메이즈와 가장 높은 유사성을 나타내었으며, 이전에 보고된 베타 락타메이즈와 39 ~ 43%정도의 상동성을 보이고, 리파제/에스터라제와는 37%의 낮은 상동성을 보이므로, 본 발명의 EstM-N1은 신규한 유전자로서 확인되었다(표 4 참조). 또한, EstM-N2의 유전자는 Congregibater litoralis KT71의 베타 락타메이즈와 가장 높은 유사성을 나타내었으나, 표 5와 나타낸 바와 같이 EstM-N2 역시 신규한 유전자임을 확인하였다(표 5 참조). 또한 본 발명의 EstM-N1 유전자는 에스터라제 패밀리8(Family VIII)의 공통서열인 세린-X-X-라이신(Ser-X-X-Lys)을 103번째 메티오닌 잔기(Met), 104번째 트레오닌 잔기(Thr)로 이루어진 보존된 특이적 세작용기 촉매(catalytic triad)를 갖고 있으며, 이는 EstM-N1과 유사한 단백질에서도 모두 동일하게 보존되고 있었다(표 5 및 도 3 참조). 또한, 본 발명의 EstM-N2 유전자는 에스터라제 패밀리8(Family VIII)의 공통서열인 세린-X-X-라이신(Ser-X-X-Lys)을 107번째 발린잔기(Val), 108번째 세린잔기(Ser)로 이루어진 보존된 특이적 세작용기 촉매를 갖고 있었으며, 이는 EstM-N2과 유사한 단백질에서도 모두 동일하게 보존되고 있었다(표 6 및 도 6 참조).

본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 서열번호 3 또는 4로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 신규 에스터라제의 활성을 측정하고자, 우선 상기 신규 에스터라제를 암호화하는 서열 번호 5 또는 6의 염기서열을 갖는 에스터라제 유전자를 벡터에 클로닝하고, 상기 벡터를 대장균에 형질전환시킨 후, 상기 형질전환체로부터 생산된 에스터라제를 정제하였다. 상기 정제된 본 발명의 에스터라제를 SDS-PAGE 방법으로 확인함으로써 분자량이 각각 44 및 44.5 kDa으로 효과적으로 생산되어 발현이 이루어지고 있음을 확인하였다(도 10 참조).

또한, 본 발명의 에스터라제는 다음과 같은 특성을 나타낸다.

EstM-N1은 pH 8.0 내지 10.0 범위에서 안정적이며, pH 9.0에서 최적 활성을 나타내고(도 14 참조); 30℃에서 가장 큰 활성을 나타내며 10℃ 및 0℃에서도 최적 활성과 비교하였을 때 50% 이상의 높은 활성을 확인하였고; 효소 활성에 대한 금속이온의 영향에서는 Ca2⁺, CO2⁺, Zn2⁺, Cu2⁺에서 민감한 모습을 나타냈으며, 계면활성제의 영향에서는 SDS에 의해서 활성이 급격히 저해되었으나, 트윈80(Tween80)에서는 활성이 증가되었고, 트리톤 X-100(Triton X-100)에서도 안정적인 모습을 확인할 수 있었다(도 14). 또한, EstM-N1에서 파라-나이트로페닐 에스테르(p-Nitrophenyl ester)를 이용하여 기질 특이성을 확인해 본 결과, 파라-니트로페닐 부틸레이트(p-nitrophenyl butyrate, C4)가 C6, C8에 비해 Km값이 높지만, Kcat/Km이 가장 높게 나타나, 가장 좋은 기질로 선정되었지만, C12이상에서는 활성이 나타나지 않았으며(표 7 및 도 12 참조); 트리글리세리드 (Triglyceride)를 이용하여 특이성을 확인해 본 결과, 트리-아세틴 (Triacetin, C2)에 대한 활성이 가장 높았으며, C4는 C2에 비해 약 50%의 활성이 나타났으며, C16, C18에서는 활성이 나타나지 않았다(도 12 참조). 따라서 EstM-N1은 상대적으로 짧은 아실 사슬을 가진 기질을 더 잘 분해하는 라파제가 아니라 에스터라제임을 확인하였다.

EstM-N2은 pH 7.0 내지 10.0 범위에서 안정적이며, pH 9.0에서 최적 활성을 나타내고(도 16 참조); 20℃에서 가장 큰 활성을 나타내며 10℃ 및 0℃에서도 최적 활성과 비교하였을 때 50% 이상의 높은 활성을 확인하였으며; 효소 활성에 대한 금속이온의 영향에서는 금속이온에 대해서는 큰 영향이 없었으나, 5 mM의 이온농도에서는 Fe2⁺, Cu2⁺에서 민감한 모습을 보였고, 계면활성제에서는 SDS에 의해서 활성이 급격히 저해되었으나, 트윈80에서는 활성이 증가되었고, 트리톤 X-100에서도 안정적인 모습을 볼 수 있었다(도 16). 또한, EstM-N2에서 파라-나이트로페닐 에스테르(p-Nitrophenyl ester)를 이용하여 기질 특이성을 확인해 본 결과, 파라-니트로페닐 부틸레이트(p-nitrophenyl butyrate, C4)가 다른 기질에 비해 Km값이 높지만, Kcat/Km이 가장 높게 나타나, 가장 좋은 기질로 선정되었다. 그 외 C2 및 C10 이상의 기질에서는 거의 활성이 나타나지 않았으며(표8 및 도 12 참조), 트리글리세리드(Triglyceride)를 이용하여 특이성을 확인해 본 결과, 트리-아세틴 (Triacetin, C2)에 대한 활성이 가장 높았으며, C4는 C2에 비해 약 33%의 활성이 나타났으며, C16, C18에서는 활성이 나타나지 않았다(도 12 참조). 따라서 EstM-N2는 상대적으로 짧은 아실 사슬을 가진 기질을 더 잘 분해하는 리파제가 아니라 에스터라제임을 확인할 수 있었다.

이와 같이, 본 발명의 메타게놈 유래 에스터라제는 우수한 저온 활성을 나타내고 생산이 용이하므로 식품, 세제, 정밀화학, 화장품 및 대체에너지 산업에 유용하게 사용될 수 있다.

상기, "엄격한 조건하에서 혼성화되는 폴리뉴클레오티드"란 서열번호 5 또는 6의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 탐침자로서 사용하여 콜로니 혼성화 기술, 플라크 혼성화 기술, 서던(southern) 혼성화 기술 등에 의해 수득된, DNA 등의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 상기 혼성화 방법은, 예를 들어, 문헌[Molecular Cloning 제 3 판, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997] 등에 기재된 방법일 수 있다.

본원에 사용된 "엄격한 조건"이라는 용어는 낮은 엄격성 조건, 중간 엄격성 조건 또는 높은 엄격성 조건 중에서 임의로 선택될 수 있다. "낮은 엄격성 조건"은, 예를 들어, 32℃에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아마이드이다. "중간 엄격성 조건"은, 예를 들어, 42℃에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아마이드이다. "높은 엄격성 조건"은, 예를 들어, 50℃ 에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아마이드이다. 이들 조건하에서, 상동성이 더 높은, DNA 등의 폴리뉴클레오티드는 더욱 높은 온도에서 효율적으로 수득될 것으로 예상되지만, 혼성화 엄격성에는 온도, 탐침자 농도, 탐침자 길이, 이온세기, 시간, 염 농도 및 기타를 비롯하여 복수의 요인들이 연루되므로, 당업자는 유사한 엄격성을 구현하기 위해 이들 요인들을 적절히 선택할 수 있다.

본 발명의 서열번호 3 또는 4로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체 또는 단편을 본 발명의 범위에 포함한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호 3 또는 4로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 아미노산 서열의 상동성을 갖는 것들을 의미한다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니며, 70% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가지며 동일한 생화학적 활성을 가진다면 본원 발명에 포함된다.

또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 5 또는 6으로 기재되는 염기서열로 구성되는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명의 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 서열번호 5 또는 6의 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 포함한다. 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드란 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니며, 70% 이상의 서열 상동성을 가지며 암호화된 단백질의 동일한 생화학적 활성을 가진다면 본원 발명에 포함된다. 상술한 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 서열번호 3 또는 4로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 바람직하게는 서열번호 5 또는 6으로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자에 의해 코딩되나, 본 발명은 이에 제한되지 않고, 동일 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 단백질을 코딩할 수 있는 한, 서열번호 5 또는 6의 염기서열과 실질적으로 동일한 다른 염기서열을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자에 의해 코딩될 수도 있다. 이러한 핵산 분자의 서열은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA(mRNA)분자일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편, 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

상기 재조합 발현벡터의 제작 시에는, 상기 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(inhancer) 등과 같은 발현조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.

본 발명의 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파이지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 발현벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 상기 시그널 서열에는 숙주가 에쉐리키아속(Escherichia sp.)균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속(Bacillus sp.)균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모(yeast)인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널 서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 본 발명의 발현 벡터는 관심 단백질인 에스터라제가 숙주세포에서 발현하면 그 활성을 나타내게 되므로, 숙주세포의 배양 배지에 트리뷰티린 등의 에스터라제 기질을 첨가함으로써, 별도의 선택마커 없이도 형질전환된 숙주세포의 선별이 가능하도록 할 수 있다.

또한, 상기 재조합 발현벡터는 발현물의 정제를 용이하게 하기 위한 서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 본 발명의 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 유전자에 작동 가능하도록 분리정제용 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 연결될 수 있다. 이때, 상기 분리정제용 태그는 GST, poly-Arg, FLAG, 히스티딘-택(His-tag) 및 c-myc 등이 단독으로 사용되거나 어느 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적 실시예에서는 히스티딘-택을 C-말단에 위치시켜 니켈-엔티에이(Ni-NTA, Ni-nitriloteiacetic acid, Qiagen, Germany) 컬럼을 이용하여 발현된 에스터라제를 정제하였다.

더 나아가, 본 발명의 재조합 발현벡터의 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 유전자와 분리정제용 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 단백질 절단효소 인식부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 연결될 수 있다. 본 발명의 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편은 생물의학과 정밀화학 분야에서 생체 촉매로 유용하게 활용되는 단백질로써, 정제용 태그에 의해 기능이 저하될 수 있으므로 제거되는 것이 바람직하다. 이때, 상기 단백질 절단효소 인식부위는 Xa 인자 인식부위, 엔테로키나제 인식부위, 제네나제(Genenase) I 인식부위 또는 퓨린(Furin) 인식부위가 단독으로 사용되거나 어느 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수 있다.

발명의 실시태양에서, 상기 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 유전자는 제한효소 부위를 통해 클로닝될 수 있고, 단백질 절단효소 인식부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 사용된 경우에는 상기 폴리뉴클레오티드와 틀이 맞도록(in frame) 연결되어, 상기 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편 분비 후 단백질 절단효소로 절단 시, 원래 형태의 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편이 생산될 수 있도록 할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편, 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터가 숙주세포에 형질 도입된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에 따른 상기 재조합 발현벡터를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 효모 세포 등에 형질전환시킨 후, 형질전환된 숙주세포를 배양함으로써 본 발명에 따른 신규 에스터라제를 대량 생산할 수 있다. 숙주세포의 종류에 따른 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 통상의 기술자에게 알려진 공지 기술로부터 당업자가 용이하게 선택할 수 있다. 바람직하게, 상기 숙주세포는 대장균이며, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 신규 에스터라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제작하고, 이를 대장균에 형질전환시킨 후, 상기 형질전환체로부터 발현된 에스터라제는 트리뷰티린을 효과적으로 분해하여 우수한 에스터라제 활성을 나타냄을 확인하였다.

아울러, 1) 본 발명의 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;

상기 본 발명의 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 N-말단에는 분리정제용 태그를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 단백질 절단효소 인식부위가 추가로 연결될 수 있고, 이로 인해 재조합 에스터라제의 정제 또는 원래 형태의 에스터라제의 수득이 가능할 수 있다. 즉, 재조합 에스터라제를 분리정제용 태그를 이용하여 정제한 후, 상기 단백질 절단효소 인식부위를 절단할 수 있는 단백질 절단효소를 처리하는 단계를 추가로 포함함으로써 원래 형태의 에스터라제를 수득할 수 있다.

본 발명의 에스터라제는 기질 특이성 및 광학활성 특이 등의 독특한 특성이 있어 여러 가지 생리 활성 키랄 의약품을 개발하는데 그 용도가 주목받고 있다. 이러한 광학활성 의약품 생산에 유용한 키랄 화합물의 생산은 의약산업의 경쟁력 확보와 국민 건강 증진에 매우 큰 영향력을 가지는 과제로 관심을 모으고 있다. 상기 정밀화학품은 특히 생리 활성 키랄 의약품의 의약품일 수 있고, 이때 효소의 광학활성을 증가시키기 위한 효소의 화학적 변형, 효소정제, 유기용매 처리, 반응조건 선택, 반응 용매 설계 등의 다양한 기술을 응용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 메타게놈 라이브러리 구축

제주도(오름, 한림항, 용두암, 천지연 폭포, 한라산 영실), 목재폐기장, 주유소에서 채취한 토양 시료 5 g을 50 ㎍/㎖의 프로테이나제(proteinase) K를 포함하는 동일부피의 DNA 추출용 완충액[100 mM 트리즈마 완충액(Tris-HCl, pH 8.0, sigma, 미국) ; 100 mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid, sigma, USA); 100 mM 인산 나트륨 완충액(sodium phosphate, pH 8.0,sigma, USA); 1.5 M 염화나트륨(NaCl, junsei, 일본); 1%(w/v) CTAB(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,sigma, 미국)]에 현탁시킨 후, 37℃ 진탕배양기에서 100 rpm으로 30분간 흔든 후, 음이온 계면활성제(sodium dodecyl sulfate, SDS, sigma, USA)를 최종 2%(v/v)가 되게 첨가하여 65℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후, 원심분리를 통해 획득한 상등액에 동일 부피의 클로로포름/이소아밀 알코올(phenol/chloroform/isoamylalcohol) (24:1) 혼합액을 첨가하여 추출하였다. 원심분리하여 획득한 상등액에 0.6배의 이소프로판올(isopropanol)을 첨가하여 DNA를 침전 회수하였다. 70% 에탄올로 세척 후 DNA 침전물을 완전히 건조시켜 멸균수에 녹인 후, PFGE(pulse-field gel electrophoresis, Bio-Rad, 미국)를 이용하여 DNA의 사이즈 분포를 확인하였다. 이 후 DNA 순수분리를 위해 1% 저온융해 아가로즈(Low-melting agarose)에 전기영동하고 Gelase(Epicentre, 미국)를 사용하여 겔 용출을 수행한 후 양말단 보수효소를 이용하여 양말단을 보수하였다. 순수분리 후 양말단이 보수된 DNA를 EpiFOS fosmid 라이브러리 제작 키트(Epicentre, 미국)를 사용하여 메타게놈 라이브러리를 구축하였다.

라이브러리의 질을 검사하기 위해, 형질전환체들을 무작위적으로 선택하여 재조합 플라스미드를 추출하여 제한효소 처리한 후 전기영동으로 확인한 결과, 모두 재조합 플라스미드가 포함되어 있었으며, 삽입된 메타게놈의 평균 크기는 35 kb였다.

<실시예 2> 메타게놈 라이브러리에서 에스터라제 활성을 가진 재조합 플라스미드의 1차 탐색 및 분리

상기 <실시예 1>에서 수득한 메타게놈 라이브러리 8개(총 92,400클론, 표 1)및 마이크로뱅크에서 자원 분양받은 북극기지연안퇴적물로 만든 메타게놈 라이브러리(총 60,000클론, 표 1)로부터 저온성 에스터라제(esterases) 유전자를 탐색하기 위해 0.8%(v/v) 트리뷰티린(Tri-butyrin) 에멀젼이 첨가된 영양고체배지(1%(w/v) 트립톤(trypton), 0.5%(w/v) 이스트 추출물(yeast extract), 0.5%(w/v) 염화나트륨(NaCl), 2%(w/v) 한천(agar))에 도말하여 37℃에서 배양한 후 4℃인 냉장고에서 5일간 보관하였다. 에스터라제는 트리뷰티린을 분해하므로, 저온에서 트리뷰티린이 분해되어 투명환을 형성하는 분해능이 우수한 콜로니를 총 140개 선별하였다(북극기지연안퇴적물 라이브러리;M10 121개, 주유소 라이브러리;GS 13개, 제주도 한림항 라이브러리;JH 2개, 제주도 한라산 영실 라이브러리; HY 1개, 제주도 용두암 마라도 라이브러리; YM 3개).

라이브러리 이름	고유번호	채취장소	플라스미드	DNA 사이즈	총 클론수	출처
M10	G208312~ G208335	북극기지연안퇴적물	Fosmid	35 kb	60,000	마이크로뱅크
JO	.	제주도 오름			4,800	제작
JH	.	제주도 한림항			30,000
YM	.	제주도 용두암,마라도			17,600
CP	.	제주도 천지연 폭포			1,000
HY	.	제주도 한라산 영실			10,500
WD	.	목재 폐기장			3,600
LI	.	유류			2,800
GS	.	주유소			22,100

< 실시예 3> 토양 메타게놈으로부터 분리한 저온성 에스터라제의 특성 조사를 통한 2차 탐색 및 분리

<3-1> 수용성 단백질 용액 준비

상기 <실시예 2>에서 분리한 저온성 에스터라제 활성을 가지는 140개 콜로니를 20 ml의 영양액체배지(1%(w/v) 트립톤(trypton), 0.5%(w/v) 이스트 추출물(yeast extract), 0.5%(w/v) 염화나트륨(NaCl))에 접종한 후 37 ℃에서 배양하였다. 배양된 세포를 원심분리한 후(3000rpm, 15분), 50 mM 트리즈마 완충액(Tris-HCl, pH 8.0) 500 ㎕를 넣고, 초음파 파쇄기로 세포를 파쇄하였였다. 이때, 세포파쇄는 20% 세기, 파쇄 1초 및 정지 2초 조건으로 2분간 2번 진행하였다(초음파 파쇄기;Sonics & materials 사, 미국). 이 후 파쇄한 세포를 14,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 상등액만 얻어 수용성 단백질을 얻었다.

<3-2> 효소활성측정을 통한 에스터라제 2차 탐색

상기 <실시예 2>에서 분리한 저온성 에스터라제 활성을 가지는 140개의 콜로니의 온도에 따른 효소활성 측정을 통해 저온 특이성 에스터라제의 2차 탐색을 하였다. 효소활성 측정을 위한 반응액은 10 mM 파라-니트로페닐 뷰티레이트(p-nitrophenyl ester)기질 10 ㎕, 에탄올 40 ㎕, 50 mM 트리즈마 완충액(Tris-HCl, pH8.0) 940 ㎕, 및 상기 <3-1>의 방법으로 준비된 수용성 단백질용액 10 ㎕을 첨가하여 20분간 반응시킨 후, 기질에서 분해되어 나오는 파라-니트로페놀(p-nitrophenol)을 405 nm에서의 흡광도 증가율로 측정하였다. 1 unit(U)은 분당 1μmol의 파라-니트로페놀을 가수분해하여 생산할 수 있는 효소의 양으로 정의하였다.

<3-3> 온도에 대한 에스터라제의 특성

상기 <실시예 2>에서 수득한 140개 콜로니를 대상으로 에스터라제 활성에 미치는 온도의 영향을 조사하기 위하여 10℃, 40℃에서 각각 파라-니트로페닐 실험을 진행하였다. 140개 콜로니의 온도에 따른 활성은 표 2에 나타내었다. 실험 결과 10℃에서의 활성이 40℃에서의 활성과 유사하거나 더 높은 콜로니 14개를 선별하였다(JH10 #1, YM #1~3, GS7 #3, M10-5 #7, M10-6 #7,#15,#62, #66, M10-18 #4,#8, M10-19 #2, M10-21 #5). 선별된 14개 콜로니의 온도 활성을 다시 한번 확인하고, 우수한 저온성 에스터라제를 선별하기 위하여, 5℃, 10℃, 20℃, 30℃, 40℃ 및 50℃에서 각각 파라-니트로페닐 실험을 진행하였다(표 3, 2번 실험 진행 후 평균값을 상대 활성 값(%)으로 나타내었다). 실험결과 30℃ 이상보다 5℃ ~ 20℃에서 활성이 더 높거나 비슷한 콜로니 2개(M10-5 #7;도 1, M10-21 #5;도 1)를 선별하였다.

채취장소	Library name	candidate no.	pNP-butyrate assay
채취장소	Library name	candidate no.	10℃(O.D.₄₀₅)	Unit/ml (10 ℃)	40℃(O.D.₄₀₅)	Unit/ml (40 ℃)	10℃/40 ℃ (O.D.값)
제주도 한림항	JH-7	#1	0.41	0.1	0.83	0.2	0.50
제주도 한림항	JH-10	#1	1.64	0.5	1.40	0.4	1.18
제주도 용두암, 마라도	YM	#1	1.60	0.5	1.57	0.5	1.02
	YM	#2	1.71	0.5	1.59	0.5	1.08
	YM	#3	1.67	0.5	1.50	0.4	1.12
주유소	GS-2	#2	0.43	0.1	0.96	0.3	0.45
	GS-2	#3	0.45	0.1	0.82	0.2	0.55
	GS-2	#5	0.31	0.1	0.66	0.2	0.46
	GS-6	#1	0.36	0.1	0.89	0.3	0.41
	GS-6	#2	0.45	0.1	0.98	0.3	0.46
	GS-7	#1	0.40	0.1	0.92	0.3	0.43
	GS-7	#2	0.38	0.1	0.95	0.3	0.40
	GS-7	#3	1.62	0.5	1.61	0.5	1.01
	GS-12	#1	0.45	0.1	0.95	0.3	0.47
	GS-12	#2	0.36	0.1	0.88	0.3	0.41
	GS-12	#3	0.49	0.1	0.99	0.3	0.50
	GS-12	#4	0.40	0.1	0.93	0.3	0.43
	GS-12	#5	0.64	0.2	1.28	0.4	0.50
제주도 한라산영실	HY-5	#1	0.56	0.2	1.26	0.4	0.44
북극기지 연안퇴적물	M10-1	A #1	0.28	0.1	0.72	0.2	0.39
	M10-1	A #2	0.29	0.1	0.76	0.2	0.38
	M10-1	B #5	0.31	0.1	0.81	0.2	0.39
	M10-1	B #6	0.45	0.1	0.96	0.3	0.47
	M10-1	B #7	0.46	0.1	0.81	0.2	0.56
	M10-2	#1	0.37	0.1	0.79	0.2	0.47
	M10-4	A #1	0.54	0.2	1.04	0.3	0.52
	M10-4	A #2	0.41	0.1	0.80	0.2	0.51
	M10-4	B #3	0.39	0.1	0.86	0.2	0.45
	M10-4	B #4	0.26	0.1	0.59	0.2	0.44
	M10-5	#3	0.29	0.1	0.80	0.2	0.36
	M10-5	#7	1.10	0.3	1.21	0.4	0.91
	M10-5	#8	0.64	0.2	0.99	0.3	0.65
	M10-5	#9	0.54	0.2	0.97	0.3	0.55
	M10-6	#1	0.36	0.1	0.75	0.2	0.48
	M10-6	#2	0.38	0.1	0.73	0.2	0.52
	M10-6	#3	0.37	0.1	0.79	0.2	0.47
	M10-6	#4	0.37	0.1	0.74	0.2	0.50
	M10-6	#6	0.36	0.1	0.82	0.2	0.44
	M10-6	#7	1.66	0.5	1.48	0.4	1.12
	M10-6	#8	0.37	0.1	0.76	0.2	0.49
	M10-6	#9	0.24	0.1	0.60	0.2	0.40
	M10-6	#10	0.48	0.1	0.99	0.3	0.48
	M10-6	#11	0.43	0.1	0.88	0.3	0.49
	M10-6	#12	0.31	0.1	0.83	0.2	0.38
	M10-6	#13	0.35	0.1	0.84	0.2	0.42
	M10-6	#14	0.36	0.1	0.84	0.2	0.43
	M10-6	#15	0.79	0.2	0.80	0.2	0.99
	M10-6	#16	0.37	0.1	0.85	0.2	0.44
	M10-6	#19	0.35	0.1	0.89	0.3	0.39
	M10-6	#20	0.34	0.1	0.81	0.2	0.42
	M10-6	#21	0.36	0.1	0.84	0.2	0.43
	M10-6	#22	0.37	0.1	0.81	0.2	0.45
	M10-6	#24	0.39	0.1	0.83	0.2	0.47
	M10-6	#25	0.34	0.1	0.84	0.2	0.41
	M10-6	#26	0.42	0.1	0.88	0.3	0.48
	M10-6	#27	0.90	0.3	1.20	0.3	0.75
	M10-6	#28	0.35	0.1	0.83	0.2	0.42
	M10-6	#30	0.85	0.2	1.08	0.3	0.79
	M10-6	#31	0.37	0.1	0.82	0.2	0.45
	M10-6	#32	0.55	0.2	0.92	0.3	0.59
	M10-6	#34	0.30	0.1	0.68	0.2	0.44
	M10-6	#39	0.28	0.1	0.81	0.2	0.35
	M10-6	#42	0.34	0.1	0.87	0.3	0.39
	M10-6	#43	0.29	0.1	0.82	0.2	0.35
	M10-6	#44	0.33	0.1	0.86	0.2	0.38
	M10-6	#46	0.31	0.1	0.82	0.2	0.38
	M10-6	#48	0.38	0.1	0.88	0.3	0.43
	M10-6	#50	0.37	0.1	0.87	0.3	0.43
	M10-6	#51	0.35	0.1	0.83	0.2	0.41
	M10-6	#52	0.18	0.1	0.64	0.2	0.28
	M10-6	#53	0.38	0.1	0.88	0.3	0.43
	M10-6	#54	0.31	0.1	0.83	0.2	0.38
	M10-6	#56	0.35	0.1	0.83	0.2	0.43
	M10-6	#57	0.37	0.1	0.85	0.2	0.43
	M10-6	#58	0.42	0.1	0.91	0.3	0.46
	M10-6	#59	0.36	0.1	0.84	0.2	0.43
	M10-6	#60	0.33	0.1	0.83	0.2	0.40
	M10-6	#62	1.66	0.5	1.44	0.4	1.15
	M10-6	#64	0.38	0.1	0.76	0.2	0.50
	M10-6	#65	1.02	0.3	1.41	0.4	0.72
	M10-6	#66	1.66	0.5	1.50	0.4	1.11
	M10-6	#67	0.50	0.1	1.05	0.3	0.47
	M10-6	#68	0.30	0.1	0.75	0.2	0.40
M10-6	#69	0.38	0.1	0.81	0.2	0.46
M10-7	#1	0.50	0.1	0.90	0.3	0.55
M10-7	#2	0.43	0.1	0.78	0.2	0.55
M10-7	#3	0.43	0.1	0.85	0.2	0.50
M10-7	#11	0.34	0.1	0.73	0.2	0.46
M10-7	#14	0.50	0.1	0.89	0.3	0.55
M10-7	#15	0.47	0.1	0.81	0.2	0.58
M10-7	#16	0.63	0.2	0.89	0.3	0.71
M10-8	#1	0.28	0.1	0.82	0.2	0.34
M10-8	#2	0.19	0.1	0.67	0.2	0.28
M10-8	#6	0.30	0.1	0.81	0.2	0.37
M10-8	#7	0.33	0.1	0.88	0.3	0.38
M10-8	#11	0.39	0.1	0.87	0.3	0.45
M10-9	#2	0.30	0.1	0.82	0.2	0.37
M10-9	#4	0.33	0.1	0.83	0.2	0.40
M10-9	#8	0.31	0.1	0.82	0.2	0.37
M10-10	#9	0.36	0.1	0.84	0.2	0.43
M10-10	#13	0.28	0.1	0.72	0.2	0.39
M10-18	#1	0.35	0.1	0.81	0.2	0.43
M10-18	#2	0.61	0.2	1.19	0.3	0.51
M10-18	#4	1.38	0.4	1.32	0.4	1.04
M10-18	#5	0.96	0.3	1.20	0.3	0.80
M10-18	#6	0.87	0.3	1.15	0.3	0.75
M10-18	#7	0.80	0.2	1.11	0.3	0.73
M10-18	#8	1.46	0.4	1.34	0.4	1.09
M10-19	#1	0.59	0.2	0.72	0.2	0.82
M10-19	#2	1.31	0.4	0.90	0.3	1.46
M10-19	#3	0.47	0.1	0.82	0.2	0.57
M10-19	#5	0.41	0.1	0.77	0.2	0.53
M10-19	#8	0.42	0.1	0.77	0.2	0.55
M10-19	#9	0.41	0.1	0.75	0.2	0.55
M10-19	#10	0.37	0.1	0.77	0.2	0.48
M10-19	#13	0.38	0.1	0.77	0.2	0.49
M10-19	#14	0.41	0.1	0.80	0.2	0.52
M10-21	#1	0.26	0.1	0.66	0.2	0.40
M10-21	#3	0.37	0.1	0.78	0.2	0.48
M10-21	#5	1.21	0.4	0.79	0.2	1.55
M10-21	#7	0.74	0.2	1.11	0.3	0.66
M10-22	#1	0.33	0.1	0.82	0.2	0.40
M10-22	#3	0.26	0.1	0.74	0.2	0.35
M10-22	#6	0.26	0.1	0.78	0.2	0.33
M10-22	#7	0.33	0.1	0.86	0.2	0.39
M10-22	#8	0.43	0.1	0.87	0.3	0.49
M10-23	#3	0.38	0.1	0.92	0.3	0.41
M10-23	#4	0.34	0.1	0.85	0.2	0.40
M10-23	#5	0.58	0.2	1.06	0.3	0.54
M10-23	#7	0.33	0.1	0.85	0.2	0.39
M10-23	#8	0.27	0.1	0.75	0.2	0.35
M10-23	#9	0.32	0.1	0.84	0.2	0.38
M10-23	#11	0.38	0.1	0.93	0.3	0.41
M10-23	#12	0.44	0.1	0.94	0.3	0.46
M10-23	#13	0.40	0.1	0.95	0.3	0.42
M10-23	#14	0.48	0.1	1.06	0.3	0.45
M10-23	#15	0.53	0.2	1.14	0.3	0.47
M10-23	#16	0.49	0.1	1.07	0.3	0.46
M10-23	#17	0.40	0.1	0.85	0.2	0.47
M10-23	#18	0.49	0.1	0.95	0.3	0.51

채취장소	라이브러리 이름	콜로니 번호	온도
채취장소	라이브러리 이름	콜로니 번호	5℃(%)	10℃(%)	20℃(%)	30℃(%)	40℃(%)	50℃(%)
제주도 한림항	JH-10	#1	44	52	68	85	100	88
제주도 용두암, 마라도	YM	#1	26	36	57	84	100	24
	YM	#2	27	38	68	86	100	13
	YM	#1	27	37	65	83	100	17
주유소	GS-7	#3	19	28	50	66	97	100
북극기지 연안퇴적물	M10-5	#7	61	81	100	62	62	37
	M10-6	#7	13	22	49	74	100	29
	M10-6	#15	21	35	51	71	100	78
	M10-6	#62	34	42	63	85	96	100
	M10-6	#66	27	38	63	76	100	98
	M10-18	#4	39	59	80	100	79	35
	M10-18	#8	38	59	81	100	78	35
	M10-19	#2	24	39	62	82	100	85
	M10-21	#5	39	67	100	60	66	39

<실시예 4> 에스터라제 유전자의 클로닝 및 염기서열 분석

상기 <실시예 3>으로부터 최종적으로 분리된 2개의 재조합 플라스미드 pEpiFOS5/M10-5 #7 및 pEpiFOS5/M10-21 #5는 샷건 시퀀싱(shot-gun sequencing) 방법을 이용하여 염기서열을 분석하였다.

<4-1> 에스터라제 유전자의 클로닝

pEpiFOS5/M10-5 #7 및 pEpiFOS5/M10-21 #5는 BamHI, EcoRI, EcoRV, HindIII 효소를 이용하여 절단하고, 펄스장 겔전기영동(pulsed-field gel electrophoresis; PFGE)으로 확인한 후, BamHI 제한 효소로 절단한 다음, 포스파타제(calf intestinal phosphatase, TaKaRa, japan)를 처리한 pUC19 벡터(Novagen, USA)에 삽입시킨 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰다. 상기 형질전환 균주를 엠피실린(ampicillin)이 첨가된 트리뷰티린 영양고체배지(1% 트립톤, 0.5% 효모추출액, 0.5% NaCl, 0.8% 트리뷰티린, 2% 한천)에 도말하고, 37℃에서 24시간 동안 배양, 4℃에서 5일간 보관한 후 트리뷰티린을 분해하여 투명환을 형성하는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니를 배양하여 플라스미드를 분리한 결과 M10-5 #7은 서열번호 1로 기재되는 12058bp의 염기서열로 구성되는 삽입체(insert DNA)를 포함하는 플라스미드이고, M10-21 #5는 서열번호 2로 기재되는 4242bp의 염기서열로 구성되는 삽입체(insert DNA)를 포함한 플라스미드를 확인하였다.

<4-2> 에스터라제 유전자의 염기서열 분석

실시예 <4-1>에서 수득한 상기 염기 서열은 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 ORF finder(www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/ gorf.html)를 이용하여 전사해독 프레임(open reading frame, ORF)을 동정하였고, 블라스트엑스(BlastX; www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)를 이용하여 전사해독프레임의 기능을 예측하였다. M10-5#7 및 M10-21#5의 전사해독 프레임 동정과 기능예측 결과를 표4에 나타내었다.

그 결과, M10-5#7은 서열번호 5로 기재되는 1188개의 염기서열로 구성되고 서열번호 3으로 기재되는 396개의 아미노산으로 이루어지며, M10-21#5는 서열번호 6으로 기재되는 1224개의 염기서열로 구성되고 서열번호 4로 기재되는 408개의 아미노산을 갖는 베타 락타메이즈와 유사한 에스터라제의 ORF를 찾을 수 있었다. 상기 ORF는 에스터라제 단백질 코딩 영역으로 예상되며, M10-5 #7의 에스터라제는 EstM-N1(서열번호: 3), M10-21 #5의 에스터라제는 EstM-N2(서열번호: 4)로 명명하였다.

<4-3> 신규 에스터라제 유전자의 상동성 분석

신규 에스터라제의 아미노산 서열을 블라스트(BLAST) 프로그램을 이용하여 GenBank 및 SWISSPROT에 있는 아미노산 서열과 비교 분석하였다.

그 결과, 본 발명의 2가지 유전자중 EstM-N1의 유전자는 Geodermatophilus obscurus DSM 43160의 베타 락타메이즈(Beta-lactamase) 와 가장 높은 유사성을 나타내었으며, 이전에 보고된 베타 락타메이즈와 39~43%정도의 상도성을 보이고, 리파제/에스터라제와는 37%의 상동성을 보이고 있었다(표 4). 이 유전자는 리파제의 글리신-X-세린-X-글리신(Gly-X-Ser-X-Gly)의 공통서열(consensus sequence)대신 에스터라제 패밀리8(Family VIII)의 공통서열인 세린-X-X-라이신(Ser-X-X-Lys)을 103번째 메티오닌 잔기(Met), 104번째 트레오닌 잔기(Thr)로 이루어진 보존된 특이적 세작용기 촉매(catalytic triad)를 갖고 있으며, 이는 EstM-N1과 유사한 단백질에서도 모두 동일하게 보존되고 있었다(도 3 및 표 5). 아미노산 서열에 따라 분류된 8개 에스터라제 패밀리(family)에 속하는 에스터라제 아미노산 서열과 EstM-N1의 아미노산 서열을 이용하여 계통발생트리(phylogenetic tree)를 구축하였다(도 4). 따라서, 본 발명의 EstM-N1와 유사한 에스터라제 효소들은 에스터라제 패밀리 8(Family VIII)에 가까운 에스터라제임을 확인하였다. 또한, EstM-N2의 유전자는 Congregibater litoralis KT71의 베타 락타메이즈와 가장 높은 유사성을 나타내었다. 이 유전자는 EstM-N1과 같이 에스터라제 패밀리8(Family VIII)의 공통서열인 세린-X-X-라이신(Ser-X-X-Lys)을 107번째 발린잔기(Val), 108번째 세린잔기(Ser)로 이루어진 보존된 특이적 세작용기 촉매를 갖고 있었으며, 이는 EstM-N2과 유사한 단백질에서도 모두 동일하게 보존되고 있었다(도 6 및 표 6). 에스터라제의 8개 패밀리의 아미노산 서열을 이용하여 계통발생트리(phylogenetic tree)를 구축하였다(도 7). 그 결과, 에스터라제 패밀리 8에 매우 가까운 것을 확인할 수 있었다.

따라서, EstM-N1과 EstM-N2는 베타 락타메이즈 아미노산 서열과 유사하면서 에스터라제 활성을 갖는 유전자인 것을 확인할 수 있었다. 이를 계통학적으로 확인하기 위해 패밀리 8에 속하는 에스터라제 5개(Est-Ag; Arthrobacter globiformis; accession no. AAA99492, Est-An; Arthrobacter nitroguajacolicus;accession no. CAD61039, EstB B; Gladioli; accession no. AAF59826, Est-Sc; Streptomyces chrysomallus; accession no. CAA78842, EstC-p: Pseudomonas fluorescens; accession no. AAC60471.2, Est-C; uncultured bacterium; accession no. ACH88047.1)와 클래스 C 베타 락타메이즈 1개(Lac-2 ; E.coli; accession no. X74512), 페니실린 결합단백질 2개(PBP-1; Streptomyces R61 ;accession no. P15555, PBP-2; B. cereus; accession no. CAA09676)를 이용하여 계통발생트리(Phylogenetic tree)를 구축한 결과(도 8), EstM-N1과 EstM-N2는 에스터라제 패밀리 8에 포함되고 있는 것을 알 수 있었다. EstM-N1 및 EstM-N2와 유사한 서열의 에스터라제 그리고 에스터라제 패밀리 8에서 보존된 아미노산 서열(세린-X-X-라이신)의 상동성 분석을 도 8에 나타내었다.

이름	삽입체 사이즈 (염기수)	전사해독프레임의 분석
		전사해독프레임 (ORF)의 수		사이즈 (염기수)	전사해독프레임의 기능 (블라스트엑스 결과)	보존된 모티프
M10-5 #7	12058	3	ORF1	1188	>ref \| YP _003408918.1\|beta-lactamase [Geodermatophilus obscurus DSM 43160] Length= 418 Score = 286 bits(731), Expect = 5e-75,Method: Compositional matrix adjust. Identities = 167/399 (41%), Positives = 229/399 (57%), Gaps = 11/399 (2%)	β-lactamase superfamily
			ORF2	1161	>gb \| AAB04939 .1\| threonyl-tRNA synthetase [Homo sapiens] Length=712 Score = 36.2 bits (82), Expect = 5.4, Method: Compositional matrix adjust. Identities = 21/73 (28%), Positives = 33/73 (45%), Gaps = 7/73 (9%)	X
			ORF3	1017	>ref \| YP _551121.1\| Fis family transcriptional regulator [Polaromonas sp. JS666] Length=386 Score = 544 bits (1402), Expect = 6e-153, Method: Compositional matrix adjust. Identities = 271/386 (70%), Positives = 310/386 (80%), Gaps = 0/386 (0%)	rve superfamily
M10-21 #5	4242	2	ORF1	1224	>ref \| ZP _01104429.1\|Beta-lactamase [Congregibacter litoral- is KT71] Length=427 Score = 521 bits (1343), Expect = 4e-146, Method: Compositional matrix adjust. Identities = 245/404 (60%), Positives = 306/404 (75%), Gaps = 0/404 (0%)	β-lactamase superfamily
			ORF2	1635	>ref \| ZP _01447969.1\|Mg-protoporphyrin IX monomethyl ester oxidative cyclase [alpha pro- teobacterium HTCC2255] Length =855 Score = 254 bits (650), Expect = 1e-65, Method: Compositional matrix adjust. Identities = 143/355 (40%), Positives = 205/355 (57%), Gaps = 17/355 (4%)	Radical SAM superfamily/ B12-binding-like superfamily

단백질 명	미생물 소스	GenBank 번호	동일 아미노산 비율/ 유사 아미노산 비율(%)	E-Value
Beta-lactamase	Geodermatophilus obscurus DSM 43160	YP_003408918.1	41/57	5e-75
Beta-lactamase	Hyphomonas neptunium ATCC 15444	YP_761488.1	36/51	3e-58
hypothetical protein SlivT_05346	Streptomyces_lividans_TK24	ZP_05522323.1	37/51	1e-48
lipase/esterase	uncultured bacterium	AAZ32715.1	37/53	1e-55
possible penicillin binding protein	Sulfitobacter sp. EE-36	ZP_00955505.1	34/51	2e-53

단백질 명	미생물 소스	GenBank 번호	동일 아미노산 비율/ 유사 아미노산 비율(%)	E-Value
Beta-lactamase	Congregibacter litoralis KT71	ZP_01104429.1	60/75	5e-146
Beta-lactamase	gamma proteobacterium NOR5-3	ZP_05125932.1	60/75	1e-139
Hypothetical protein CC_3190	Caulobacter crescentus CB15	NP_421984.1	50/69	2e-118
Est2K precursor	uncultured bacterium	ACX51146.1	40/57	9e-73
EstC	uncultured bacterium	ACH88047.1	38/56	6e-72

<실시예 5> 형질전환체의 제조

본 발명의 신규 에스터라제를 대량으로 생산할 수 있는 EstM-N1 및 EstM-N2의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하기 위해, pQE30(Qiagen사, 독일)의 제한효소 BamHI과 SacI부위에 도면 2에 기재된 유전자를 클로닝하여 pQE30/EstM-N1을 제조하였고, 제한효소 BamHI 부위에 도면 5에 기재된 유전자를 클로닝하여 pQE30/EstM-N2를 제조하였다.

메타게놈 라이브러리부터 탐색하여 얻은 pEpiFOS5/EstM-N1 및 pEpiFOS5/EstM-N2를 주형 DNA로 하고, EstM-N1은 합성된 서열번호: 7 및 서열번호: 8로 기재되고, 각각 BamHI과 SacI의 제한효소 절단부위를 갖고, EstM-N2는 서열번호: 9 및 서열번호: 10으로 기재된, 각각 BamHI의 제한효소 절단부위를 가지는 프라이머쌍을 사용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다.

서열번호 7 : 5‘-GGATCCATCATGAACAATTTAAACACACGC-3’(BamHI 제한효소 절단부위 포함)

서열번호 8 : 5‘-GAGCTCCATACTATGCCCGAGCATCGCATAG-3’(SacI 제한효소 절단부위 포함)

서열번호 9 : 5‘-GGATCCATGTTGGAGCTTGTATCGCCG -3’(BamHI 제한효소 절단부위 포함)

서열번호 10 : 5‘-GGATCCCTATTCACGCAGCGCTGCGTAGAT-3’(BamHI 제한효소 절단부위 포함)

PCR은 94℃에서 5분, 58℃에서 1분, 72℃에서 1분 50초로 구성되는 사이클로 30회 반복하여 실시하였다. 상기 PCR 산물을 정제하여 EstM-N1은 BamHI과 SacI으로, EstM-N2는 BamHI으로 절단한 후, 동일한 제한효소와 포스파타제(Calf intestinal phosphatase)를 처리한 T5프로모터와 판독신호가 내재되어 있는 발현용 벡터 pQE30(Qiagen, 독일)에 각 유전자를 클로닝하고, 이를 대장균(JM109, RBC사, 대만)에 형질전환시켜 대장균 JM109-pQE30/EstM-N1, JM109-pQE30/EstM-N2를 제조하였다.

<실시예 6> 에스터라제의 생산

<6-1> 에스터라제의 발현 및 분리 정제

상기 <실시예 5>에서 수득한 대장균 JM109-pQE30/EstM-N1 및 JM109-pQE30/EstM-N2를 엠피실린(ampicillin, 100 ug/ml)이 포함된 액체영양배지에서 600 nm에서의 흡광도가 0.6이 될 때까지 37℃에서 배양한 후, 최종 농도 0.5 mM의 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 배양액에 넣어 18 ℃에서 18시간 동안 추가로 배양하였다. 원심분리를 통해 대장균 JM109-pQE30/EstM-N1 및 JM109-pQE30/EstM-N2를 회수하여, IMAC 파쇄용액[300 mM KCl, 50 mM KH2PO4, 5 mM 이미다졸(imidazole), pH8.0](Bio-rad사, 미국)에 현탁시킨 후, 초음파 분쇄법으로 파쇄하였다. 이를 다시 원심 분리하여 회수한 상층액만을 Profinia 정제기계(Bio-rad사, 미국)에서 IMAC 컬럼(Bio-rad사, 미국)과 Desalting 컬럼(Bio-rad사, 미국)에 가하여 이미다졸(imidazole) 농도구배를 이용하여 에스터라제를 용출시킨 후 투석 농축하였다.

<6-2> 에스터라제의 확인

상기 <6-1>에서 정제한 단백질 농도는 브래드포드 방법(Bio-rad, 미국)을 이용하여 측정하였는데 EstM-N1은 2.8 mg/ml, EstM-N2는 0.4 mg/ml이 나와서 이를 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfatepoly- acrylamide gel electrophoresis)를 수행하였다. 우선, 10%의 폴리아크릴아마이드겔 (Biorad사, 미국)의 월에 정제한 단백질 시료를 로딩하고, 120 V에서 2시간 동안 시료를 전개한 다음 겔을 쿠마시 블루(Cppmassie Brilliant Blue)로 염색한 후 탈색하여 각각의 정제된 단백질을 확인하였다.

그 결과, 도 10에서 나타난 바와 같이 본 발명의 에스터라제는 발현 18시간 후 시료 속 단백질의 분자량이 EstM-N1은 44 KDa, EstM-N2는 45.5 KDa으로 효과적으로 생산되었음을 알 수 있었으며, 이 단백질 밴드가 본 발명의 신규 에스터라제인 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 7> 신규 에스터라제의 특성 조사

상기 실시예<6-1>에서 정제한 에스터라제 EstM-N1 및 EstM-N2의 다양한 탄소길이를 갖는 기질에 대한 특이성, 온도 및 pH 변화에 따른 효소활성, 다양한 금속이온과 계면활성제에 대한 영향을 측정하였다.

<7-1> 다양한 탄소길이에 대한 에스터라제의 특성

다른 길이의 아실 사슬을 가진 파라-나이트로페닐 에스테르(p-Nitrophenyl ester) 과 트리글리세리드 (Triglyceride)에 대해 효소활성을 조사하여 기질 특이성 및 가장 활성이 좋은 기질을 선정하였다. 파라-니트로페닐 에스테르(p-Nitrophenyl ester)기질로는 파라-니트로페닐 아세테이트(p-nitrophenyl acetate, C2), 파라-니트로페닐 부틸레이트(p-nitrophenyl butyrate, C4), 파라-니트로페닐 카프로에이트(p-nitrophenyl caproate, C6), 파라-니트로페닐 카프릴에이트(p-nitrophenyl caprylate, C8), 파라-니트로페닐 카프레이트(p-nitrophenyl caprate, C10), 파라-니트로페닐 로레이트(p-nitrophenyl laurate,C12), 파라-니트로페닐 미리스테이트(p-nitrophenyl myristate, C14), 파라-니트로페닐 팔미테이트(p-nitrophenyl palmitate, C16)를 사용하였다. 파라-나이트로페닐 에스테르 실험은 각 기질을 아세토나이트릴(acetonitrile)에 녹여 스탁(Stock)을 만든 후 50 mM 트리스완충용액 (Tris-HCl, pH8.0)과 에탄올, 파라-나이트로페닐 에스테르 스탁용액을 95:4:1이 되게 섞어서, 파라-나이트로페닐 에스테르의 최종농도가 각각 40 ㎛, 80 ㎛, 100 ㎛, 200 ㎛, 300 ㎛, 400 ㎛ 및 500㎛이 되도록 기질용액을 만든 후, 96 웰 플레이트(96 well plate)에 기질용액 190 ul에 EstM-N1 및 EstM-N2를 10 ul를 넣고, 30℃에서 10분간 1분 간격으로 405 nm에서 O.D.를 측정하였다. 트리글리세리드(Triglyceride)기질로는 트리-아세틴(Triacetin, C2), 트리-부티린(Tributyrin, C4), 트리-카프릴린(Tricaprylin, C8), 트리-팔미틴 (Tripalmitin, C16) 및 트리-올레인 (Triolein, C18)을 사용하여 pH stat으로 활성을 측정하였다. pH stat에 사용된 기질용액은 분산용액(3% 아라빅검, 0.6 M NaCl, 20 mM CaCl2 및 1 mM Sodium taurocholate)에 30 mM로 각 기질을 첨가한 후, 30분간 초음파 파쇄기로 에멀젼화하고, NaOH로 pH 8.0을 맞추어 사용하였다. 활성측정은 30℃에서 기질용액 30 ml에 EstM-N1 효소액 30 ul 및 EstM-N2 효소액 70 ul를 첨가한 후 pH stat을 이용하여 수소이온 농도 8.0이 되도록 첨가되는 NaOH양으로 계산하여 활성을 측정하였다.

EstM-N1에서 파라-나이트로페닐 에스테르(p-Nitrophenyl ester)를 이용하여 기질 특이성을 확인해 본 결과, 표 7와 도 11에서 나타난 바와 같이, 파라-니트로페닐 부틸레이트(p-nitrophenyl butyrate, C4)가 C6, C8에 비해 Km값이 높지만, Kcat/Km이 가장 높게 나타나, 가장 좋은 기질로 선정되었지만, C12이상에서는 활성이 나타나지 않았다. 또한, 트리글리세리드 (Triglyceride)를 이용하여 특이성을 확인해 본 결과, 도 11에서 나타난 바와 같이, 트리-아세틴(Triacetin, C2)에 대한 활성이 가장 높았으며, C4는 C2에 비해 약 50%의 활성이 나타났고, C16, C18에서는 활성이 나타나지 않았다. 파라-나이트로페닐 에스테르(p-Nitrophenyl ester)와 트리글리세리드(Triglyceride)에서의 활성결과를 도 11에 같이 나타내었다. 또한, EstM-N2에서 파라-나이트로페닐 에스테르(p-Nitrophenyl ester)를 이용하여 기질 특이성을 확인해 본 결과, EstM-N1과 같이 파라-니트로페닐 부틸레이트(p-nitrophenyl butyrate, C4)가 다른 기질에 비해 Km값이 높지만, Kcat/Km이 가장 높게 나타나, 가장 좋은 기질로 선정되었다. 그 외 C2 및 C10 이상의 기질에서는 거의 활성이 나타나지 않았다(표8, 도 12). 아울러, 트리글리세리드 (Triglyceride)를 이용하여 특이성을 확인해 본 결과, 도 12에서 나타난 바와 같이, 트리-아세틴 (Triacetin, C2)에 대한 활성이 가장 높았으며, C4는 C2에 비해 약 33%의 활성이 나타났으며, C16, C18에서는 활성이 나타나지 않았다. p-나이트로페닐 에스테르(p-Nitrophenyl ester)와 트리글리세리드 (Triglyceride)에서의 활성결과를 6-3에 같이 나타내었다. 이 결과를 통해 EstM-N1과 EstM-N2는 비슷한 기질 특이성을 가지며, 상대적으로 짧은 아실 사슬을 가진 기질을 더 잘 분해하는 리파제가 아니라 에스터라제임을 알 수 있었다.

<7-2> 열 안정성 및 온도에 대한 에스터라제의 특성

EstM-N1 및 EstM-N2의 최적반응온도 및 열안정성을 알아보기 위해 다음과 같이 실험하였다. 우선, 최적반응온도를 알아보기 위해 상기 실시예 <7-1>에서 알려진 최적의 기질인 파라-니트로페닐 부틸레이트(p-nitrophenyl butyrate, C4)를 기질로 사용하고, 0℃, 10℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 50℃ 및 60℃에서 10분간 반응한 후 각각 O.D.값을 측정하여 온도에 대한 특성을 확인하였다.

그 결과, EstM-N1은 도 13에서 나타난 바와 같이 30℃에서 가장 큰 활성을 나타냈으며, 20℃에서도 30℃와 비교했을 때 약 93%, 25℃에서 약 92%의 높은 활성을 나타냈다. 특히 10℃에서 약 70%, 0℃에서 약 51%의 높은 활성이 나타나 저온에서도 강한 활성을 나타내고 있었다. 반면에 40℃에서 약 45%, 50℃와 60℃에서 8%의 활성을 나타내어 고온에는 약한 활성을 띄는 것을 확인할 수 있었다. 또한, EstM-N2는 20℃에서 가장 큰 활성을 나타냈으며, 25℃와 30℃에서 약 97%의 활성을 띄어 20℃ ~ 30℃에서 가장 활성이 좋은 것을 확인할 수 있었다. 그리고 EstM-N1과 같이 10℃에서 약 67%, 0℃에서 약 45%의 높은 활성이 나타났으며, 40℃에서 약 44%, 50℃와 60℃에서 3%이하의 활성을 나타내어 고온에는 약한 활성을 띄는 것을 확인할 수 있었다(도 15). 상기 결과를 통해 EstM-N1 및 EstM-N2는 새로운 저온성 에스터라제임을 확인할 수 있었다.

또한, 효소액의 열안정성을 확인하기 위하여 0℃, 10℃, 20℃, 30℃, 40℃ 및 50℃에서 효소액을 30분, 60분, 120분 및 150분간 처리한 후 잔존 효소활성을 파라-니트로페닐 부틸레이트(p-nitrophenyl butyrate, C4)를 이용하여 측정하였다.

그 결과, EstM-N1은 150분 처리 후 10℃에서 약 81%, 20℃에서 약 73%정도의 활성을 유지하여, 비교적 안정적이었으나 30℃에서는 30분 후 약 50%로 활성이 떨어졌고, 150분 후에는 거의 활성이 남아있지 않았다. 40℃ 및 50℃에서는 30분 후 약 1 ~ 2%의 활성 밖에 남아있지 않아 30℃ 이상의 온도에서는 효소가 불안정한 것을 확인할 수 있었다(도 13). 또한, EstM-N2에서도 0℃ ~ 20℃에서는 비교적 안정적이었지만 30℃이상의 온도에서 EstM-N1과 비슷하게 활성이 떨어지는 것을 확인할 수 있었다(도 15). 이 결과를 통해 20 ℃의 온도범위에서는 그 활성이 유지되어 안정하지만 30℃ 이상의 온도범위에서는 활성이 유지되지 못하는 것으로 확인할 수 있었다.

<7-3> pH 에 대한 에스터라제의 특성

신규 에스터라제 효소의 최적반응 pH를 알아보기 위하여 pH6 ~ pH10으로 제조된 트리스 완충액을 이용하여 파라-니트로페닐 부틸레이트(p-nitrophenyl butyrate, C4)로 기질용액을 제조한 후 활성을 측정하였다.

그 결과, EstM-N1에서는 pH9에서 가장 높은 활성을 나타내었으며, pH8 ~ pH 10까지는 안정적이지만 pH7에서 약 20%, pH 6에서 약 1%의 활성을 나타내 pH7 이하에서는 활성이 많이 떨어지는 것을 확인할 수 있었다(도 14). 또한, EstM-N2에서도 pH9에서 가장 높은 활성을 나타냈으며, pH7 ~ pH10까지는 비교적 안정적이지만 pH6.0에서 15%의 활성밖에 나타내지 못하였다(도 16).

<7-4> 금속이온 및 계면활성제에 대한 에스터라제의 특성

효소 활성에 대한 금속이온의 영향을 알아보기 위하여 CaCl₂, CoCl₂, MgSO₄, ZnSO₄, NiSO₄, FeSO₄, MnSO₄및 CuSO₄의 금속이온과 EDTA를 1 mM 및 5 mM로 맞춘 후 활성을 확인하였으며, 계면활성제의 영향을 확인하기 위하여 SDS, 트리톤 X-100(Triton X-100) 및 트윈80(Tween 80)을 0.1% 및 1%로 맞추어 활성을 측정하였다.

그 결과, EstM-N1에서 다른 금속이온에 비해 Ca2⁺, CO2⁺, Zn2⁺및 Cu2⁺에서 민감한 모습을 보였고, 계면활성제인 SDS에 의해서 활성이 급격히 저해되었으나, 트윈80 (Tween80)에서는 활성이 증가되었고, 트리톤 X-100(Triton X-100)에서도 안정적인 모습을 볼 수 있었다(도 14). 또한, EstM-N2에서는 1 mM의 금속이온에 대해서는 큰 영향이 없었으나 5 mM의 이온농도에서는 Fe2⁺및Cu2⁺에서 민감한 모습을 보였고, 계면활성제에서는 EstM-N1과 비슷한 활성을 나타내었다(도 16).

EstM-N1의 파라-나이트로페닐 에스테르에 대한 기질 특이성과 동력학적 계수(kinetic parameter)

기질	활성도 (U mg^-1)	Km (umol)	Kcat(S^-1)	Kcat/Km (S^-1umol^-1)	상대활성 (%)
파라-니트로페닐 아세테이트 (C2)	19.14	2619.8	1.5 X 10⁵	56.8	15.7
파라-니트로페닐 부틸레이트 (C4)	151.78	73.6	2.2 X 10⁵	3031.13	100
파라-니트로페닐 카프로에이트 (C6)	29.93	68.9	5.4 X 10⁴	791.10	19.7
파라-니트로페닐 카프릴에이트 (C8)	7.72	21.5	2.1 X 10⁴	972.74	8.6
파라-니트로페닐 카프레이트 (C10)	2.42	401.0	1.5 X 10⁴	38.26	3.2
파라-니트로페닐 로레이트 (C12)	1.07	114.5	1.2 X 10³	10.21	0.7
파라-니트로페닐 미리스테이트 (C14)	0.6	n.d	n.d	n.d	0.004
파라-니트로페닐 팔미테이트 (C16)	0.19	n.d	n.d	n.d	0.001

EstM-N2의 파라-나이트로페닐 에스테르에 대한 기질 특이성과 동력학적 계수

기질	활성도 (U mg^-1)	Km (umol)	Kcat(S^-1)	Kcat/Km (S^-1umol^-1)	상대활성 (%)
파라-니트로페닐 아세테이트 (C2)	0.04	21.59	6.62	0.3	10.4
파라-니트로페닐 부틸레이트 (C4)	0.37	78.0	107.2	1.34	100
파라-니트로페닐 카프로에이트 (C6)	0.2	261.56	94.63	0.36	53.6
파라-니트로페닐 카프릴에이트 (C8)	0.12	89.94	5.56	0.06	33.3
파라-니트로페닐 카프레이트 (C10)	0.03	17.96	2.02	0.11	8.1
파라-니트로페닐 로레이트 (C12)	0.005	n.d	n.d	n.d	0.8
파라-니트로페닐 미리스테이트 (C14)	0.007	n.d	n.d	n.d	1.0
파라-니트로페닐 팔미테이트 (C16)	0.002	n.d	n.d	n.d	0.2

<실시예 8> 나이트로세핀 (Nitrocefin)을 이용한 베타 락타메이즈 (β-lactamase) 활성 확인

본 발명의 EstM-N1 및 EstM-N2의 서열이 클래스 C 베타 락타메이즈(Class C β-lactamase)와 유사하기 때문에 베타 락탐(β-lactam)을 가지고 있는 기질인 나이트로세핀 (Nitrocefin)을 이용하여 베타 락타메이즈의 활성여부를 확인하였다. 실험을 위해 나이트로세핀 (1mM)을 0.1 M 인산버퍼(Phosphate buffer), 1 mM EDTA에 pH 7.0으로 맞춰준 용액에 1/10로 희석하고, 나이트로세핀 포함 버퍼 180 ul에 EstM-N1 및 EstM-N2 (0.4mg) 20 ul를 넣고, 30℃로 맞춰진 마이크로 플레이트 분광광도계(microplate spectrophotometer, Bio-rad, 미국)에서 30분간 반응 후 486 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 양성대조군으로 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 베타 락타메이즈(Sigma, P0389, 미국)를 사용하였다.

그 결과, 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)의 베타 락타메이즈와 비교했을때 상대활성이 EstM-N1은 약 30%, EstM-N1는 약 13%로 나타났다. 이를 통해 EstM-N1 및 EstM-N2는 클래스 C 베타 락타메이즈(Class C β-lactamase)에서 유래한 효소로 베타 락탐계 기질을 인식할 수　있으며, 나이트로세핀 기질의 베타 락탐 링(β-lactam ring)의 아미드결합을 가수분해할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

에스터라제(esterase) 활성을 갖는 하기 a 내지 b 중 어느 하나의 폴리펩티드:
a) 서열번호 5로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드; 및
b) 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
에스터라제(esterase) 활성을 갖는 하기 a 내지 b 중 어느 하나의 폴리펩티드:
a) 서열번호 6으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드; 및
b) 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
제 1항 또는 2항에 있어서, 상기 에스터라제는 활성온도가 0 ~ 20℃ 인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 1항의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제 4항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 2항의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제 6항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6으로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 4항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터.
제 6항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터.
제 8항의 재조합 발현벡터가 숙주세포에 형질 도입된 형질전환체.
제 9항의 재조합 발현벡터가 숙주세포에 형질 도입된 형질전환체.
1) 제 4항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 재조합 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및,
3) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계로 구성되는 재조합 에스터라제의 제조방법.
1) 제 6항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 재조합 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및,
3) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계로 구성되는 재조합 에스터라제의 제조방법.
제 12항 또는 13항에 있어서, 단계 1)의 폴리뉴클레오티드의 N-말단에 분리정제용 태그를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 단백질 절단효소 인식부위가 추가로 연결되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 12항 또는 13항에 있어서, 재조합 에스터라제에 제 14항의 단백질 절단효소 인식부위를 절단할 수 있는 단백질 분해효소를 처리하여 원래 형태의 에스터라제를 수득하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.